龍燕，謝作崧

（1武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072；2廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004）

苯酚是工業(yè)上較為多見的一類污染源，具有毒性大，分布范圍廣的特點，在造紙、印染、制藥、塑料、煉焦等多種工業(yè)領(lǐng)域的產(chǎn)出廢棄物中均有存在［1-6］.目前世界上的多種苯酚污染治理方法中占據(jù)主導(dǎo)地位的有物理法、化學(xué)法和生物降解法，以及這幾種方法相互聯(lián)用的處理技術(shù).而苯酚生物降解方法因其具有綠色、高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，并且還可達(dá)到相關(guān)污染物礦化的目的，因此它在苯酚污染治理行業(yè)中被廣泛應(yīng)用［7］.

圍繞苯酚生物降解已進(jìn)行了大量研究，文獻(xiàn)已報道的用于苯酚降解的微生物種類繁多，如Rhodococcus erythropolis［8］，Pseudomonassp.［8］，Alcaligenessp.［10］，F(xiàn)usariumsp.［11］，Trichosporon cutaneum［12］，Bacillus brevis［13］等.目前已報道的苯酚降解菌大部分對苯酚的耐受濃度較低（低于1000 mg/L），且不同環(huán)境中分離的苯酚降解菌并不具備理想的目標(biāo)環(huán)境適應(yīng)性［14-15］.如果能從目標(biāo)環(huán)境中分離具有高效降解能力的土著優(yōu)勢菌，處理效果會明顯升高.因此，有必要從需治理的目標(biāo)環(huán)境中分離獲得能降解高濃度苯酚的土著菌株，并將擴(kuò)大培養(yǎng)的高濃度苯酚降解土著菌株投入到目標(biāo)環(huán)境中，土著菌對目標(biāo)環(huán)境具有很好的適應(yīng)性，這就使得目標(biāo)環(huán)境中苯酚污染的生物降解治理成為可能.

本文從鋼廠長期受到苯酚污染的土壤中首次分離出目標(biāo)環(huán)境的可降解高濃度苯酚的土著真菌，并進(jìn)行了純化和鑒定，初步了解其苯酚降解生物學(xué)特性，為豐富真菌的苯酚降解研究及目標(biāo)環(huán)境中苯酚污染的生物治理奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用土壤是從湖北省黃石新冶鋼有限公司東鋼廠區(qū)受苯酚污染嚴(yán)重的區(qū)域獲取.

1.2 培養(yǎng)基

MSM培 養(yǎng) 基：KH2PO41 g/L，（NH4）2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L［16］.LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L.YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L.

1.3 高濃度苯酚降解菌的篩選和分離

1.3.1 高濃度苯酚降解菌的馴化和篩選

10 g土壤樣品加入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上震蕩約3 h，讓土壤與水充分混合，接著靜置20到30 min.取50 mL土壤懸液加入盛有含300 mg/L苯酚的100 mL液體無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng).按1∶2接種比例進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每次轉(zhuǎn)接時，培養(yǎng)基中苯酚濃度逐漸增加至300 mg/L.

1.3.2 高濃度苯酚降解菌的分離純化

將馴化培養(yǎng)30 d后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-6、10-8、10-10稀釋度的培養(yǎng)液0.1 mL涂布于300 mg/L苯酚的MSM固體平板上，30℃培養(yǎng)，直至有明顯菌落長出.挑取單菌落繼續(xù)劃線分離純化，將純化后的單菌落進(jìn)行編號和菌種保存.將這些菌種分別接種于含300 mg/L苯酚的LB液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)24 h.每個菌種分別取培養(yǎng)液0.1 mL依次涂布在含500、900、1200、1500、2000 mg/L苯酚的MSM固體平板，30℃培養(yǎng)，能在含苯酚濃度最高的MSM固體平板生長的菌種，即為高濃度苯酚降解菌.

1.4 高濃度苯酚降解菌的鑒定

1.4.1 高濃度苯酚降解菌形態(tài)觀察

將分離純化得到的高濃度苯酚降解菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，顯微鏡觀察其形態(tài).鏡檢初步確定降解菌種類后，稀釋菌液涂布于YEPD平板上，觀察其在YEPD平板上的菌落形態(tài).

1.4.2 高濃度苯酚降解菌分子生物學(xué)鑒定

將菌種接種于含苯酚300 mg/L的YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)24 h，然后收集菌體，提取基因組，測序.得到的28S rDNA序列上傳到NCBI，BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）［19-20］.

1.5 高濃度苯酚降解菌降解特性研究

（1）pH值對菌株降解苯酚影響.配制pH分別為3.0、5.0、6.0和7.0的含苯酚濃度為800 mg/L的MSM培養(yǎng)基［16］，按照4%（V/V）進(jìn)行接種，30℃下培養(yǎng)，在不同的時間點取樣測定苯酚濃度.

（2）溫度對苯酚降解的影響.配制pH為6.0含苯酚濃度為800 mg/L的MSM培養(yǎng)基，按照4%（V/V）進(jìn)行接種，設(shè)定20、25、30、37、45℃為培養(yǎng)溫度，在不同的時間點取樣測定苯酚濃度.

（3）為探究接種量對苯酚的降解影響，配制pH為6含苯酚濃度為800 mg/L的MSM培養(yǎng)基，分別按照2%、4%、6%和8%（V/V）進(jìn)行接種，30℃下培養(yǎng)，在不同的時間點取樣測定苯酚濃度.

苯酚濃度采用高效液相色譜法測定.C18色譜柱，柱箱溫度40℃，流動相60%甲醇，設(shè)定0.5 mL/min流速.樣品用0.22 μm的濾膜過濾處理.

2 實驗結(jié)果

2.1 高濃度苯酚降解菌的分離純化

經(jīng)馴化篩選、純化后分離出一株高濃度苯酚降解菌，苯酚降解濃度可達(dá)1200 mg/L將該菌株編號記為LY500.

2.2 高濃度苯酚降解菌的形態(tài)觀察

菌株LY500在YEPD平板上的生長形態(tài)為乳白色的圓形菌落，菌落表面較為濕潤，容易挑取（圖1（a））.顯微鏡觀察菌體呈橢球形，出芽生殖（圖1（b）），初步判斷為酵母菌.

圖1 菌株LY500在YEPD平板上的生長形態(tài)（a）和顯微觀察結(jié)果（b）Fig.1 Morphology of strain LY500 in YEPD plate（a）and microscopic result of of strain LY500（b）

2.3 高濃度苯酚降解菌的分子生物學(xué)鑒定

菌株LY500的28S rDNA序列長度為607 bp（圖2）.將得到菌株的28S rDNA序列上傳至GenBanK核酸數(shù)據(jù)庫，根據(jù)BLAST比對結(jié)果，用由MEGA-X軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），菌株LY500可初步鑒定為絲孢酵母菌屬Cutaneotrichosporonsp.（曾用名Trichosporonsp.）.

圖2 菌株LY500的28S rDNA序列Fig.2 The 28S rDNA sequence of strain LY500

圖3 菌株LY500的28S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The 28S rDNA phylogenetic tree of strain LY500

2.4 高濃度苯酚降解菌降解特性研究

2.4.1 最適降解溫度

在培養(yǎng)條件因素中，溫度是微生物降解動力學(xué)的重要影響因素，也是影響菌體生長和底物降解活性的主要因素之一.實驗結(jié)果表明（圖4），溫度在20℃到37℃在之間時，菌株LY500均能在15 h內(nèi)將苯酚完全降解，且溫度30℃時，苯酚降解速率相對較快，當(dāng)溫度升高至45℃時，僅能微量降解苯酚.上述研究結(jié)果表明，30℃為菌株LY500的最佳降解溫度，因此將30℃作為后續(xù)實驗的溫度條件.

圖4 溫度對苯酚降解的影響Fig.4 Effect of temperature on phenol degradation

2.4.2 最適降解pH值

各種微生物都有其最適pH值和一定的pH耐受范圍，因為微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，代謝過程中酶的活性均受到環(huán)境pH值的影響，進(jìn)而微生物降解過程也受到環(huán)境pH值的影響.該菌株在起始pH為5.0～7.0時，苯酚降解過程沒有顯著差異，苯酚均能在14 h內(nèi)被完全降解（圖5）.在起始pH為3.0時，僅能微量降解苯酚.以上結(jié)果表明，菌株對pH值環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，在pH為5.0～7.0的范圍內(nèi)，均能快速有效降解初始濃度為800 mg/L的苯酚.

圖5 pH對苯酚降解的影響Fig.5 Effect of pH value on phenol degradation

2.4.3 接種量對苯酚降解的影響

接種量對苯酚的降解影響結(jié)果見圖6.在不同接種量下，菌種延滯期長短接近，基本為6 h左右.菌株在進(jìn)入指數(shù)生長期后，不同接種量下苯酚降解速度差別較大，苯酚降解速度隨著接種量的增加而增加.當(dāng)接種量為2%時，苯酚完全降解需要15 h，當(dāng)接種量為4%時，苯酚完全降解需要14 h，當(dāng)接種量為6%時，苯酚完全降解需要13 h，當(dāng)接種量為8 %時，苯酚降解最快，在10 h完全降解.

圖6 接種量對苯酚降解的影響Fig.6 Effect of the inoculum size on phenol degradation

3 結(jié)論與展望

從鋼廠中長期受到苯酚污染的土壤中首次分離出該目標(biāo)環(huán)境的高濃度苯酚降解土著真菌菌株LY500，經(jīng)初步鑒定屬絲孢酵母菌屬，該菌株苯酚降解濃度可高達(dá)1200 mg/L，高于已有文獻(xiàn)報道的絲孢酵母菌苯酚降解濃度［14-15］.且菌株LY500對溫度和pH值都有很好的環(huán)境適應(yīng)能力，溫度在20℃到37℃之間，pH在5.0～7.0之間，菌株LY500都能在15 h內(nèi)快速降解起始濃度為800 mg/L的苯酚溶液.

絲孢酵母菌在自然界中分布廣泛，對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，具有高濃度苯酚降解能力的絲孢酵母菌在苯酚污染治理中具有重要意義.目前國內(nèi)外微生物苯酚降解的研究主要集中于細(xì)菌，如假單胞菌（Pseudomonassp.）、芽孢桿菌（Bacillussp.）等［16-18］，對于真菌的苯酚降解研究相對較少，后續(xù)會將此高濃度苯酚降解絲孢酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，投加到目標(biāo)環(huán)境中，用于苯酚污染土壤的生物治理.