張 爍 鄭喜群 劉曉蘭 王俊彤

高血壓是引發(fā)冠心病、中風和終末期腎病的主要危險因素[1-2]。據(jù)WHO統(tǒng)計，世界成人高血壓患病率約30%，中國高血壓患病率為17.5%左右[3]。血管緊張素轉換酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE；EC 3.4.15.1)是一種鋅離子金屬羧肽酶，能夠催化血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，而血管緊張素Ⅱ具有收縮血管的作用，導致血壓升高。因此通過抑制血管緊張素轉換酶或阻斷血管緊張素(AT1)受體來調(diào)節(jié)腎素—血管緊張素系統(tǒng)是現(xiàn)階段治療高血壓的主要方式[4]。現(xiàn)在已有很多的降壓藥物，如卡托普利、依那普利等，但長期使用這些合成抑制劑會對人體健康產(chǎn)生負面影響[5-6]。近年來，研究[7-8]發(fā)現(xiàn)食物中的活性肽能夠通過抑制ACE來降低高血壓患者的血壓?；钚噪姆肿恿啃?，易于被人體消化吸收，因此可將食物蛋白質(zhì)發(fā)展成為食源性ACE抑制肽輔助治療高血壓。

豌豆(PisumsativumL.)不僅蛋白含量高(約25%)，還含有豐富的氨基酸。此外，豌豆蛋白的生物價和功效比均高于大豆蛋白。因此，豌豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[9]，可用于制備活性肽。研究擬以豌豆蛋白為原料，采用雙酶協(xié)同酶解法制備豌豆蛋白源ACE抑制肽，以ACE抑制率為指標優(yōu)化工藝條件，并在最佳工藝條件下探究豌豆肽對誘導損傷的EA.hy.926細胞的保護作用，以期為開發(fā)豌豆肽輔助降血壓產(chǎn)品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白粉(蛋白質(zhì)含量為76.07%)：山東健源生物工程股份有限公司；

風味蛋白酶(10 030.42 U/mL)、堿性蛋白酶(246 532.55 U/mL)、復合蛋白酶(321 769.71 U/mL)：南寧東恒華道生物技術有限公司；

α-淀粉酶：3 700 U/g，北京奧博星生物技術責任有限公司；

血管緊張素轉化酶(ACE，1 UNIT)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、二甲基亞砜(DMSO)：美國 Sigma公司；

EA.hy.926細胞：中國科學院上海生科院細胞庫；

血管緊張素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)：北京酷來博科技有限公司；

DMEM高糖液體培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、臺盼藍染色液(0.4%)：美國Gibco公司；

青毒素、鏈霉素：Solarbio公司；

胎牛血清(FBS)：杭州四季青生物工程材料有限公司；

NO試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒及超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

內(nèi)皮素(ET-1)試劑盒:上海酶聯(lián)生物科技有限公司；

其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設備

pH計：FE28型，梅特勒—托利多(上海)儀器設備有限公司；

智能磁力攪拌器：ZNCL-GS型，予華儀器有限責任公司；

紫外可見分光光度計：2J1-0013型，日本HITACHI公司；

酶聯(lián)免疫檢測儀：Cf72-8YW型，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豌豆肽的制備及理化指標測定 制備質(zhì)量濃度為100 mg/mL的豌豆蛋白懸浮液，按m酶∶m豌豆蛋白=1.5∶100分別添加Alcalase堿性蛋白酶(簡寫為A)、Flavourzyme風味蛋白酶(簡寫為F)和Protamex復合蛋白酶(簡寫為P)中的2種酶，協(xié)同酶解，得豌豆肽溶液，反應總時長為6 h，酶解反應過程中每30 min取樣，滅酶、4 500 r/min離心15 min，取其上清液測定水解度、可溶蛋白含量。

(1) 水解度的測定：在豌豆肽水解過程中加入1 mol/L的NaOH保持最適pH并記錄消耗的體積[10]，根據(jù)式(1)計算水解度。

(1)

式中:

H——水解度，%；

VNaOH——反應中消耗的堿體積，mL;

NNaOH——反應中維持 pH 穩(wěn)定時堿當量濃度，mol/L；

α——α-氨基酸解離度;

Mp——反應體系中的蛋白總量，g；

htot——1 g蛋白中肽鍵的克當量數(shù)，7.8。

(2) 可溶蛋白含量的測定：采用Folin-酚法[11]。

1.3.2 ACE抑制率的測定 根據(jù)Cushamn等[12]的方法有所修改，反應在2 mL的 PE 管中進行，取10 μL的樣品水解液，依次加入5 mmol/L HHL溶液40 μL、去離子水50 μL，混勻，37 ℃水浴鍋中預熱10 min，加入10 μL ACE并繼續(xù)水浴30 min。結束后向管中加入140 μL 1 mol/L HCl和750 μL乙酸乙酯(-20 ℃)使反應停止，渦旋振蕩30 s，3 500 r/min離心5 min，取出500 μL酯層，置于80 ℃烘箱中烘干30 min，加入200 μL的去離子水震蕩30 s，得樣品組溶液，測定280 nm處的OD值。對照組不加ACE，其余步驟同上?？瞻捉M用去離子水代替水解液，并在反應開始前加入1 mol/L HCl 140 μL，其余步驟同樣品組。

按式(2)計算ACE抑制率。

(2)

式中：

WACE——ACE抑制率，%；

O1——對照組OD值；

O2——樣品組OD值；

O3——空白組OD值。

1.3.3 酶解條件優(yōu)化 將豌豆肽的蛋白質(zhì)量濃度稀釋至2 mg/mL，測定雙酶不同酶解時間以及雙酶添加順序下豌豆蛋白水解物的ACE抑制率。雙酶協(xié)同酶解最長時間為6 h。分步酶解時間形式為“(2+4、3+3、4+2) h”(例“A 2 h+P 4 h”指先用堿性蛋白酶酶解2 h再加入復合蛋白酶繼續(xù)酶解4 h)，酶解過程中每隔1 h進行取樣測定。

1.3.4 豌豆肽分子量對ACE抑制率的影響 采用優(yōu)化后的最佳條件酶解豌豆蛋白，得到的蛋白水解物4 500 r/min 離心15 min，取上清液。依次選用10，8，5，2.5 kDa的超濾膜進行截留超濾，超濾后的各組分進行冷凍干燥，測定蛋白質(zhì)量濃度，再配制成蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，測定其ACE抑制活性。

1.3.5 豌豆肽分子量對氨基酸組成的影響 超濾后的不同分子量豌豆肽的氨基酸組分測定按GB/T 18246—2000執(zhí)行。

1.3.6 細胞試驗 先將EA.hy.926細胞接種于DMEM完全培養(yǎng)基中，再將培養(yǎng)基放在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，當細胞密度達到80%左右時加入胰酶消化1 min，1 300 r/min離心10 min進行重懸，傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的EA.hy.926細胞分為空白組、模型組、豌豆肽低劑量組(50 μg/mL)、豌豆肽中劑量組(100 μg/mL)、豌豆肽高劑量組(200 μg/mL)和陽性對照組(1.75 μg/mL卡托普利)?？瞻捉M僅加入DMEM完全培養(yǎng)基，模型組加入DMEM完全培養(yǎng)基同步化后加入2.221 μmol/L Ang-Ⅱ溶液刺激12 h，樣品組加入相應濃度的樣品干預24 h后，加入2.221 μmol/L Ang-Ⅱ溶液刺激12 h。

1.3.7 細胞內(nèi)相關含量水平的測定 按1.3.6方法培養(yǎng)細胞，待細胞單層生長面積達到80%后用胰酶消化并加入完全培養(yǎng)基終止，在1 300 r/min條件下離心10 min后進行超聲破碎,得到細胞勻漿及其上清液，按照試劑盒的說明進行內(nèi)皮素(ET-1)ELISA、MDA含量、SOD活力以及NO含量的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021與SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有試驗均設3次以上平行，測定數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。圖表中*表示與模型組相比差異顯著P<0.05，**表示與模型組相比差異極顯著P<0.01；#表示與空白組相比差異顯著P<0.05，##表示與空白組相比差異顯著P<0.01。

2 結果與討論

2.1 酶解條件優(yōu)化

由表1可知，蛋白酶酶解時間對ACE抑制活性影響較大，A酶解2 h的ACE抑制活性基本上優(yōu)于A酶解3 h 和4 h的，在此基礎上，隨著P酶解時間的延長，ACE抑制活性呈先升高后降低的趨勢。在A酶解2 h后P酶解2 h條件下，制備的水解物ACE抑制活性最高，為(96.49±3.45)%；在P酶解3 h后F酶解1 h條件下，酶解效果最好，ACE抑制率為(88.59±4.84)%；A酶解2 h后用F進一步酶解，隨著F酶解時間的延長，ACE抑制活性呈先升高后下降的趨勢，其中以F酶解2 h時效果最好，ACE抑制活性為(89.13±3.26)%。綜上，酶的添加順序及酶解時間對ACE抑制活性有重要的影響。

表1 雙酶酶解條件對ACE抑制率的影響Table 1 Effects of double-enzymolysis conditions on ACE inhibition rate

選擇ACE抑制率較高的酶解條件A 2 h+P 2 h、P 3 h+F 1 h、A 2 h+F 2 h制備豌豆肽并測定水解度和可溶蛋白含量。由表2可知，A 2 h+P 2 h條件下水解度最高，可溶蛋白含量最低，說明酶解效果最好，可能是因為堿性蛋白酶酶解一定時間后蛋白分子結構舒展，暴露更多的肽鍵，有利于后期加入的酶對蛋白進一步酶解，此結果與徐珍珍等[13]采用雙酶制備高活性的大米蛋白肽的結果一致。因此，最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度100 mg/mL，酶底質(zhì)量比1.5∶100，堿性蛋白酶先酶解2 h再復合蛋白酶酶解2 h，此條件下水解物的IC50值為1.141 mg/mL，與已報道的其他食源性ACE抑制肽相比，如α-乳白蛋白肽(IC50為3 130 μmol/L)、刺參蛋白肽(IC50為0.8 mg/mL)、大米蛋白肽(IC50為1.571 mg/mL)[14-16], 豌豆蛋白的雙酶酶解產(chǎn)物具有較強的 ACE抑制活性, 表明豌豆蛋白是制備ACE 抑制肽的良好植物蛋白來源。

2.2 酶解液超濾分級

由表3可知，經(jīng)超濾分級后各組分多肽的ACE抑制活性有較明顯的差異，其中，<2.5 kDa的豌豆肽組分ACE抑制率效果最好，為63.020%，8～10 kDa組分的ACE抑制率最低，可能是由于多肽有很強的表面活性，容易吸附在超濾膜表面，導致未超濾組分的蛋白質(zhì)回收率和生物活性降低，與賈聰?shù)萚17]研究結論芝麻中ACE高活性抑制肽分子質(zhì)量集中在3 kDa以下相似。王曉杰等[18]研究也表明玉米ACE抑制肽的分子質(zhì)量主要集中在6 kDa以下。綜上，相對于大分子多肽，小分子多肽的ACE抑制活性更好。

表2 雙酶協(xié)同酶解的酶解效率與ACE抑制活性的影響Table 2 The effect of double-enzyme synergistic hydrolysis on enzymolysis efficiency and ACE inhibitory activity

2.3 氨基酸組成分析

由表4可知，不同分子量組分的豌豆肽氨基酸組成有差異，個別氨基酸因含量較低在不同分子量組分中未檢測出來。豌豆肽的必需氨基酸占氨基酸總量的30.57%，其中含量較高的為脯氨酸和谷氨酸，其次為天冬氨酸和精氨酸。有研究[19-20]表明，ACE抑制活性與谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的存在以及氨基酸占比有關。

分子量<2.5 kDa的豌豆ACE抑制肽的必需氨基酸含量最高，達到41.14%，其中含量較多的是苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸和酪氨酸，它們屬于ACE抑制肽的C-活動區(qū)域，能有效降低人機體的血壓[21]。因此，由豌豆蛋白制備的ACE抑制肽氨基酸組成均衡，營養(yǎng)價值較高。此外，豌豆ACE抑制肽序列中獨特位置處的非極性氨基酸(如Trp和Arg)可以通過阻止底物與活性位點的結合降低ACE活性[22]。<2.5 kDa肽段的氨基酸中必需氨基酸與非必需氨基酸的比值從超濾前的44.03%上升到了69.89%，疏水性氨基酸占比從超濾前的24.88%上升到了37.23%，由此證明了影響ACE抑制活性的因素不僅與分子量有關，也與氨基酸組成相關。

2.4 ACE抑制肽對Ang-Ⅱ誘導損傷的EA.hy.926細胞的影響

2.4.1 ET-1水平 內(nèi)皮素(Endothelin-1，ET-1)參與大部分心血管疾病的發(fā)病過程，存于內(nèi)皮細胞中[23]。ET-1可以有效地降低一氧化氮合酶水平，從而降低NO水平，維持內(nèi)皮細胞功能的穩(wěn)態(tài)平衡[24]。采用豌豆肽和Captopril對 EA.hy 926 進行處理，用Ang-Ⅱ溶液進行誘導刺激并培養(yǎng)48 h，細胞分泌的ET-1含量如圖1所示。

由圖1可知，模型組的ET-1含量明顯高于空白組，說明在Ang-Ⅱ的刺激下細胞功能發(fā)生了變化，釋放炎癥因子，而豌豆肽劑量組的ET-1含量隨著質(zhì)量濃度的升高逐漸下降，當豌豆肽的質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，ET-1含量達到最低，為62.69 pg/mL(P<0.01)，與李保宏等[25]的研究結果一致。綜上，豌豆肽對EA.hy926細胞分泌ET-1有一定的抑制能力，且多肽濃度越高，抑制效果越好。

表3 豌豆蛋白酶解液超濾分級結果Table 3 Results of ultrafiltration classification of pea protease hydrolysate

表4 不同分子量豌豆肽的氨基酸組成與含量對比Table 4 Comparison of amino acid composition and content of pea peptides with different molecular weights g/100 g

圖1 豌豆肽濃度對損傷細胞ET-1含量的影響Figure 1 The effects of different concentrations of pea peptides on the ET-1 content in damaged cells

2.4.2 MDA和SOD水平 由表5可知，模型組的MDA含量比空白組的高，經(jīng)Captopril和低、中、高劑量豌豆肽處理后，損傷細胞中MDA含量明顯下降，說明損傷細胞的脂質(zhì)過氧化程度得到改善；隨著豌豆肽濃度升高，MDA含量逐漸下降，在200 μg/mL時，MDA含量最低且優(yōu)于Captopril組；低劑量豌豆肽對損傷細胞的SOD含量無明顯影響，而Captopril組、豌豆肽中劑量組和高劑量組的SOD含量高于模型組，說明中高劑量豌豆肽可以增加細胞清除自由基的能力，此結果與郭耀東等[26]的研究結果一致。因此豌豆肽可以改善Ang-Ⅱ誘導損傷的EA.hy.926細胞的氧化應激損傷，維持機體氧化還原的平衡。

2.4.3 NO水平 由圖2可知，模型組上清中的NO含量明顯下降，而NO生成減少可導致內(nèi)皮細胞損傷，說明在Ang-Ⅱ的刺激下細胞血管功能出現(xiàn)障礙。與模型組相比，Captopril組和低、中、高劑量豌豆肽組可以增加NO的生成，且呈濃度依賴性。有研究[27]表明，增加血管壁NO含量有利于改善內(nèi)皮功能。綜上，豌豆肽抑制了Ang-Ⅱ致內(nèi)皮細胞損傷的作用。

表5 豌豆肽對損傷細胞MDA和SOD的影響Table 5 Effect of pea peptides on MDA and SOD in damaged cells

圖2 不同濃度的豌豆肽對損傷細胞NO含量的影響Figure 2 The effect of different concentrations of pea peptides on the NO content in damaged cells

3 結論

以豌豆蛋白為原料，利用堿性蛋白酶與復合蛋白酶兩步酶解法制備豌豆蛋白源ACE抑制肽，在堿性蛋白酶酶解2 h后復合蛋白酶酶解2 h，酶底質(zhì)量比1.5∶100，底物質(zhì)量濃度100 mg/mL的條件下制得的豌豆肽ACE抑制活性最好，IC50值為1.141 mg/mL。小于2.5 kDa的豌豆ACE抑制肽能緩解Ang-Ⅱ?qū)A.hy.926細胞的損傷，顯著降低ET-1、MDA含量，增加SOD和NO含量水平。因此，豌豆ACE抑制肽對Ang-Ⅱ引起的EA.hy.926細胞損傷具有一定的保護作用。下一步將深入研究ACE抑制肽降血壓作用的分子生物學機制。