劉立萍 徐 鵬 雷小紅 王 寧 楊 兵

箬葉是箬竹植物的葉。中國箬竹約有20種以上，主要分布在長江以南地區(qū)[1]，其中闊葉箬竹分布最廣，民間使用也最廣泛[2]。研究[3-4]表明，箬葉具有一定的防腐抑菌功效，是很好的植物源天然防腐抑菌劑來源。

截至目前，國內(nèi)外對箬葉的研究主要關(guān)注其營養(yǎng)物質(zhì)和元素含量[5-7]，以及揮發(fā)油[8]、總黃酮[9-11]、多糖[12]等活性物質(zhì)的提取、分離與測試，其提取物中黃酮類、多糖、生物堿等均具有較好的抑菌殺菌作用[9]。李俊超等[13]研究發(fā)現(xiàn)箬竹葉的提取物對煙草病原真菌鏈格孢菌和煙草疫霉菌菌絲生長均具有抑制效果。孫克奎[12]研究發(fā)現(xiàn)，箬葉多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制效果，對地衣芽孢桿菌也有較明顯的抑制效果。樂薇等[14]和吉瑞冬等[15]研究箬葉總黃酮提取和對細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)、真菌(白色念珠菌、釀酒酵母菌、青霉菌)的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)箬葉總黃酮對細(xì)菌的抑制效果大于對真菌的抑制效果；并且不同提取方法對箬葉總黃酮的抑菌效果有影響，超聲波法比較適合于箬葉總黃酮的提取。何舟等[16]研究了箬葉水提取物和乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)水提取物比乙醇提取物的抑菌作用強(qiáng)。鄧龍興等[17]用菌絲生長速率法比較研究了箬竹葉粗提物及其萃取相對深綠木霉和煙草鏈格孢菌生長率的影響，發(fā)現(xiàn)正丁醇相對深綠木霉的抗菌活性最高，乙酸乙酯相對煙草鏈格孢菌的抗菌活性最高。Sun等[18-19]用95%乙醇對箬葉抗菌成分進(jìn)行提取和分離，發(fā)現(xiàn)有兩種竹葉提取物具有良好的清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等生物功效；同時也對分離得到的化合物進(jìn)行了體外抗菌活性試驗，發(fā)現(xiàn)芹菜素6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)和芹菜素7-O，8-C-二吡喃葡萄糖苷(6)對4株細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌和青枯假單胞菌)均有抑菌活性。這些研究對箬葉提取物抑菌活性和提取方法都比較局限，抑菌試驗方法均為濾紙片法，指示菌未涵蓋銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌。研究擬以常見致病菌(痢疾志賀氏菌和沙門氏菌)和腐敗菌(枯草桿菌和銅綠假單胞菌)為試驗菌，選擇闊葉箬竹葉為試驗材料，研究提取物的抑菌效果，探明箬葉中抑菌成分最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

闊葉箬竹的葉：2021年4月15日采自懷化市洪江區(qū)；

枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis，CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[Pseudomonasaeruginoda(Schroeter)Migula，ATCC9027-1]、痢疾志賀氏菌[Shigelladysenteriae，CMCC(B)51252]和傷寒沙門氏菌[S.typhi，CMCC(B)50071]：-80 ℃保存，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；

抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(高)：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；

慶大霉素國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：批號130326-201716，中國食品藥品檢定研究院；

乙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、氨水：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

冰醋酸：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙酸乙酯：色譜純，天津化學(xué)試劑研究所。

1.2 主要儀器與設(shè)備

中藥材高速粉碎機(jī)：FD-15-T250A型，上海市閔行區(qū)艦艇工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司；

立式滅菌器：LMQ.C-80E型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；

Ⅱ級A2生物安全柜：1374型，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；

超低溫冰箱：DW-HL388型，中科美菱低溫科技股份有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150型，上海金慧科電子有限公司；

超聲清洗機(jī)：9960B型，天津科貝爾光電技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品標(biāo)準(zhǔn)系列制備 按文獻(xiàn)[20]的方法配制0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用于抑菌試驗參比。

1.3.2 試驗菌種復(fù)壯和菌懸液制備 按文獻(xiàn)[20]的方法復(fù)壯試驗菌，制備約1×107CFU/mL的菌懸液用于抑菌試驗。

1.3.3 試驗菌平板的制作 在試驗中，微生物平板表層均勻平鋪了試驗菌的稱為試驗菌平板，平板表層為菌層培養(yǎng)基，下層為底層培養(yǎng)基。

取抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(高pH) 100 mL于200 mL無菌廣口瓶，置于(46±1) ℃水浴，依次接入1 mL菌懸液，混勻，趁熱取5 mL，迅速平鋪到底層培養(yǎng)基平板，冷卻凝固，即得4種不同試驗菌平板，供提取物抑菌試驗使用。

1.3.4 箬葉處理 鮮葉洗凈，50～55 ℃烘干，粉碎，過42目篩，密封。

1.3.5 提取物制備

(1) 不同溶劑提取物：分別稱取9份箬葉粉未10 g于250 mL三角瓶中，依次加入100 mL水、乙酸乙酯、鹽酸溶液(pH 4)、乙酸水溶液(pH 4)、氨水溶液(pH 10)、30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇9種提取溶劑，浸泡24 h，再超聲2次，超聲條件為溫度45 ℃，時間30 min，2次提取液合并，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴50 ℃)，減壓濃縮至10 mL，每毫升提取液相當(dāng)于1 g干樣。

(2) 不同方法提取物：選擇水、60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、鹽酸水溶液(pH 4)、氨水溶液(pH 10) 4種代表性提取溶劑，稱取12份箬葉粉未，每份10 g，分成4組，每種溶劑按液固比10∶1 (mL/g)，分別用超聲輔助法(40 kHz，400 W，45 ℃，30 min)、回流法(60%乙醇回流溫度80 ℃，其他100 ℃)和浸提法(室溫，24 h) 3種方法進(jìn)行提取，提取2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴50 ℃)，減壓濃縮至10 mL。

1.3.6 抑菌試驗 以枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌4種試驗菌為指示菌，總抑菌圈大小為評價指標(biāo)，慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)系列為對照，參照文獻(xiàn)[21]，用牛津杯法開展抑菌試驗。按1.3.3方法制備試驗菌平板，在平板中均勻放置4個無菌牛津杯，在牛津杯中加入0.280 mL試液，試液不得溢出，做兩平行，同時做空白試驗，36.5 ℃培養(yǎng)15～16 h，測定抑菌圈直徑，評價抑菌效果。

1.3.7 單因素試驗 用水作提取溶劑，選擇超聲條件為頻率40 kHz、功率400 W、溫度45 ℃下，單因素為液固比、超聲次數(shù)和超聲時間。固定超聲時間和超聲次數(shù)，研究液固比對提取物抑菌效果的影響；固定液固比和超聲次數(shù)，研究料超聲時間對提取物抑菌效果的影響；固定液固比和超聲時間，研究超聲次數(shù)對提取物抑菌效果的影響。試驗重復(fù)2次。

1.3.8 最佳提取工藝參數(shù)選擇試驗 通過單因素試驗結(jié)果分析，選擇3個合適的因素水平，按L9(33)正交試驗，提取箬葉抑菌提取物，制成含生藥1 g/mL的試液，按1.3.6方法用各提取物做抑菌試驗，量取抑菌圈直徑，比較抑菌效果，找到最佳提取工藝參數(shù)，獲取最佳提取物。

1.3.9 最佳抑菌提取物與對照品標(biāo)準(zhǔn)系列抑菌效果的比較 在最佳提取工藝條件下，提取箬葉提取物進(jìn)行抑菌試驗，試驗重復(fù)5次，計算其變動范圍，用平均值與慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌效果作比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 箬葉抑菌提取物提取溶劑和提取方法的篩選

2.1.1 不同提取溶劑箬葉提取物的抑菌情況 用1.3.6抑菌試驗方法，對1.3.5中不同提取溶劑所獲提取物開展抑菌試驗，結(jié)果見表1和表2。

表1 不同提取溶劑箬葉提取物的抑菌情況(抑菌圈直徑)?Table 1 Bacteriostasis of extract from Indocalamus leaves with different solvents (diameter of bacteriostatic circle) mm

表2 箬葉不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的抑菌情況(抑菌圈直徑)Table 2 Bacteriostasis of different concentrations ethanol extracts from Indocalamus leaves (diameter of bacteriostatic circle) mm

表1和表2結(jié)果顯示，箬葉乙醇提取物的抑菌效果整體較弱，乙酸溶液(pH 4)提取物抑菌效果最好，為81.5 mm,水提取物為66.1 mm，乙酸乙酯提取物為65.4 mm；但是乙酸溶液(pH 4)空白為73.2 mm，乙酸乙酯的空白為34.2 mm，水的空白無抑菌效果，可見，水是最好的提取溶劑。

2.1.2 不同提取方法箬葉提取物的抑菌情況 用水、60%乙醇、pH 4乙酸溶液、pH 10氨水溶液4種代表性提取溶劑分別采用超聲輔助法、回流法和浸提法3種方法進(jìn)行提取，所獲提取物的抑菌效果見表3，慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌作用見表4。

由表3可知，水超聲提取物的抑菌效果最好，超聲法是最好的提取方法。

由表4可知，慶大霉素對4種指示菌抑菌作用顯著，標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌效果曲線方程相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說明在選定的濃度范圍內(nèi)，其對各試驗菌的抑菌效果與濃度呈正相關(guān)性。

表1和表2結(jié)果表明，水提取物抑菌性能優(yōu)于乙醇提取物，與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果一致，雖然指示菌不同，但同樣說明箬葉中水溶性抑菌物質(zhì)比醇溶性抑菌物質(zhì)效果好。箬葉中含有豐富的生物活性成分[19]，其中黃酮類、多糖、生物堿等都有著較強(qiáng)的抑菌殺菌作用[17]。生物活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，極性會有差異，在水中的溶解性也會有差異。黃酮類既有溶于水的，也有溶于醇的；多糖類溶于水，但不是真溶液；萜類物質(zhì)極性中等偏小，微溶于水，易溶于醇，但萜苷類易溶于水；酚酸類為水溶性物質(zhì)；生物堿大部分不溶于水，易溶于醇，但由生物堿生成的鹽極易溶于水。箬葉水提取物抑菌活性優(yōu)于乙醇提取物，可能因為箬葉中含有多種強(qiáng)極性水溶性活性物質(zhì)或者其他活性成分，含中等偏小極性的活性成分相對較少，有待進(jìn)一步對箬葉水提取物化學(xué)成分及其單體開展含量測定和抑菌活性研究。

2.2 提取抑菌活性物單因素試驗

2.2.1 液固比對箬葉提取物抑菌效果的影響 固定超聲時間30 min和超聲次數(shù)1次，選擇液固比分別為4∶1，8∶1，10∶1，12∶1，16∶1，20∶1 (mL/g)，提取物抑菌效果見圖1。

由圖1可知，隨著液固比的增加，提取物的抑菌活性迅速增強(qiáng)，當(dāng)液固比增加到12∶1 (mL/g)后，提取物抑菌活性增強(qiáng)緩慢，因為隨著提取溶劑用量的增加，抑菌物質(zhì)提取率隨之增加，液固比為12∶1 (mL/g)后，活性物質(zhì)大部分已擴(kuò)散到提取溶劑中，再增加提取溶劑用量，提取物抑菌活性增強(qiáng)緩慢。因此，12∶1 (mL/g)是比較適宜的液固比。

表3 3種提取方法箬葉提取物的抑菌情況(抑菌圈直徑)Table 3 Bacteriostasis of the extracts from Indocalamus leaves by three extraction methods (diameter of bacteriostatic circle) mm

表4 慶大霉素對照品標(biāo)準(zhǔn)系列對4種指示菌的抑菌作用(抑菌圈直徑)Table 4 Bacteriostatic effects of gentamicin standard series on 4 indicator bacteria (diameter of bacteriostatic circle)

圖1 液固比對箬葉提取物抑菌效果的影響Figure 1 Effects of liquid-to-material ratio on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

2.2.2 超聲時間對箬葉提取物抑菌效果的影響 固定液固比10∶1 (mL/g)和超聲次數(shù)1次，選擇超聲時間分別為15，25，35，45，55，65 min，提取物抑菌效果見圖2。

圖2 超聲時間對箬葉提取物抑菌效果的影響Figure 2 Effects of ultrasonic time on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

由圖2可知，總體上隨著超聲時間的延長，提取物抑菌活性增強(qiáng)，當(dāng)超聲時間增加到45 min后，提取物抑菌活性趨于平穩(wěn)，說明隨著超聲時間的延長，細(xì)胞內(nèi)抑菌物質(zhì)逐漸溶出。從45 min增加到55 min，提取物對痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌活性有所下降，可能由于受熱時間延長，個別成分變化所致；也可能是試驗誤差所致。從15 min增加到25 min，提取物對痢疾志賀氏菌活性有所下降，因試驗誤差所致。所以，提取時間選擇45 min左右比較合適。

2.2.3 超聲次數(shù)對箬葉提取物抑菌效果的影響 固定液固比10∶1 (mL/g)和超聲時間30 min，選擇超聲次數(shù)分別為1，2，3，4，5，6次，提取物抑菌效果見圖3。

由圖3可知，總體上隨著超聲次數(shù)的增加，提取物的抑菌活性不斷增強(qiáng)，當(dāng)超聲次數(shù)增加到3次后，提取物抑菌活性趨于平穩(wěn)，說明此時抑菌物質(zhì)提取比較充分。但提取物對痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌活性有所下降，超聲次數(shù)增加到5，提取物對傷寒沙門氏菌的活性才有所下降，可能由于超聲次數(shù)增加，受熱時間也增加，個別成分被破壞所致，也可能是試驗誤差所至。為節(jié)約能源，選擇超聲3次比較理想。

圖3 超聲次數(shù)對箬葉提取物抑菌效果的影響Figure 3 Effects of ultrasonic number of times on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

2.3 最佳提取工藝參數(shù)

以水為提取溶劑，選擇表5的因素和水平，按照 L9(33) 開展正交試驗，制備箬葉提取物，用1.3.6方法開展抑菌試驗，分析各條件下所獲提取物的抑菌效果，結(jié)果分析見表6和表7。

由表6可知，影響抑菌物質(zhì)提取效果因素的主次順序為超聲次數(shù)>料液比>超聲時間，最佳提取工藝為固液比16∶1 (mL/g)，超聲次數(shù)4次，超聲時間55 min。由表7可知，超聲次數(shù)是重要的影響因素。

2.4 最佳提取物與對照品標(biāo)準(zhǔn)系列的抑菌情況比較

按最佳工藝參數(shù)，提取箬葉中最佳提取物，用1.3.6方法進(jìn)行抑菌試驗，共試驗5次，同時與對照品標(biāo)準(zhǔn)系列抑菌效果進(jìn)行比較，結(jié)果見表8。

表8結(jié)果顯示，最佳提取物對枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為(16.9±1.54)，(23.8±1.80)，(22.3±1.41)，(17.9±1.13) mm，平均總抑菌圈為80.9 mm，平均抑菌效果相當(dāng)于0.01，>0.05，>0.05，0.03 mg/mL慶大霉素，說明對4種試驗菌的抑菌效果顯著，可作為食品添加劑、化妝品和日用化工原料進(jìn)行開發(fā)和利用，同時，比較表6，參數(shù)A3B2C1條件下的總抑菌圈與此結(jié)果相差不大。

表5 正交試驗的因素和水平Table 5 Factors and levels of the orthogonal test

表6 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental design and results

表7 正交試驗方差分析Table 7 Results of variance analysis of orthogonal test

表8 最佳提取物抑菌試驗結(jié)果統(tǒng)計Table 8 Statistical analysis of the results of bacteriostatic test of the best extract (n=5)

3 結(jié)論

箬葉抑菌物最佳提取工藝條件為：以水為提取溶劑，采用超聲輔助提取方法，提取參數(shù)為液固比16∶1 (mL/g)，超聲4次，時間55 min。該工藝條件簡單易行，環(huán)境友好，無污染；所獲取的提取物對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌兩種典型腐敗菌，傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌兩種常見致病菌的抑菌效果顯著；從節(jié)約能源和提高工作效率考慮，建議實際工作中使用工藝參數(shù)液固比16∶1 (mL/g)，超聲3次，時間35 min。另外，目前對箬葉水提物的研究嚴(yán)重不足，應(yīng)加強(qiáng)其中未知抑菌成分分析，開展廣普抑菌試驗，多方面開展活性穩(wěn)定性研究，開發(fā)更多相關(guān)產(chǎn)品。