陸振華 于麗芳 蔡丹萍 李 成

水胺硫磷是由德國拜耳公司研發(fā)的一種廣譜性有機(jī)磷殺蟲、殺螨劑，具觸殺、殺卵和胃毒作用,在昆蟲體內(nèi)能首先被氧化成毒性更大的水胺氧磷，抑制昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶[1]。水胺硫磷屬于高毒農(nóng)藥，已禁止在蔬菜、瓜果、茶葉、菌類、中草藥材上使用。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定茶葉中水胺硫磷的最大殘留限量為0.05 mg/kg。近年來，茶葉中水胺硫磷超限量常有報道，如何提升農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性已成為相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)的一項重要工作。

目前，茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測方法較多。對氣相色譜法[2-4]、氣相色譜—質(zhì)譜法[4-6]和液相色譜—質(zhì)譜法[7]測定茶葉中農(nóng)藥殘留的不確定度評定有較多報道，關(guān)于GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法》測定蔬菜中農(nóng)藥殘留的不確定度評定也有報道[8-9]，而參照GB 23200.113—2018測定茶葉中農(nóng)藥殘留的不確定度評定還未見相關(guān)報道。茶葉基質(zhì)復(fù)雜，含有較多的生物堿、茶多酚和色素等對農(nóng)藥殘留檢測產(chǎn)生干擾的物質(zhì)，檢測時需加入更多的凈化試劑，且茶葉含水率較低，在提取過程中需用水浸泡使細(xì)胞膨脹，與有機(jī)溶劑充分接觸，才能達(dá)到提高提取效率的目的。且茶葉農(nóng)殘檢測時，取樣量較少，稱樣量及均勻性對檢測結(jié)果的影響較大。因此茶葉的前處理對檢測結(jié)果的影響更大。對于各影響因素評定方法的處理，通?；厥章视酗@著性差異時，會將回收率代入計算公式以修正樣品的測定結(jié)果[10-11]，但當(dāng)實際出具的檢測數(shù)據(jù)滿足標(biāo)準(zhǔn)要求時，對回收率的處理并不直接折算到結(jié)果中。評定用內(nèi)標(biāo)法定量時的不確定度，通常的處理方法是用內(nèi)標(biāo)濃度進(jìn)行評定再進(jìn)行合成[12-13]，但內(nèi)標(biāo)法一般用同一種內(nèi)標(biāo)，只與加標(biāo)的體積有關(guān)。

研究基于CNAS-GL006—2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，參照GB 23200.113—2018中QuEChERS-氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉農(nóng)藥殘留的方法，用單獨(dú)的數(shù)學(xué)模型將內(nèi)標(biāo)參與到評定過程中，將回收率以純度的方式參與到評定過程中，再對樣品稱量、體積引入、測量重復(fù)性等因素進(jìn)行評定，找出影響茶葉中水胺硫磷檢測結(jié)果測量不確定度的主要原因，以期為實驗室檢測茶葉中水胺硫磷時進(jìn)一步提高檢測數(shù)據(jù)的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-TQ8040型，日本SHIMADZU公司；

氮吹儀：N-EVAP 111型，美國Organomation公司；

旋渦儀：XH-B型，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；

超聲儀：KH-500DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

離心機(jī)：TG1850-WS型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

電子天平：SL2002N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；

乙腈、乙酸乙酯：色譜純，美國Fisher公司；

水胺硫磷(CAS：24353-61-5；相對擴(kuò)展不確定度±3%)：1 000.0 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司；

環(huán)氧七氯B(CAS：1024-57-3；相對擴(kuò)展不確定度±3%)：100.0 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)：50 μm，納譜分析技術(shù)(蘇州)有限公司；

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)：50 μm，納譜分析技術(shù)(蘇州)有限公司；

石墨化炭黑(GCB)：100 μm，納譜分析技術(shù)(蘇州)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣處理

(1) 提?。簻?zhǔn)確稱取2 g粉碎均勻的茶葉樣品，于50 mL 塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加入15 mL乙腈—醋酸(V乙腈∶V醋酸=99∶1)溶液、6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉、1顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min，超聲30 min，4 200 r/min離心5 min。

(2) QuEChERS凈化：吸取8 mL上清液到15 mL塑料離心管中(內(nèi)含1 200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及200 mg GCB)，渦旋混勻1 min。4 200 r/min離心5 min。

(3) 濃縮：準(zhǔn)確吸取2 mL上清液至10 mL玻璃試管中，40 ℃水浴中氮吹至近干。加入20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液(環(huán)氧七氯B 5 μg/mL)，加入1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜，用于GC-MS/MS測定，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.2 儀器檢測條件

(1) 色譜條件：色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；流量1.69 mL/min；程序升溫條件為初溫50 ℃，保留1 min，以25 ℃/min升溫至125 ℃，再以10 ℃/min 升溫至300 ℃，保留6 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量體積1 μL。

(2) 質(zhì)譜條件：EI源；電子轟擊源70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲2 min；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3 測量數(shù)學(xué)模型

(1)

式中：

ω——待測樣品中水胺硫磷的含量，mg/kg；

c——試樣中水胺硫磷的質(zhì)量濃度，μg/mL；

v——總的樣品代表的試樣體積，mL；

V1——加入提取溶劑的體積，mL；

V2——移取上清液的體積，mL；

V3——最終樣品復(fù)溶體積，mL；

m——試樣稱樣量，g；

fmethod——方法校正因子。

1.2.4 不確定度分量的主要來源 根據(jù)試驗的測定，茶葉中水胺硫磷殘留量測定不確定度分量主要來源如圖1所示。

表1 水胺硫磷及環(huán)氧七氯B的質(zhì)譜參數(shù)表Table 1 Mass spectrum parameters of isocarbophos and heptachlor epoxide B

圖1 不確定度來源Figure 1 Analysis diagram of the uncertainty source

2 水胺硫磷農(nóng)藥殘留不確定度分量的評定

2.1 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

2.2 體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v)

主要包含加入提取溶劑V1、移取上清液的體積V2、最終乙酸乙酯復(fù)溶的體積V3。

2.2.1 加入提取溶劑引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)

所以移液管移取15 mL乙腈—醋酸(V乙腈∶V醋酸=99∶1)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 移取上清液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)

移取2 mL上清液使用的是2 mL A級單標(biāo)線吸量管，其允許誤差為±0.010 mL，參考15 mL單標(biāo)線吸量管的評定過程，2 mL A級單標(biāo)線吸量管引入的不確定度為：

實驗室溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

所以吸量管移取2 mL上清液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 乙酸乙酯復(fù)溶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)

使用1 mL A級單標(biāo)線吸量管移取1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，1 mL A級單標(biāo)線吸量管允許誤差為±0.007 mL，參考15 mL單標(biāo)線吸量管的評定過程，1 mL A級單標(biāo)線吸量管引入的不確定度為：

乙酸乙酯的體積膨脹系數(shù)為1.38×10-3℃-1，則溫度對乙酸乙酯體積變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

所以移取1 mL乙酸乙酯復(fù)溶的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，由提取液移取、提取液凈化分取和濃縮定容3個步驟引起的合成相對不確定度urel(v)為：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液校準(zhǔn)過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)

該相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源：標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1rel(c) 試驗使用的水胺硫磷標(biāo)樣購于北京曼哈格生物科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給出的質(zhì)量濃度為1 000.0 μg/mL，其擴(kuò)展不確定度為±3%(k=2)，所以標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度為：

10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：使用量程為20～200 μL的移液器移取1 000.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)原液100 μL到10 mL容量瓶，用乙酸乙酯定容至刻度。

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程：其數(shù)學(xué)模型為

(2)

式中：

cx——稀釋后標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；

cs——標(biāo)準(zhǔn)原液的質(zhì)量濃度，μg/mL；

vy——移液器移取的體積，μL；

vr——定容時容量瓶的體積，mL。

1 μg/mL儲備液：用1 mL A級單標(biāo)線吸管吸取10 μg/mL 的儲備液1 mL到10 mL A級容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL到茶葉空白基質(zhì)中，加20 μL環(huán)氧七氯B內(nèi)標(biāo)溶液(5 μg/mL)，過膜，配制成質(zhì)量濃度分別為0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。1 mL標(biāo)樣的移取使用的是1 mL A級單標(biāo)線吸量管，樣品復(fù)溶時已有評定，這里不重復(fù)評定。試驗選擇與被測樣品接近的urel(c0.01)=2.223%予以評定，則u1rel(c)=urel(c0.01)=2.223%。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度 5種濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高分別上機(jī)進(jìn)樣，得到的濃度比及面積比的數(shù)據(jù)見表2。采用儀器自帶的定量軟件最小二乘法擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：

Arf=-0.025 042+5.544 347cri，R2=0.999 997，

(3)

式中：

cri——標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液濃度比值；

Arf——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。

為了評定茶葉中水胺硫磷殘留限量時(即殘留量為0.05 mg/kg)的不確定度，所以假定某陽性樣品平行測定2次，得到樣液中平均質(zhì)量濃度為0.013 33 μg/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL。其與內(nèi)標(biāo)濃度比的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(4)計算：

(4)

表2 線性回歸方程擬合過程及結(jié)果?Table 2 Linear regression equation fitting and results

式中：

s——擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

b——擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率，b=5.544 347；

p——試樣測定的次數(shù)，p=2；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測定次數(shù)，n=5；

cr——試樣中水胺硫磷與內(nèi)標(biāo)濃度比的平均值，cr=0.133 3；

cri——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中水胺硫磷與內(nèi)標(biāo)的系列濃度比。

所以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液校準(zhǔn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 重復(fù)性測量引入的不確定度urel(rep)

2.5 方法回收率引入的不確定度urel(R)

對市售茶葉按1.2試驗方法進(jìn)行檢測，在水胺硫磷目標(biāo)峰位置觀察其質(zhì)譜圖，無法識別出水胺硫磷特征離子的樣品確定為陰性樣品。稱取6份陰性茶葉樣品，添加量為0.05 mg/kg，測定回收率，結(jié)果見表3。

表3 樣品添加回收率Table 3 Results of replicate recovery tests in samples

標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算得到：

因此方法回收率引入的不確定度需進(jìn)行修正。但通常情況下，檢測結(jié)果滿足標(biāo)準(zhǔn)要求時，不需要把回收率直接折算到檢測結(jié)果中，所以將回收率以水胺硫磷純度的方式參與到評定過程中，則

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

綜上所述，各因素相對不確定度分別為urel(m)=2.04%，urel(v)=0.778%，urel(c)=4.35%，urel(rep)=1.88%，urel(R)=3.37%，根據(jù)不確定度傳播公式對各分量進(jìn)行合成：

u(ω)=0.050×6.22%=0.003 2 mg/kg。

2.7 擴(kuò)展不確定度U(ω)

取包含因子k=2，置信水平P=95%，則擴(kuò)展不確定度為：

U(ω)=2u(ω)=2×0.003 2=0.007 mg/kg。

測定結(jié)果：

通過QuEChERS-氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定，該茶葉樣品中水胺硫磷殘留量結(jié)果為：

ω=(0.050±0.007) mg/kg，k=2。

3 結(jié)論

通過QuEChERS-氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中水胺硫磷殘留量的不確定度分析，得出該方法的檢測結(jié)果表示為ω=(0.050±0.007) mg/kg，k=2。從各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量數(shù)值大小可以看出，濃度c(涉及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)儲備液與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線校準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)加入量)引入的不確定度分量對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度貢獻(xiàn)最大，加標(biāo)回收試驗引入的不確定度對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的貢獻(xiàn)次之，因此，可以通過使用不確定度更小的標(biāo)樣，用精度更高的量器配制標(biāo)線及加內(nèi)標(biāo)等方式降低相關(guān)不確定度分量，也可以通過改善樣品的前處理步驟(QuEChERS凈化、氮吹等)，減少水胺硫磷殘留量的損失，特殊情況，還可以通過回收率的校準(zhǔn)，來提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證測量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。