趙佳佳 王 夢 李 言 錢海峰 樊銘聰 王 立

烏飯樹是一種歷史悠久的藥用植物資源，是天然的植物色素來源。中國烏飯樹資源蘊藏量豐富，東部沿海地區(qū)居民利用其樹葉汁將大米著色蒸煮制成藍黑色的烏米飯，食用習俗已流傳千年[1]。在烏米飯食用地區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，常食用烏米飯可顯著改善2型糖尿病患者血糖水平，與精制大米相比，其表面的藍黑色素對外觀特征和營養(yǎng)特性起著重要作用[2]。

烏飯樹樹葉中含有多種活性成分，目前已發(fā)現(xiàn)超過200種化合物，主要成分是類黃酮、酚酸和環(huán)烯醚萜類化合物[3]。中國有很多學者對烏米飯表面的色素成分進行了相關(guān)研究，對烏飯樹樹葉進行浸提純化等操作，并將制得的黑色濃縮物統(tǒng)稱為“黑色素”。顧文秀等[4]、胡志杰等[5]、王立等[6]分別利用超聲波法、復(fù)合酶法輔助提高了色素的得率，最高可達到3.3%。同時，研究者[7-8]通過分析烏飯樹樹葉和果實中色素的化學組成，推測其中的色素成分可能是花色苷等黃酮類物質(zhì)。但是在烏米飯染色過程中，經(jīng)烏飯樹樹葉提取物浸泡的米粒表面呈現(xiàn)藍黑色。課題組[9]前期針對該藍黑色物質(zhì)研究后發(fā)現(xiàn)，烏飯樹樹葉中環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)可以作為前體物質(zhì)經(jīng)水解、聚合后生成有色物質(zhì)，環(huán)烯醚萜苷元與蛋白質(zhì)的—NH2殘基發(fā)生共價反應(yīng)轉(zhuǎn)化為以碳—氮鍵為主要特征骨架的吡啶類雜環(huán)有色化合物。烏米飯表面藍黑色素的著色穩(wěn)定性較強，染色完成后色素不易直接提取分離，推測在染色過程中色素與大米組分發(fā)生了較強的結(jié)合作用。然而，基于該呈色反應(yīng)機理利用呈色前體物質(zhì)與游離氨基酸反應(yīng)制備藍黑色素的方法可以克服傳統(tǒng)染色方法提取難度的缺陷，為藍黑色素與大米組分相互作用的表征奠定了基礎(chǔ)[10]。因此，研究擬以烏飯樹樹葉為原料分離呈色前體物并制備藍黑色素，研究其與大米蛋白組分的結(jié)合作用，探討藍黑色素對大米蛋白理化性質(zhì)的影響，以期為促進烏飯樹天然色素的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

烏飯樹樹葉：采自江蘇溧陽；

大米蛋白(蛋白含量80%，以干基計)：西安天之露生物科技有限公司；

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)：100 U/mg，上海百靈威公司；

無水乙醇、乙酸、氫氧化鈉等試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

冷凍干燥機：FreeZone-6型，美國Labconco公司；

手持色差計：CR-410型，日本柯尼卡美能達公司；

紫外可見分光光度計：T9雙光束型，北京普析通用儀器有限責任公司；

全自動圓二色光譜儀：Chirascan V100型，英國Applied Photophysics公司；

分散乳化機：ULTRA-TURRAX型，德國IKA公司；

熒光分光光度計：日立F-7000型，日本Hitachi公司；

恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烏飯樹樹葉藍黑色素的制備 按Fan等[11]的方法，將烏飯樹樹葉洗凈后，按料水比1∶5 (g/mL)破碎勻漿10 min，紗布過濾出雜質(zhì)后離心15 min (4 ℃，8 000 r/min)，將上清液濃縮后真空冷凍干燥，得到棕黃色的烏飯樹樹葉水提物粉末，取適量粉末分散于去離子水中至質(zhì)量濃度2 mg/mL，添加β-葡萄糖苷酶使其質(zhì)量濃度為8 μg/mL，在37 ℃下恒溫水解1～2 h，在水解液中加入0.1 g/100 mL甘氨酸[10]，50 ℃恒溫水浴3 h，至溶液顏色呈藍黑色，過濾沉淀后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，初步得到粗制藍黑色素粉末。采用葡聚糖凝膠Sephadex G-15進行柱層析(層析柱長度25 cm，直徑4.0 cm)，以質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗制藍黑色素溶液上樣，利用去離子水洗脫，收集每個洗脫級分(1～2個柱體積為一個級分)。藍黑色素的吡啶雜環(huán)結(jié)構(gòu)在585 nm處有特征吸收峰，因此將在585 nm處有吸收峰的洗脫液合并為純化的藍黑色素溶液。最后，將溶液在55 ℃條件下進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后繼續(xù)冷凍干燥，得到藍色絮狀色素粉末。

1.2.2 色素—大米蛋白復(fù)合物的制作 稱取5 g大米蛋白溶解于50 mL去離子水中，分別制備不同烏飯樹樹葉藍黑色素添加量的蛋白溶液，分別加入0，75，150，250，350，450 mg的藍黑色素后在60 ℃下攪拌30 min，在50 ℃ 條件下進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后繼續(xù)冷凍干燥，得到藍黑色素添加量分別為0.0，1.5，3.0，5.0，7.0，9.0 g/100 g的蛋白樣品，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 色度 利用柯尼卡美能達(CR-410)手持色差計對染色前后大米蛋白的色度進行測定，數(shù)據(jù)結(jié)果用L*、a*和b*表示。其中白色L*值的大小代表顏色由黑到白的程度(L*值=100為白色，L*值=0為黑色)，紅綠色度a*值代表顏色由綠到紅的程度(正值為紅，負值為綠)，黃藍色度b*的大小代表顏色由黃到藍的程度(正值為黃，負值為藍)。

1.2.4 溶解性 取100 mg大米蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，用0.1 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.0～12.0，室溫下磁力攪拌1 h后，5 000 r/min離心20 min，取上清液測定其中蛋白質(zhì)含量，按式(1)計算蛋白樣品的溶解性。

(1)

式中：

C——溶解率，%；

m1——上清液中蛋白含量，g；

m2——原料中總蛋白含量，g。

1.2.5 吸水性 取1 g大米蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，振蕩搖勻2 min以保證蛋白樣品充分分散，在室溫下靜置30 min左右，5 000 r/min離心20 min，棄去上清液，將沉淀稱重，按式(2)計算蛋白樣品的吸水性。

(2)

式中：

W——吸水性，%；

m1——沉淀物質(zhì)量，g；

m2——蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.2.6 持油性 取1.0 g蛋白與10 mL大豆油均勻混合，室溫下靜置30 min，5 000 r/min離心20 min，將上層大豆油移入干燥的10 mL量筒中，記錄體積，按式(3)計算蛋白樣品的持油性。

(3)

式中：

O——持油性，%；

v——最終體積，mL；

m——蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.2.7 二級結(jié)構(gòu)相對含量 利用圓二色光譜(CD)測定染色前后大米蛋白的二級結(jié)構(gòu)[12]。配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的大米蛋白溶液，用Chirascan V100圓二色光譜儀在室溫下檢測圓二色譜，石英比色皿的光線路徑長度為0.1 cm，掃描范圍190～260 nm，光譜帶寬1.0 nm，掃描速度為100 nm/min，以去離子水的圓二色光譜圖作為基線校正，每組樣品平行掃描3次得到CD譜圖，然后將光譜數(shù)據(jù)導入CD-Pro軟件計算出每組蛋白樣品中二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)的相對含量。

1.2.8 起泡性和起泡穩(wěn)定性 取0.5 g蛋白溶于50 mL去離子水中，磁力攪拌30 min后均質(zhì)2 min，轉(zhuǎn)入100 mL量筒分別測量均質(zhì)后0 min和30 min泡沫體積，分別按式(4)和式(5)計算蛋白樣品的起泡性和起泡穩(wěn)定性。

(4)

(5)

式中：

F——起泡性，%；

v0——0 min時的泡沫體積，mL；

FS——起泡穩(wěn)定性，%；

v30——30 min時的泡沫體積，mL。

1.2.9 乳化性和乳化穩(wěn)定性 取8 mL的大豆油與24 mL 0.1% 的蛋白溶液混合，10 000 r/min均質(zhì)1 min，形成均勻乳液。在試管中加入5 mL濃度為0.1%的SDS溶液，分別移取50 μL均質(zhì)后0 min和10 min的乳液，測定其在500 nm處的吸光度，分別按式(6)和式(7)計算蛋白樣品的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

(6)

(7)

式中：

E——乳化性，m2/g；

t——時間，min；

A0——0 min時的吸光度；

r——稀釋倍數(shù)；

c——質(zhì)量濃度，mg/mL；

v——油相體積，mL；

ES——乳化穩(wěn)定性，min；

A10——10 min時的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0(美國SPSS公司)的單因素方差分析(ANOVA)進行分析，以P<0.05來表示樣品平均值之間的顯著性差異。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍黑色素對大米蛋白色度的影響

由表1可知，大米蛋白呈淡黃色，隨著色素質(zhì)量分數(shù)的升高，色素—蛋白復(fù)合物的L*和b*值顯著降低，平均值分別從87.11，22.70下降到了70.03，7.85(P<0.05)，a*值略微降低，由正值變?yōu)樨撝怠Ｉ戎档淖兓砻髟谌旧^程中色素—蛋白復(fù)合物樣品的白度降低，并由偏黃轉(zhuǎn)為偏藍，二元復(fù)合體系的亮度變暗，色調(diào)向藍黑色轉(zhuǎn)變。

2.2 藍黑色素對大米蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

2.2.1 溶解度 從圖1可以看出，隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，色素—蛋白復(fù)合體系的溶解度先下降后緩慢上升。這可能是藍黑色素的主要成分是偏酸性的環(huán)烯醚萜類衍生物質(zhì)，而大米蛋白的等電點在pH 4.0左右，且蛋白質(zhì)在等電點處的溶解度最低，越偏離等電點溶解度越高[13]。因此，加入色素后的色素—蛋白復(fù)合物的分散液pH較純大米蛋白分散液更接近等電點，導致藍黑色素染色后的大米蛋白溶解度降低。在繼續(xù)升高藍黑色素的質(zhì)量分數(shù)后，二元復(fù)合體系的溶解度又有所上升。這是因為在低pH值下，環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的親水基團能與水分子之間形成氫鍵，使得二元體系溶解度升高[14]。

表1 烏飯樹樹葉藍黑色素質(zhì)量分數(shù)對大米蛋白色澤的影響?Table 1 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on color of rice protein (n=3)

圖1 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白溶解度的影響Figure 1 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on solubility of rice protein

2.2.2 吸水性 圖2為大米蛋白的持水性隨色素質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢。由圖2可知，隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，色素—蛋白復(fù)合體系的持水性先上升后下降。推測原因是：加入藍黑色素使二元復(fù)合體系內(nèi)親水基團含量升高，導致色素—蛋白復(fù)合物持水性升高。而隨著色素質(zhì)量分數(shù)持續(xù)增大，由于環(huán)烯醚萜類衍生物偏酸性，使色素—蛋白復(fù)合體系的pH偏離等電點時，蛋白所帶電荷減少，與水分子間作用力較弱，持水性降低[15]。與此同時，色素—蛋白復(fù)合體系的溶解度升高，導致持水性降低[16]。

2.2.3 持油性 圖3為大米蛋白的持油性隨色素質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢。由圖3可知，隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，色素—蛋白復(fù)合體系的持油性持續(xù)下降。推測原因可能是：藍黑色素中的疏水鍵與大米蛋白表面的疏水鍵通過非共價作用結(jié)合，使得大米蛋白結(jié)構(gòu)中原有的疏水鍵減少，降低了大米蛋白的持油性，同時加入色素使二元復(fù)合體系的親水基團數(shù)量增加，進一步降低了色素—蛋白復(fù)合物的持油性[17]。

2.2.4 二級結(jié)構(gòu) 表2為不同質(zhì)量分數(shù)烏飯樹樹葉藍黑色素染色前后色素—蛋白復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)變化。由表2 可知，隨著烏飯樹樹葉色素質(zhì)量分數(shù)的升高，二元復(fù)合體系中α-螺旋和β-折疊的含量顯著下降，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量有所上升，其中α-螺旋下降了14.1%，β-折疊下降了9.5%，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量則分別增加了10.5%和13.3%(P<0.05)。推測出現(xiàn)這種情況的原因在于色素中含有大量的環(huán)烯醚萜類衍生物質(zhì)，這些化合物有較多的極性基團[18]。而大米蛋白內(nèi)部α-螺旋、β-折疊中存在大量氫鍵，與色素結(jié)合后大米蛋白內(nèi)部的極性基團與色素中極性基團結(jié)合并形成氫鍵，對維持大米蛋白中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵造成破壞，致使其轉(zhuǎn)變成無規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)[19]。

圖2 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白持水性的影響Figure 2 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on water-holding capacity of rice protein

圖3 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白持油性的影響Figure 3 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on oil-holding capacity of rice protein

表2 大米蛋白與烏飯樹樹葉藍黑色素復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)的變化情況?Table 2 Changes on secondary structures of rice protein complex with different concentrations of VBTL dark blue pigment (n=3) %

2.3 藍黑色素對大米蛋白乳化性質(zhì)的影響

2.3.1 起泡性和起泡穩(wěn)定性 由圖4可知，隨著藍黑色素質(zhì)量分數(shù)升高，大米蛋白起泡性先下降再上升。而大米蛋白的起泡穩(wěn)定性的趨勢相反，隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，起泡穩(wěn)定性先上升后下降。在加入藍黑色素后，色素—蛋白復(fù)合體系的pH先偏向蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)的溶解度降低，不利于界面上蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和形成黏稠的膜，導致了色素—蛋白復(fù)合物起泡性的降低。而隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，二元復(fù)合體系中親水基團的含量升高，色素—蛋白復(fù)合物的溶解度上升，溶液的表面張力減少，對泡沫的形成比較有利。且色素—蛋白復(fù)合物的極性更強，更易與水分子相互作用形成氫鍵，促使了蛋白質(zhì)擴散到空氣—水界面并展開，有助于產(chǎn)生更多的氣泡[20]。

而隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，大米蛋白的起泡穩(wěn)定性先上升后下降。這是因為加入烏飯樹樹葉藍黑色素后，色素—蛋白復(fù)合體系的pH首先偏向等電點，蛋白所帶電荷減少，界面與蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減少，有助于維持泡沫的穩(wěn)定。但是繼續(xù)加入色素會提高蛋白質(zhì)的溶解度，促進蛋白質(zhì)分子與水分子相互作用，同時產(chǎn)生更多的氣泡，導致蛋白質(zhì)膜強度和溶液黏度降低，最終影響色素—蛋白復(fù)合體系的起泡穩(wěn)定性[21]。

2.3.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性 從圖5可以看出，隨著色素質(zhì)量分數(shù)升高，色素—蛋白復(fù)合體的乳化性和乳化穩(wěn)定性均呈先下降再上升的趨勢。結(jié)合前面2.3.1的分析結(jié)果推測：加入藍黑色素后，色素—蛋白復(fù)合體系的pH偏向等電點，蛋白所帶電荷減少，分子之間的靜電斥力減小，因此乳化性下降。而隨著色素質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增大，大米蛋白的溶解度提高，此時界面排斥力減小，有利于蛋白質(zhì)分子擴散并吸附在油/水界面上，并最終使色素—蛋白質(zhì)二元體系的乳化性上升。

圖4 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響Figure 4 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on foaming capacity and foam stability of rice protein

圖5 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Figure 5 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on emulsifying capacity and emulsion stability of rice protein

色素—蛋白二元復(fù)合體系的乳化穩(wěn)定性的趨勢與乳化性相似，加入藍黑色素后，色素—蛋白復(fù)合體系的乳化穩(wěn)定性有所上升。蛋白質(zhì)分子在乳化體系中的穩(wěn)定性取決于界面膜的穩(wěn)定性，而蛋白的溶解度能顯著影響界面膜的形成[22]。加入色素后的二元復(fù)合體系的親水性增強，溶解度增大，有助于界面膜流變性質(zhì)的改善，從而改善了乳化穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過研究烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白色度、結(jié)構(gòu)特性和乳化特性的影響，發(fā)現(xiàn)烏米飯染色過程中藍黑色素與大米蛋白會發(fā)生非共價結(jié)合，造成二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊含量降低、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加，使大米蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展、變性，內(nèi)部氫鍵遭到破壞迫使其向無規(guī)卷曲變化，因此，色素—蛋白二元復(fù)合體系的乳化性質(zhì)得到改善。隨著色素質(zhì)量分數(shù)的增加，色素—蛋白二元復(fù)合體系的持水性、起泡穩(wěn)定性隨色素質(zhì)量分數(shù)升高呈先升高后下降趨勢，起泡性、乳化性和乳化穩(wěn)定性隨色素質(zhì)量分數(shù)升高呈先下降后升高趨勢。后續(xù)將繼續(xù)探討藍黑色素在染色過程中與大米蛋白的結(jié)合規(guī)律及其在加工食用過程中的變化規(guī)律。