孟祥忍 高子武 王恒鵬 屠明亮 吳丹璇 高蘇敏 劉宗振

醬鹵牛肉是中國傳統肉制品的重要代表，深受人們的喜愛，而“老鹵”的使用是其風味獨特的重要原因之一。一般來說，至少循環(huán)煮制20次的鹵湯稱“老鹵”[1]，含有豐富的游離氨基酸、核苷酸等滋味物質[2]，賦予了牛肉醇厚的滋味，進而形成獨特的風味。老鹵中風味物質種類繁多且復雜，對其綜合分析較為困難。臧明伍等[3]利用SPME-GC-O-MS技術分別對清真醬牛肉在預煮、煮制1 h、煮制完成及浸泡冷卻4個加工階段的風味物質進行測定，認為以醚、醛類為主體風味物質。李素等[4]使用吹掃捕集—熱脫附—氣相色譜—質譜聯用法探究了鹵湯牛肉在貯藏期內揮發(fā)性風味物質的變化規(guī)律，并確定了壬醛、對茴香醛和辛酸為鹵湯牛肉的主體風味物質。李娟等[5]采用氣相色譜—質譜聯用法探究了北京老字號醬牛肉風味物質的組成與貢獻，確定了桉葉油醇、芳樟醇、草蒿腦、壬醛、茴香腦5種特征性風味物質。

目前，醬鹵肉制品風味強度的評判多根據感官指標，但感官評定具有較強的主觀性。主成分分析法可以根據各指標的相關性和變異程度來確定權重[6]，可以減少主觀確定各指標權重的弊端，是一種客觀的評價方法，被廣泛應用于鹽水鵝[7]、羊肉[8]、茶葉[9]等食品的風味評價中。國內外有關鹵牛肉的研究多集中于單次鹵煮過程中品質變化和不同階段工藝的優(yōu)化，而關于循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味物質的研究尚未見報道。研究擬采用固相微萃取結合氣相色譜—質譜聯用技術定性定量分析循環(huán)鹵煮牛肉的風味物質，結合相對氣味活度值(ROAV)篩選其關鍵性風味物質，并采用主成分分析法建立循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味強度的評價模型，旨在為后期更客觀評價其特征性風味提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯西黃牛金錢腱：飼養(yǎng)條件一致，12月齡，宰后成熟72 h，平均體重(500±10) kg，山東華勝清真肉類有限公司；

食用鹽、香辛料、黃酒等：食品級，市售。

1.2 儀器與設備

電子天平：FA2104型，萬特衡器電器有限公司；

電磁爐：GC-20XCAa型，廣東格力電器股份有限公司；

氣相色譜儀：TraceISQII型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

石英毛細管柱：DB-Wax型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 循環(huán)鹵煮工藝流程 參照唐春紅等[2]的方法適當修改。

(1) 鹵湯：相對于肉重計算，350.00%的純凈水中加入1.00%鹽、1.50%生抽、1.00%老抽、4.00%料酒、1.00%蔥、1.00%姜、0.15%八角、0.07%山奈、0.03%小茴香、0.07% 香葉、0.06%草果、0.03%甘草、0.15%桂皮、0.01%丁香，煮沸保持10 min后將香料撈出，即配成鹵湯。

(2) 循環(huán)鹵制：將牛腱肉修整后去除表面筋膜與脂肪，重量控制在(400±5) g，按牛肉質量計算，3.00%鹽均勻涂抹于牛腱肉表面，0～4 ℃靜置腌制24 h，冷水入鍋進行焯水，沸騰保持5 min后撈出清洗冷卻，加入煮沸的鹵湯中，并在微沸狀態(tài)下(電磁爐加熱功率500 W)鹵制60 min，取出牛腱肉。每次鹵煮結束后將鹵湯冷卻過篩，去除表面油脂及碎渣，稱重后按比例補充水分以及調味料再次煮沸，按m牛腱肉∶m水為1.0∶3.5加入新牛腱肉，重復操作完成不同鹵煮次數的鹵牛肉。

1.3.2 樣品處理 每次鹵煮結束后，鹵牛肉冷卻至室溫。每個鹵煮循環(huán)取樣1次，選取5個具有代表性的取樣點進行數據分析，取樣點分別為第1，5，10，15，20次，依次標記為L1、L5、L10、L15、L20。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質測定 參照Zhou等[10]的方法并適當修改。萃取頭老化溫度250 ℃；老化時間1 h。稱取3 g鹵牛肉樣品切碎后放入頂空萃取瓶(20 mL)，置于恒溫水浴鍋中，將萃取頭插入至萃取瓶中，55 ℃水浴40 min。色譜條件：色譜柱為DB-Wax(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)，檢測器溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.5 mL/min。起始柱溫40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升溫至180 ℃，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。質譜條件：離子源溫度230 ℃，電離方式EI+，電子能量70 eV，掃描質量范圍30～550 (m/z)。采用保留指數定性，揮發(fā)性風味物質含量通過面積歸一法以峰面積百分含量表示。

1.3.4 風味評價 參照劉登勇等[11]的方法，按式(1)計算相對氣味活度值(ROAV)。

(1)

式中：

ROAVi——相對氣味活度值；

Ci——揮發(fā)性物質的相對百分比含量，%；

Ti——揮發(fā)性物質的感覺閾值，μg/kg；

CMAX——所有風味物質中最大的相對百分比含量，%；

TMAX——所有風味物質中最大的感覺閾值，μg/kg。

1.3.5 感官評定 確定12名感官評價員(6男6女)，均為食品學院師生。分別稱取鹵肉樣品5 g，隨機放在已編號的感官杯中，將樣品水浴加熱至(45±2) ℃。評分標準：90～100分為強烈鹵牛肉風味；80～89分為鹵牛肉風味明顯；70～79分為中等強度鹵牛肉風味；60～69分為輕微鹵牛肉風味；0～59分為幾乎無鹵牛肉香味。

1.3.6 數據處理 利用SPSS 22.0及SIMCA 14.1進行主成分分析及繪制載荷圖，α為0.05。

2 結果與分析

2.1 循環(huán)鹵煮牛肉中揮發(fā)性風味物質分析

由表1可知，鹵牛肉中共檢出64種揮發(fā)性風味物質，其中醛類5種、醇類25種、酮類7種、酸類4種、烴類4種、酯類9種、其他類10種，且醛、醇類物質占比較大。第1，5，10，15，20次鹵湯制作的鹵牛肉分別檢出33，28，31，24，30種揮發(fā)性風味物質，峰面積占比分別為85.98%，87.72%，94.75%，95.04%，96.37%。隨著鹵煮次數的增加，鹵牛肉的揮發(fā)性風味含量逐漸增加，主要是因為鹵煮過程中牛肉蛋白水解和脂肪氧化[12]，導致游離脂肪酸和游離氨基酸等部分風味前體物增加，從而轉化為風味物質，賦予了牛肉更加豐富的風味。

醛類物質閾值較低，具有脂肪香氣，主要來源于脂肪氧化和氨基酸Strecke反應[13]，對鹵牛肉風味的貢獻較大。循環(huán)鹵煮牛肉中醛類物質相對含量最高，第1～20次鹵湯制作的鹵牛肉中其相對含量從43.29%增加至63.63%。這可能是由于肉中的不飽和脂肪酸和脂肪發(fā)生氧化降解并融入了鹵湯中[14]。循環(huán)鹵煮牛肉中壬醛和正己醛的產生主要源于油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸的氧化[15]，其中正己醛所占峰面積最大，呈青草和清新味，能增加味感[16]，在循環(huán)鹵煮次數增加的過程中，其含量呈先下降后上升的趨勢，在鹵煮第10次時趨于平緩。壬醛在各鹵牛肉中均有檢出，呈玫瑰香、柑橘香等香型[17]。醇類物質主要來源于不飽和脂肪酸氧化和醛類的還原[17]。在鹵湯循環(huán)鹵制過程中，峰面積占比第二的物質是醇類物質。鹵煮第20次鹵湯制作的鹵牛肉中的醇類含量低于鹵煮第1次的。其中芳樟醇主要來源于鹵水中添加的香辛料，乙醇主要來源于料酒，循環(huán)鹵煮過程中這兩種醇含量降低，可能是發(fā)生了揮發(fā)、氧化和脂化反應。酮類物質閾值較高，主要來自于美拉德反應和不飽和脂肪酸熱氧化，對鹵牛肉風味貢獻較小[17-18]。循環(huán)鹵煮過程中，峰面積占比最少的為酮類物質，僅為2.21%。酯類化合物閾值較低，主要由醇類與酸類的酯化反應產生，可賦予肉制品酯香味、甜味和果味[18]。第1～20次鹵湯制作的鹵牛肉中酯類物質相對含量從2.18%降低至0.86%，主要是在循環(huán)鹵煮過程中，酯類物質發(fā)生降解，而降解產生的化合物與美拉德中間產物等反應，進而生成其他類化合物所致[19]。烴類物質閾值較高，其形成主要來源于脂肪氧化[20]。在反復鹵煮過程中烴類物質含量逐漸升高，是因為鹵牛肉中的脂肪酸發(fā)生氧化，鹵牛肉中的烴類物質逐漸被鹵湯吸收，而后隨著循環(huán)鹵煮次數的增加鹵湯中的烴類物質逐漸浸入到牛肉中，進而使鹵牛肉中的烴類含量逐漸上升。

表1 牛肉循環(huán)鹵煮過程中揮發(fā)性風味物質的相對含量和ROAV值?Table 1 Analysis results of volatile flavor compounds and corresponding ROAV in the process of cyclic stewed beef

續(xù)表1

由表1可知，5組鹵牛肉中有5種風味物質均被檢出，分別為正己醛、十一醛、壬醛、正己醇和3-甲基戊烷。其中正己醛在鹵牛肉中檢出含量較高且ROAV值均大于1.00，為鹵牛肉的關鍵揮發(fā)性風味物質，與邵俊鋒等[21]、謝偉等[22]的結論一致。十一醛、壬醛、正己醇和3-甲基戊烷的ROAV值為0.10～1.00，表明其對鹵牛肉的整體風味具有修飾作用。桉葉油醇的ROAV值分別在L5、L10、L15和L20中最大，茴香腦ROAV值在L1中最大，這兩類物質可能與鹵水中添加的香辛料有關[22-23]，能促進鹵牛肉風味的形成。

2.2 循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味的主成分分析

將5組鹵牛肉樣品中檢出的27種特征風味物質(ROAV≥0.10)構成5×27的矩陣，進行主成分分析，得到相關矩陣的特征值及累計貢獻率。根據特征值大于1和累計貢獻率達到85.00%以上的原則確定主成分個數[23]。由圖1和表2可知，前3個主成分的方差貢獻率分別為52.40%，25.64%，12.95%，累計方差貢獻率為90.98%，且特征值均大于1，表明前3個主成分能解釋循環(huán)鹵煮牛肉中特征風味的大部分信息，能夠代表循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味物質的基本信息。

由表3和圖1可知，第1主成分的貢獻率最大的是X2(十一醛)，其對應的特征值為0.96，第1主成分與X1、X2、X6、X9、X13、X15、X32、X41、X48、X52、X53、X59、X60呈正相關，與X3、X18、X19、X20、X21、X33、X34、X54、X63呈負相關。芳樟醇、異松油烯、茴香腦、4-丙烯基-2-甲氧基苯酚等來源于香料，正己醛、十一醛、反式-2-已烯-1-醇、正辛醇、反式2-己烯基己酸等來源于酯類物質的分解。第2主成分的貢獻率最大的是X14(4-萜烯醇)，其對應的特征值為0.94，主要反映X6、X9、X14、X15、X18、X53、X60的變異信息。4-萜烯醇存在于豆蔻中，4-丙烯基-2-甲氧基苯酚存在于丁香中，其余大部分物質也來源于香辛料，表明第2主成分代表了牛肉中香料的風味。第3主成分的貢獻率最大的是X8(正己醇)，其對應的特征值為0.89，主要反映X8、X16、X24、X32的變異信息，這些醇酮類物質主要由酯類物質降解、氧化而來[18]。各主成分的方程式分別為：

圖1 主成分分析碎石圖和散點圖Figure 1 Principal component analysis macadam and scatter

表2 相關矩陣的特征值和累計貢獻率Table 2 Eigenvalues and cumulative contribution rate of correlation matrix

表3 主成分的特征向量Table 3 Eigenvectors of principal components

F1=0.85X1+0.96X2-0.78X3+…+0.72X59+0.71X60-0.85X63，

(2)

F2=-0.14X1+0.05X2+0.59X3+…+0.70X59+0.70X60+0.49X63，

(3)

F3=-0.19X1-0.13X2+0.190X3+…-0.04X59-0.00X60+0.19X63。

(4)

由于前3個主成分反映了原來指標信息的90.98%，且原來多個指標較為復雜，故可用這3個新綜合指標進行分析。選擇不同特征的方差貢獻率βi(i=1，2，…，k)為加權系數[23]，利用綜合評價函數F=(β1F1+β2F2+…+βkFk)/0.91建立鹵牛肉特征性風味評價模型：

F=(0.52F1+0.26F2+0.13F3)/0.91。

(5)

根據式(5)計算不同循環(huán)鹵煮牛肉樣品特征性風味評價得分，并依據評分大小對循環(huán)鹵煮牛肉樣品特征性風味強度進行評定，結果見表4。由表4可知，L1的F值最小為-0.79，L20的F值最高為0.48。

由圖2可知，各樣品組的第1主成分得分相差較小，L5和L10位置靠近，說明其揮發(fā)性風味成分相似，第5次和第10次鹵湯制作的鹵牛肉中揮發(fā)性風味物質變化緩慢，香味成分逐漸趨于穩(wěn)定。L1、L5、L10位于主成分2的負值區(qū)域，L15、L20 位于正值區(qū)域，5組循環(huán)鹵煮牛肉被主成分2明顯區(qū)分開來，表明鹵湯的鹵煮次數對鹵牛肉風味的影響較大。

2.3 循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味強度感官評分

由表5可知，鹵湯循環(huán)鹵煮的次數對牛肉的特征風味強度有較大影響，隨著循環(huán)鹵煮次數的增加，牛肉的特征風味強度評分上升。其中，循環(huán)鹵煮第20次的牛肉特征風味最強，但其評分與循環(huán)鹵煮第15次的較為接近，因此可以推斷鹵湯循環(huán)鹵煮次數達到第15次時，鹵牛肉特征風味已趨于穩(wěn)定，后續(xù)試驗可在循環(huán)第15次的條件下繼續(xù)改進。在循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味強度感官評分中，特征風味最強的為L20，最低的為L1，與模型評價的結果相似。

表4 循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味強度評分Table 4 Characteristic cycle spiced boiled beef flavor intensity grading

2.4 牛肉循環(huán)鹵煮過程中特征性風味主成分評分與感官評分的相關性分析

由表6可知，感官評分與F值之間的相關系數高達0.90，具有顯著相關性(P<0.05)，且二者排序均與模型相等，表明特征風味強度模型與感官評價法具有良好的一致性，表明采用主成分分析法初步構建牛肉特征性風味強度評價模型較為可靠和適用。

圖2 循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味主成分得分圖Figure 2 Principal component score map of characteristic Flavor of circulating boiled Beef

表5 循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味強度感官評價?Table 5 Cycle characteristic spiced boiled beef flavor intensity sensory evaluation results

表6 循環(huán)鹵煮牛肉感官評分與F值的Pearson相關性分析?

3 結論

為構建循環(huán)鹵煮牛肉的風味強度模型，對不同鹵煮次數鹵湯制作的鹵牛肉中的揮發(fā)性風味物質進行了測定，共檢測出64種風味物質，其中醛類物質相對含量最高，醇、酯、酮、酸、烴類物質次之。根據風味物質的相對氣味活度值所處范圍分析循環(huán)鹵煮牛肉的關鍵性風味物質，其中正己醛、十一醛、壬醛、正己醇、3-甲基戊烷、桉葉油醇、茴香腦等為循環(huán)鹵煮牛肉的關鍵性風味物質。同時采用主成分分析法對具有一定貢獻的風味物質進行分析，構建了循環(huán)鹵煮牛肉特征性風味強度評價模型為F=(0.52F1+0.26F2+0.13F3)/0.91，且與傳統感官評價結果具有顯著相關性，說明利用主成分分析法構建的循環(huán)鹵煮牛肉評價模型適用性較強，對后續(xù)感官評價結合儀器指標評價風味強度具有一定的參考價值。但由于影響牛肉特征性風味的因素較多，如牛肉的新鮮程度、牛肉鹵煮次數的梯度設置、鹵湯的品質問題等，后續(xù)可進一步細分梯度來提高循環(huán)鹵煮牛肉風味評價模型的精確性。