李萬榮 李 翼 舒 凌 楊 坤 辛?xí)匀?/p>

高原地區(qū)由于海拔高、氣壓低、溫度低、輻射強等特點形成了特殊的氣候環(huán)境，未經(jīng)習(xí)服者急進高原后受到低氧等因素的影響出現(xiàn)代償反應(yīng)不足或過強而發(fā)生習(xí)服不良，有出現(xiàn)高原反應(yīng)的可能性，嚴(yán)重時可易罹患急性高原病(AMS)，如高原肺水腫、高原腦水腫、高原視網(wǎng)膜病(HAR)等[1-5]，對機體產(chǎn)生一定影響，甚至威脅生命安全。此外，HAR在AMS進展中起到一定的警示作用，是高原腦水腫早期發(fā)現(xiàn)的“窗口”[6]。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延伸，視神經(jīng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)一樣對缺氧耐受性差，在急性低壓低氧狀態(tài)下會影響眼部血流調(diào)控，發(fā)生視網(wǎng)膜出血、視盤水腫、棉絮斑以及黃斑水腫等視網(wǎng)膜功能變化[5]。橙皮苷(HSD)屬于生物類黃酮糖苷，具有多種藥理學(xué)作用，包括抗脂質(zhì)氧化、清除氧自由基、抗菌、抗病毒、抗炎等作用[7-8]。此外，HSD還具有增加血流量，有效促進血管壁的力量和彈性、改善缺血缺氧，保護心血管以及神經(jīng)功能等作用[9-12]。我們以往的研究已提示，HSD通過激活核因子相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶1(HO-1)抗氧化通路、抗凋亡、抑制聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(PARP-1)和上調(diào)睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)表達(dá)而減輕低壓低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損害[13]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)探討HSD在低壓低氧所致大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害中的干預(yù)作用，進一步推測HSD可能通過提高大鼠視網(wǎng)膜抗氧化應(yīng)激能力、抑制炎癥介質(zhì)釋放以及減少線粒體損傷而發(fā)揮保護視網(wǎng)膜功能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法大鼠谷胱甘肽(GSH)試劑盒、半胱氨酸(Cys)試劑盒、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海滬宇生物)；核因子-κB p65(NF-κB p65)抗體、細(xì)胞色素C(Cyto-C)抗體(美國Proteintech Group公司)；HSD(上海Adamas-beta公司)；山羊抗兔二抗(美國Jackson Immuno Research公司)；BCA蛋白試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；ECL 發(fā)光液(上海Share-bio公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

1.1.2 實驗動物與分組選取健康雄性清潔級成年SD大鼠72只(144眼)，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供[實驗動物許可證號SCXK(陜)2018-001]，體重(200±20)g。所有動物實驗均按照國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》進行。SD大鼠經(jīng)過14 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機分成3組，即對照組、低壓低氧組、HSD干預(yù)組，每組各72只(144眼)，24只(48眼)。對照組大鼠在正常氧環(huán)境下喂養(yǎng)，低氧組和HSD干預(yù)組大鼠置于模擬海拔5000 m(氧分壓：78.98 mmHg；1 kPa=7.5 mmHg)環(huán)境的低壓氧艙(溫度：22～24 ℃，濕度：50%)，每天降艙后，加食、喂水。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式HSD干預(yù)組大鼠每天給予HSD(40 mg·kg-1)灌胃，對照組和低壓低氧組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

1.2.2 樣本取材各組大鼠在上述環(huán)境中喂養(yǎng)7 d后，用無菌注射器在腹腔內(nèi)注射100 g·L-1水合氯醛(每100 g注射0.35 mL)麻醉，麻醉完全后快速取出大鼠眼球并置于無菌操作冰臺上，體視顯微鏡下完整剝離視網(wǎng)膜，置入凍存管，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于ELISA及Western blot檢測。HE檢測組織病理學(xué)改變。

1.2.3 ELSIA檢測大鼠視網(wǎng)膜GSH、Cys、MDA和TNF-α表達(dá)取出按上述方法準(zhǔn)備的完整視網(wǎng)膜，稱取0.1 g視網(wǎng)膜組織并加入0.9 mL的無菌PBS液。用消毒后的無菌勻漿頭接近勻漿器底端后，充分勻漿為100 g·L-1勻漿液，ELISA測定大鼠視網(wǎng)膜GSH、MDA、Cys和TNF-α的表達(dá)。用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，分別包被GSH、MDA、Cys和TNF-α抗體的微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本、生物素化的檢測抗體、HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。酶標(biāo)儀450 nm波長下測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)說明書計算各樣本濃度。

1.2.4 Western blot檢測大鼠視網(wǎng)膜NF-κB p65和Cyto-C蛋白表達(dá)水平于造模后7 d分離大鼠視網(wǎng)膜組織，分別提取總蛋白并行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用NF-κB p65(11000)、Cyto-C(1500)抗體分別孵育后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(110 000)，孵育1 h進行蛋白檢測。蛋白條帶由ECL顯影，使用 Image J Software進行光密度分析蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HSD對低壓低氧所致大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)改變的影響HE組織學(xué)檢查顯示，與對照組相比，低壓低氧組大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫，以神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹、內(nèi)叢狀層及外叢狀層水腫為著；與低壓低氧組相比，HSD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜水腫程度減輕(圖1)。

圖1 HSD對低壓低氧所致大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)改變的影響 A:對照組；B:低壓低氧組；C:HSD組。

2.2 HSD對大鼠視網(wǎng)膜抗氧化防御能力的影響ELISA檢測結(jié)果表明，與對照組相比，低壓低氧組大鼠視網(wǎng)膜GSH與Cys蛋白濃度降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)。與低壓低氧組相比，HSD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜GSH蛋白濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；Cys蛋白濃度略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，低壓低氧組大鼠視網(wǎng)膜MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與低壓低氧組相比，HSD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜GSH、Cys蛋白濃度和 MDA含量

2.3 HSD對低氧介導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜炎癥介質(zhì)釋放的抑制作用Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組相比，低壓低氧組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB p65蛋白表達(dá)水平增加(P<0.01)；與低壓低氧組相比，HSD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HSD逆轉(zhuǎn)了低氧上調(diào)NF-κB p65的作用(圖2)。ELISA檢測大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α活性，結(jié)果表明，與對照組相比，低壓低氧組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與低壓低氧組相比，HSD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表2)。說明低壓低氧上調(diào)了大鼠視網(wǎng)膜NF-κB p65蛋白表達(dá)水平和TNF-α活性，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，HSD的干預(yù)抑制了低氧對視網(wǎng)膜炎癥介質(zhì)的調(diào)控而發(fā)揮保護視網(wǎng)膜功能的作用。

圖2 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB p65蛋白的表達(dá) A：各組NF-κB p65蛋白表達(dá)電泳圖。B：NF-κB p65 蛋白的光密度分析，與對照組相比,**P<0.01；與低壓低氧組相比,&P<0.05。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α活性

2.4 HSD抑制低壓低氧導(dǎo)致的Cyto-C上調(diào)Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組相比，低壓低氧組大鼠視網(wǎng)膜Cyto-C蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與低壓低氧組相比，HSD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜Cyto-C蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。提示HSD能夠通過下調(diào)Cyto-C的表達(dá)保護大鼠視網(wǎng)膜線粒體功能而減少氧化應(yīng)激損害。

圖3 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜Cyto-C蛋白的表達(dá) A：各組Cyto-C蛋白表達(dá)電泳圖。B：Cyto-C蛋白的光密度分析，與對照組相比,**P<0.01；與低壓低氧組相比,&P<0.05。

3 討論

視網(wǎng)膜新陳代謝活躍，耗氧量高，富含多不飽和脂肪酸，對氧化應(yīng)激反應(yīng)特別敏感[14]，受氧化應(yīng)激損傷后，引起過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜病理性損害[15]。我們前期研究結(jié)果提示，低壓低氧激活凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過抑制Nrf2/HO-1信號通路上調(diào)DNA損傷修復(fù)酶，影響視網(wǎng)膜線粒體及DNA功能，導(dǎo)致視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害，引起視網(wǎng)膜病理性改變；HSD通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路、抑制凋亡和調(diào)節(jié)PARP-1的活性而減輕低壓低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損害[13,16-18]。本研究我們分析了HSD在低壓低氧對視網(wǎng)膜內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)和炎癥介質(zhì)影響中的干預(yù)作用。

本研究通過低壓氧艙模擬了5000 m海拔的高原環(huán)境。光鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)改變，低壓低氧組大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫，以神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹，內(nèi)叢狀層、外叢狀層水腫為著，提示視網(wǎng)膜對缺氧敏感，低壓低氧引起視網(wǎng)膜供氧量減少而影響視網(wǎng)膜功能。GSH和Cys的活力能夠反映機體的自由基代謝狀況以及組織細(xì)胞的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，低壓缺氧使大鼠視網(wǎng)膜組織的GSH蛋白濃度降低，表明高海拔急性缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜組織中自由基產(chǎn)生過多，降低了視網(wǎng)膜GSH與Cys蛋白濃度，視網(wǎng)膜清除自由基和抗氧化能力下降加劇了視網(wǎng)膜的低氧損傷。作為氧化應(yīng)激的分子生物學(xué)標(biāo)志物，MDA是評價細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要參數(shù)[19-20]，本研究中低壓低氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜GSH和Cys的蛋白濃度下降、MDA含量升高，提示急進低壓低氧環(huán)境的大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生了氧化應(yīng)激損害，HSD能夠通過增加GSH蛋白濃度，降低MDA含量提高視網(wǎng)膜抗氧化應(yīng)激能力。有關(guān)大鼠視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷的研究表明，隨著氧化應(yīng)激損傷加重，視網(wǎng)膜內(nèi)MDA含量由于抗氧化防御能力如GSH的下降而升高[21]。本研究中HSD通過上調(diào)抗氧化基因GSH蛋白濃度，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，提高視網(wǎng)膜細(xì)胞抗氧化能力，減輕缺氧所致的大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激，從而保護視網(wǎng)膜功能。

本研究中Western blot檢測結(jié)果表明，低壓低氧增加了Cyto-C蛋白表達(dá)水平，HSD的干預(yù)抑制了Cyto-C蛋白的表達(dá)。視網(wǎng)膜和大腦一樣代謝非常旺盛，對缺氧耐受較差，易受急性缺氧的影響，引起能量代謝障礙而影響視網(wǎng)膜細(xì)胞活性[22]。視網(wǎng)膜細(xì)胞含豐富的線粒體，低壓缺氧誘發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，大量活性氧(ROS)產(chǎn)生[23-24]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致氧自由基過度表達(dá)使線粒體膜發(fā)生去極化，破壞線粒體外膜，使線粒體內(nèi)膜超極化，引起線粒體滲透性擴張，使Cyto-C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[24-25]。一項高海拔低氧所致腦損傷研究結(jié)果表明，低氧通過線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡通路啟動凋亡，增加了Cyto-C蛋白表達(dá)，降低GSH水平，提高了MDA含量，導(dǎo)致大鼠腦損傷[26]，這與我們以往研究及本研究結(jié)果相一致[13]。我們前期研究結(jié)果表明，低壓低氧激活PARP-1[13]，PARP-1能夠結(jié)合損害的DNA，消耗NAD+導(dǎo)致 ATP 減少，由此引起細(xì)胞能量減少，線粒體功能失調(diào)和細(xì)胞壞死[27-28]。我們發(fā)現(xiàn)HSD能夠逆轉(zhuǎn)低壓低氧所致Cyto-C的上調(diào)，可能通過HSD對PARP-1的活性調(diào)節(jié)，使PARP-1失活，阻斷低壓低氧應(yīng)激中Cyto-C蛋白的過度表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)NAD+水平而保護視網(wǎng)膜功能。

本研究中低壓低氧上調(diào)了NF-κB p65蛋白表達(dá)水平和TNF-α的活性。NF-κB p65是從B淋巴細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的核蛋白因子，在協(xié)助調(diào)控編碼多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、黏附因子以及參與機體的生長發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用，并調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥、免疫等病理過程[29]。有研究表明，低壓低氧通過NF-κB/VEGF/基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)通路增加了NF-κB、TNF-α、MMP-9等的表達(dá)，引起血-腦屏障功能障礙，誘導(dǎo)腦水腫并促發(fā)炎癥反應(yīng)[30]。另外一項研究提示，視網(wǎng)膜缺血-再灌注通過刺激TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而影響血-視網(wǎng)膜屏障[21]。激活NF-κB信號導(dǎo)致大量炎癥因子釋放[30]，炎癥觸發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與NF-κB信號通路密切相關(guān)。我們以往研究已表明，低壓缺氧可上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)[16]。HIF-1α介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可激活NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[31]，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α及其他炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)[29]，TNF-α可直接損害視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白，影響血-視網(wǎng)膜屏障的完整性[32-34]。因此，抑制NF-κB 活性可減少HIF-1α的表達(dá)和TNF-α的產(chǎn)生[35]。我們進一步分析了低氧應(yīng)激下HSD對NF-κB p65蛋白表達(dá)和TNF-α活性的影響，結(jié)果表明，HSD干預(yù)能夠抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)水平和TNF-α的活性，可能通過下調(diào)炎癥介質(zhì)蛋白水平而減輕低壓低氧所致的大鼠視網(wǎng)膜損害。

本研究結(jié)果提示，低壓低氧對大鼠視網(wǎng)膜產(chǎn)生病理損害，HSD通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)、調(diào)控炎癥介質(zhì)和維護線粒體功能而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，有效減輕低壓低氧導(dǎo)致的視網(wǎng)膜功能損害。因此,HSD在減輕低壓低氧所致的視網(wǎng)膜功能失調(diào)中有望成為具有前景的治療藥物。