張心予，張?zhí)m俊,張玉，陳煉紅*

1(西南民族大學 食品科學與技術學院，四川 成都，610041)2(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)

牦牛是我國西部青藏高原特有的新型牧畜品種，主要分布地區(qū)有西藏、青海和四川等[1]。牦牛乳是營養(yǎng)豐富的優(yōu)質乳資源，以其為原料制得的半硬質干酪風味濃郁，營養(yǎng)價值高，是一種高原綠色食品[2-3]。

干酪成熟伴隨著一系列復雜生化反應的發(fā)生，對干酪質地和風味的形成影響重大。蛋白質經酶作用降解，所生成的一些小肽和氨基酸是特定風味物質的前體，或直接形成干酪的風味[4]；乳糖在發(fā)酵劑作用下經糖酵解途徑產生乳酸；脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醛類、醇類等一系列化合物[5]。隨著干酪成熟時間的延長，干酪的氣味和滋味發(fā)生改變，KARAMETSI等[6]發(fā)現(xiàn)，隨著成熟期的延長，苦味肽增加，干酪的苦味增強。程晶晶等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨著干酪成熟時間的延長，咸味、苦味、堅果味、乳脂味呈增加趨勢，澀味、酸奶味、酸味、蒸煮味呈降低趨勢。

干酪成熟期通常較長，如半硬質干酪成熟時間為90～180 d，硬質干酪成熟期則長達數(shù)年[8-9]。牦牛乳半硬質干酪具有較長成熟期，在實際生產中成本高且難以控制產品品質[4]。國內外學者在研究干酪促成熟時關注點在于僅改變一種成熟條件(溫度、壓力、發(fā)酵劑等)[10]。綜合多因素對干酪促成熟工藝進行優(yōu)化這一方面研究鮮少，且對促成熟后牦牛乳半硬質干酪的成熟特性及揮發(fā)性物質變化研究尚為空白。

實驗前期對殼聚糖-海藻酸鈉固定化酶的制作工藝進行優(yōu)化[11]，進而選用添加固定化酶、高壓處理、改變成熟溫度3種因素優(yōu)化牦牛乳半硬質干酪促成熟工藝，得到最佳工藝條件為殼聚糖-海藻酸鈉固定化酶添加量1 200 U/kg，高壓1 kPa，成熟溫度10 ℃。本試驗在此基礎上研究促成熟工藝對牦牛乳半硬質干酪成熟特性(質構指標、水分含量、pH、脂肪分解指標、微生物指標)的影響，并采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(solid-phase micro-extraction-GC-MS，SPME-GC-MS)對干酪成熟各階段風味物質的變化進行探究，進而結合各項指標的變化確定最佳成熟期，在理論及技術上為縮短牦牛乳半硬質干酪成熟期和生產品質把控提供了保證，促進牦牛乳資源的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳，四川省紅原縣哈拉瑪村麥洼牦牛(海拔3 800 m)；R-704菌種、小牛皺胃酶(1 400 U/g)，丹麥Chr.Hansen公司；氯化鈣、氯化鈉、氫氧化鈉、酚酞、乙醇、石油醚、乙醚、氫氧化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、營養(yǎng)瓊脂、MRS瓊脂為分析純，成都康迪生物有限公司。

LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海市精密儀器儀表公司；SPX-150電熱恒溫生化培養(yǎng)箱，上海市左樂儀器有限公司；MP512-02精密pH計，德國Matthaus公司；JOYN-SXT-6B 粗脂肪自動測定儀，上海市喬躍儀器有限公司；TMS-PRO食品物性分析儀，美國FTC公司；GCMS-QP2010,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛乳半硬質干酪促成熟工藝

促成熟牦牛乳半硬質干酪促成熟工藝如下：

原料乳驗收→標準化→巴氏殺菌(65 ℃，30 min)→冷卻(32 ℃)→發(fā)酵劑發(fā)酵→殼聚糖-海藻酸鈉固定化中性蛋白酶(添加量：1 200 U/kg)→添加0.2 g/L氯化鈣→添加0.04 g/L凝乳酶→靜置凝乳、切割→升溫攪拌→乳清排出→壓榨成型→鹽漬→真空包裝→高壓處理(1 kPa)→成熟(10 ℃)

未處理干酪：參考劉興龍等[12]方法制作，即不添加固定化酶、無高壓處理、4 ℃冰箱貯存。

試驗以促成熟處理的牦牛乳半硬質干酪作為實驗組，未處理干酪為對照組，在成熟的第20、40、60、80天分別對兩組干酪進行質構及理化指標的測定，每組干酪平行測定3次。

1.2.2 牦牛乳半硬質干酪成熟期間全質構分析(texture profile analysis，TPA)

參照陳衛(wèi)等[13]方法測定牦牛乳半硬質干酪硬度、黏性、彈性、凝聚性和咀嚼性。食品物性分析儀測定參數(shù)：負載類型Auto-5 g；測試速度1 mm/s；下壓距離10 mm；保持時間0 s；探頭回復速度1 mm/s；探頭P/0.5；樣品尺寸(長×寬×高)為5 cm×5 cm×3 cm。

1.2.3 牦牛乳半硬質干酪成熟期間理化指標測定

1.2.3.1 水分含量測定

水分含量測定依據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》。

1.2.3.2 pH測定

參考騰軍偉等[14]方法，準確稱取10 g研磨過的干酪粉末，加入20 mL蒸餾水，均質2 min后用pH計進行檢測。

1.2.3.3 粗脂肪含量的測定

粗脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中粗脂肪的測定》。

1.2.3.4 脂肪氧化分解指標的測定

酸價(acid value，ADV)的測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》；脂肪過氧化值(peroxide value，POV)的測定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》。

1.2.3.5 微生物指標測定

乳酸菌活菌數(shù)含量和菌落總數(shù)含量的測定分別參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》，GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.2.4 干酪成熟期間揮發(fā)性風味物質的變化

采用頂空SPEM-GC-MS技術探究實驗組及對照組牦牛乳半硬質干酪成熟期間(20、40、60、80 d)揮發(fā)性風味物質的變化。

1.2.4.1 SPME條件

稱取5 g樣品于20 mL頂空瓶中，將已老化的萃取頭插入頂空瓶80 ℃吸附30 min，250 ℃解吸5 min，用于GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS條件

測定條件參考牛婕等[15]方法，并稍作修改。色譜條件：色譜柱為DB-Wax毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣He流速1 mL/min。色譜升溫程序：柱始溫度40 ℃維持3 min，以5 ℃/min的速度升到250 ℃，維持3 min。質譜條件：電子電離源(EI)，電子能量70 eV，質量掃描范圍40～650 u；全掃描模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各試驗數(shù)據(jù)均為3次重復測定，用平均值±標準差表示；使用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理分析；采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中TPA的變化

質構指標用于評價干酪成熟過程中口感及品質的變化。由表1可知，隨著成熟進行，實驗組與對照組牦牛乳半硬質干酪的質構特性有明顯差異(P<0.05)。實驗組干酪成熟初期由于高壓處理時水分被擠壓排出，導致硬度遠大于對照組。40 d后實驗組的硬度明顯降低(P<0.05)，是由于在成熟階段蛋白質和脂肪逐漸分解，產生水分使質地變軟。而對照組干酪硬度20 d后無明顯變化(P>0.05)，表明成熟速度較為緩慢。干酪成熟40～60 d大分子營養(yǎng)素降解成小分子物質，各組分作用力趨于穩(wěn)定和平衡，實驗組的黏性與彈性相比于對照組呈上升趨勢，凝聚性逐漸下降，咀嚼性在40 d后顯著下降(P<0.05)，表明促成熟處理加快了蛋白質、脂肪等大分子物質的降解，提高了成熟速度，提升干酪品質。

表1 牦牛乳半硬質干酪不同成熟時間質構特性變化Table 1 Changes in the texture characteristics of yak milk semi-hard cheese at different ripening times

2.2 牦牛乳半硬質干酪成熟期間理化指標的變化

2.2.1 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中水分含量的變化

如圖1所示，水分含量隨時間的增加而減少，40～60 d實驗組下降顯著(P<0.05)，對照組不顯著(P>0.05)。這是由于在干酪成熟過程中隨著各種大分子分解為小分子物質時，網絡狀結構的破壞使結合水流失。促成熟處理(升溫、高壓)加快了實驗組干酪大分子降解速率，在同一時間段內水分減少量大于對照組。

圖1 成熟過程中水分含量的變化Fig.1 Changes in moisture content during ripening注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中pH值的變化

如圖2所示，牦牛乳半硬質干酪成熟期間pH值不斷升高，0～40 d增長緩慢(P>0.05)，40 d后pH值增長顯著(P<0.05)。這是由于乳糖在成熟初期不斷分解產生的乳酸中和了蛋白質分解產生的堿性氨基。隨著乳糖在成熟中后期的逐漸消耗，乳酸生成減少，干酪pH值呈上升趨勢。

圖2 成熟過程中pH值的變化Fig.2 Changes in pH value during ripening

2.2.3 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中粗脂肪含量的變化

干酪成熟過程中脂肪的降解是形成特征風味的關鍵反應。由圖3可知，隨著成熟時間的延長，兩組粗脂肪含量均呈下降趨勢，實驗組下降速率更快。原因在于實驗組中加入的外源酶在早期階段加速了脂肪酶對脂肪的降解，且高壓、升溫處理加快了生化反應的速度，而對照組由于含水量較低未能充分水解。由此可見，促成熟處理提高了牦牛乳半硬質干酪脂肪分解程度和分解速率，縮短成熟時間。

圖3 成熟過程中粗脂肪含量的變化Fig.3 Changes in crude fat content during ripening

2.2.4 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中ADV的變化

如圖4所示，牦牛乳半硬質干酪ADV隨成熟時間的增加不斷上升，實驗組40 d的ADV與對照組80 d相當。成熟初期部分脂肪酸被乳酸菌生長繁殖所消耗，致使對照組ADV前期增長較平緩。而實驗組由于加快了脂肪分解使得變化顯著(P<0.05)；成熟后期干酪外殼的形成干擾了游離脂肪酸的擴散，因此實驗組ADV后期增長不顯著(P>0.05)。

2.2.5 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中POV的變化

由圖5所示，兩組干酪POV變化均為前期慢后期快，且實驗組POV高于對照組。由于本試驗干酪放置在真空袋中避光貯存，避免了因受到氧氣和光照影響導致的POV升高現(xiàn)象。在成熟初期一級氧化產物不斷積累生成游離脂肪酸，成熟40 d后逐漸分解為其他揮發(fā)性特征風味物質。

圖4 成熟過程中ADV的變化Fig.4 Changes in ADV during ripening

圖5 成熟過程中POV的變化Fig.5 Changes in POV during ripening

2.2.6 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中微生物指標的變化

2.2.6.1 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中乳酸菌總數(shù)的變化

乳酸菌會將大分子營養(yǎng)物質如碳水化合物、脂肪等降解利用，且自身的增殖發(fā)酵作用會產酸，賦予干酪特有的風味。如圖6所示，實驗組乳酸菌活菌數(shù)隨天數(shù)的延長不斷下降，且在40 d后下降顯著(P<0.05)。原因在于隨著成熟時間延長乳酸菌活性降低，且由上述分析可知，實驗組干酪在40 d后水分含量降低、營養(yǎng)物質分解加快，不利于乳酸菌生長繁殖。

圖6 成熟過程中乳酸菌總數(shù)的變化Fig.6 Changes in the total number of lactic acid bacteria during ripening

2.2.6.2 牦牛乳半硬質干酪成熟過程中菌落總數(shù)的變化

如圖7所示，兩組干酪菌落總數(shù)均隨著時間的延長不斷降低，成熟初期下降顯著(P<0.05)，40 d后隨著干酪內生化反應的減弱，菌落總數(shù)下降緩慢。實驗組干酪菌落總數(shù)減少量大于對照組，原因是干酪成熟過程的溫度始終控制在10 ℃以下，并且進行高壓處理降低了水分含量，破壞了有害微生物的生長環(huán)境；其次在鹽漬階段鹽分會滲入干酪內部，高鹽分的環(huán)境會有一定程度的抑菌作用。

圖7 成熟過程中菌落總數(shù)的變化Fig.7 Changes in the total number of colonies during ripening

2.3 促成熟牦牛乳半硬質干酪成熟過程中揮發(fā)性風味物質的變化

促成熟工藝處理后的牦牛乳半硬質干酪成熟期間(20、40、60、80 d)揮發(fā)性風味物質種類和含量變化結果見表2。

表2 促成熟牦牛乳半硬質干酪成熟過程中產生的 揮發(fā)性風味物質 單位：%(相對含量)

續(xù)表2

由表2可知，經最佳促成熟工藝處理的牦牛乳半硬質干酪在成熟期間共檢測到66種揮發(fā)性風味物質，包括酯類29種，酸類17種，酮類9種，醇類5種，烴類4種，其他類物質2種。干酪成熟期間所有檢出物中酸類物質相對含量最高，酯類其次，牦牛乳半硬質干酪的風味主要受脂肪代謝形成的酸、醇、酯等揮發(fā)性物質的影響，這與王寵等[16]研究結論一致。

2.3.1 酸類揮發(fā)性風味物質變化

酸類化合物主要來源于干酪成熟過程中的重要生化反應脂肪水解及乳糖發(fā)酵[17]。經促成熟處理牦牛乳半硬質干酪成熟期間產生的酸類物質居各類風味物質首位，相對含量呈先升后降趨勢，對牦牛乳半硬質干酪的特征風味形成有較大貢獻。成熟40 d酸類物質含量最高82.28%，成熟80 d含量下降至75.41%，表明牦牛乳半硬質干酪整個成熟過程中脂肪的分解不斷進行，且速率高于對照組，與前面粗脂肪含量變化一致，促成熟處理效果顯著。在整個成熟期間均檢測到丁酸、己酸、辛酸、葵酸4種短鏈脂肪酸，對干酪的特殊風味貢獻大[18]。丁酸賦予干酪淡淡的奶油香氣，促成熟干酪中丁酸含量超50%，40 d時含量達60.12%，可將其作為特殊的優(yōu)勢風味物質。己酸產生輕微腐臭氣味，辛酸使干酪?guī)в形⑷醯墓嵛?，經測定二者含量均隨成熟時間增加而增加，使長期存放的干酪產生酸敗的氣味，感官品質下降。因此在把控牦牛乳半硬質干酪品質時要注意減少己酸、辛酸的生成。

2.3.2 酯類揮發(fā)性風味物質變化

酯類化合物是重要的香味化合物，大多數(shù)酯類給奶酪?guī)砹讼闾鸬乃銡?，從而緩解短鏈酸引起的尖銳感覺，軟化整體風味[19]。脂肪酸與醇發(fā)生的酯化反應為干酪提供了大量酯類物質。反應產生的甲基或乙基酯是干酪水果風味的主要來源，例如丁酸乙酯有甜果香；癸酸乙酯具有明顯的椰子香味[20]。促成熟牦牛干酪在40～60 d酯類相對含量明顯增加，其中丁酸丁酯為優(yōu)勢呈香風味物質。隨著成熟時間的延長，促成熟處理有利于丁酸丁酯、己酸丁酯、癸酸乙酯等物質的產生，對干酪良好風味的形成起正面作用。

2.3.3 醇類及酮類揮發(fā)性風味物質變化

醇類化合物產生的主要途徑是乳糖代謝、亞麻酸、亞油酸的降解、氨基酸代謝及甲基酮降解等[7]。因其風味閾值高，對牦牛乳半硬質干酪整體風味影響小。促成熟牦牛乳半硬質干酪中主要的揮發(fā)性醇類物質有乙醇、1-丁醇和苯乙醇。成熟60 d實驗組與20 d相比1-丁醇含量有所增加，高達9.55%。而成熟至80 d時醇類物質轉變?yōu)轷ヮ?、酮類物質，含量有所下降。

酮類化合物感官閾值低，能賦予干酪濃郁的奶油香味，對干酪的揮發(fā)性風味起重要作用[21]。由表2可以發(fā)現(xiàn)經過促成熟的干酪酮類物質的相對含量明顯增加，成熟期間呈現(xiàn)上升趨勢。檢測到的酮類揮發(fā)性成分以甲基酮類化合物為主，如2-丁酮、2-庚酮、2-壬酮等。此類物質大多伴有令人愉悅的水果清香及奶油味，可適度改善牦牛乳半硬質干酪的感官品質[22]。

2.3.4 烴類及其他類揮發(fā)性風味物質變化

烴類化合物及其他類化合物在檢出物中相對含量極少。烴類物質芳香閾值較高，風味活性低，對干酪的呈味作用有限。后期產生的微量苯酚可能是由于酪氨酸分解所致，具有防腐和殺菌作用，有利于干酪品質的穩(wěn)定[23]。

3 結論

牦牛乳半硬質干酪的質構和理化特性受促成熟處理的影響有所變化。隨著成熟時間的延長，促成熟干酪的硬度、凝聚性、咀嚼性有所下降，黏性、彈性增加，40～60 d變化更明顯；水分含量逐漸降低，pH值升高，脂肪由于微生物的分解數(shù)量下降，在酸價以及過氧化值的含量上均高于對照組干酪，說明促成熟后脂肪的分解程度更高、成熟效果更好，成熟40～60 d 營養(yǎng)成分均達較高標準；采用SPME-GC-MS法檢測發(fā)現(xiàn)，促成熟干酪成熟期間產生的66種風味物質包含酯類、酸類、醇類、酮類、烴類和其他雜環(huán)化合物等，其中酯類的數(shù)量最多、酸類的相對含量最大，丁酸、丁酸丁酯為牦牛乳半硬質干酪的特征風味物質，且經促成熟的干酪酸類、酮類、醇類物質相對含量顯著增加。綜合比較促成熟牦牛乳半硬質干酪成熟期間各項指標的大小及變化趨勢可知，經促成熟處理的牦牛乳半硬質干酪具有良好的成熟效果，可將半硬質干酪半年成熟期縮短至40～60 d。