唐永靜，陳云芬，廖月，程其嬌，張桂娟，王云，何毅懷△

重癥肝病在我國較為常見，其病死率高，預后差［1］。大范圍肝細胞的急性損傷（如細胞凋亡）是引起肝損傷進展的機制之一［2］。肝損傷進展受多種因素影響，包括合并細菌感染、高載量乙肝病毒感染等。有研究表明，內毒素血癥與肝損傷進展關系密切，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為內毒素的主要成分，在內毒素血癥中起著重要作用［3］。LPS與D-氨基半乳糖聯(lián)合，常被用于建立實驗性肝衰竭小鼠模型。本課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，LPS引起肝損傷的使用劑量尚無統(tǒng)一標準，正常狀態(tài)下大量LPS才能引起肝損傷，但是在肝損傷的基礎上，非肝毒性劑量LPS將加劇肝損傷。這一發(fā)現(xiàn)與文獻［4-5］報道相一致，提示肝臟的基礎疾病可能增加肝臟對內毒素血癥的敏感性，肝臟損傷程度越重，其對內毒素血癥的損傷作用反應越敏感，但具體機制不詳。肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4α）作為肝細胞富集的重要轉錄因子，與肝細胞的抗損傷反應密切相關［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可顯著下調大鼠肝臟中HNF4α的表達［7］；而在肝癌中條件性上調HNF4α表達可抑制LPS誘導的細胞凋亡［8］，提示HNF4α表達水平可在一定程度上反映肝臟對內毒素血癥的敏感性。本研究旨在探索內毒素血癥中HNF4α表達的變化特點、對肝細胞凋亡的作用及在肝損傷中的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性BALB/c小鼠144只，6～8周齡，平均體質量（25±4）g，購自遵義醫(yī)科大學動物實驗中心［動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（黔）2021-0004］。將所有動物置于溫度（21.0±2.0）℃，濕度65%±5%條件下自由進食飲水，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。實驗小鼠的使用遵循《實驗動物管理條例》［9］及遵義醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定［倫審（2020）2-321號］。

1.1.2主要設備和試劑全自動曝光機（Clinx，ChemiScope 6000，中國），全自動生化分析儀（Beckman Coulter autoanalyzer，AU5800，美國）。裂解液（R0010，Solarbio，北京）；鼠單 克 隆β-actin內 參 蛋 白（sc-58673，Santa Cruz Biotechnology）、鼠 單 克 隆HNF4α（ab41898，Abcam，Cambridge，MA，USA）、兔單克隆胱天蛋 白酶3剪切體（Cleaved caspase-3，9664，CST）。辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗小鼠IgG二抗（sc-516102，Santa Cruz，USA）或抗兔IgG二抗（sc-2357，Santa Cruz）。

1.2動物分組和建模方法小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將小鼠分組。每組誘導12只小鼠，均給藥1次，注射前禁飲禁食6 h。誘導時間為24 h。

1.2.1CCl4誘導小鼠急性肝損傷CCl4組：分別腹腔注射0.5、1.0、2.0 mL/kg CCl4（按CCl4折算；CCl4與橄欖油按體積比為1∶4混合，0.22 μm濾菌器濾菌，4～8℃保存）。對照組：腹腔注射等體積橄欖油（0.22 μm濾菌器濾菌，4～8℃保存）。

1.2.2LPS誘導小鼠急性肝損傷LPS組：分別腹腔注射LPS，劑量為非肝毒性劑量（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg）、肝毒性劑量（2.5 mg/kg，10 mg LPS溶于50 mL的PBS中；0.22 μm濾菌器濾菌，-20℃冰箱保存）。對照組：腹腔注射等體積

PBS。

1.2.3LPS干預CCl4誘導急性肝損傷模型小鼠CCl4組：腹腔注射1.0 mL/kg CCl4；LPS+CCl4組：分別腹腔注射0.1 mg/kg、0.5 mg/kg LPS預處理2 h，均給藥1次；然后腹腔注射1.0 mL/kg CCl4。對照組：腹腔注射等體積橄欖油或PBS。

1.2.4標本收集與處理建模24 h后將小鼠置于有4 L CO2的安樂死盒中，待其失去知覺后，維持血液循環(huán)的同時收集血液和肝組織樣本。將收集到的血液標本3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于4℃冰箱過夜。取50 mg肝組織置于裂解液進行細胞裂解，置于-80℃冰箱保存；1 cm3大小的肝組織樣本置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后切成5 μm厚的組織切片，置于切片盒室溫保存。

1.3指標檢測與方法

1.3.1肝功能的檢測采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉氨酶（ALT，速率法）及血清總膽紅素（TBil，重氮法）水平。

1.3.2蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白的表達將各組小鼠50 mg肝組織加入5 mL裂解緩沖液［含50 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］，4℃下進行細胞裂解，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量。樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，然后按照凝膠面積以0.65 mA/cm2恒流電轉移1.5 h將蛋白自凝膠轉印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的β-actin、HNF4α、Cleaved caspase-3一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的HRP抗小鼠IgG二抗或抗兔IgG二抗孵育2 h，漂洗后滴加ECL化學發(fā)光試劑于全自動曝光機中顯影，利用Image J軟件分析條帶灰度值，計算HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白與β-actin的比值。實驗重復3次。

1.3.3原位末端標記法檢測細胞凋亡情況各實驗組小鼠肝組織石蠟切片分別經(jīng)過脫蠟、脫水、去除組織蛋白、破膜后，取脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）與脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛按體積比1∶14混合，滴到肝組織上，保持濕盒內濕度，37℃孵育2 h。紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm；FITC綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm。細胞核在DAPI染色后在紫外線下呈藍色，F(xiàn)ITC熒光素標記的陽性凋亡細胞核呈綠色。切片通過全息掃描（Pannoramic DESK/MIDI/250/1000，3DHISTECH，Hungary）及CaseViewer 2.3軟件（3DHISTECH，Hungary）采集圖像。每張切片高倍鏡下隨機讀取5個視野，計算細胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊組間多重比較行LSD-t檢驗；若方差不齊組間多重比較行Tamhane′s T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCl4對小鼠肝損傷及細胞凋亡的影響0.5、1.0、2.0 mL/kg CCl4組小鼠的血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯高于對照組，且均呈劑量依賴性增高（均P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of CCl4表1不同劑量CCl4誘導組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平比較（±s）

Tab.1 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of CCl4表1不同劑量CCl4誘導組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與0.5 mL/kg CCl4組比較，c與1.0 mL/kg CCl4組比較，P＜0.05。

組別對照組0.5 mL/kg CCl4組1.0 mL/kg CCl4組2.0 mL/kg CCl4組F n 12 12 12 12 ALT（U/L）42.08±5.53 2 496.25±202.35a 4 458.00±506.94ab 6 502.08±599.06abc 493.724＊＊TBil（μmol/L）1.28±0.15 1.93±0.17a 4.45±0.27ab 6.35±0.69abc 404.139＊＊組別對照組0.5 mL/kg CCl4組1.0 mL/kg CCl4組2.0 mL/kg CCl4組F HNF4α 1.00±0.00 1.95±0.05a 6.46±0.25ab 11.48±0.43abc 4 020.010＊＊Cleaved caspase-3 1.00±0.00 1.71±0.11a 5.55±0.21ab 8.48±0.16abc 6 745.702＊＊

Fig.1 Western blot detection of HNF4α and Cleaved caspase-3 protein expression in liver tissue induced by different doses of CCl4圖1 Western blot檢測不同劑量CCl4誘導組肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達

2.2 LPS對小鼠肝損傷及細胞凋亡的影響2.5 mg/kg LPS組小鼠血清ALT、TBil水平及肝組織Cleaved caspase-3蛋白表達水平高于對照組、0.1 mg/kg LPS組、0.5 mg/kg LPS組，肝組織HNF4α蛋白表達水平低于對照組、0.1 mg/kg LPS組、0.5 mg/kg LPS組（P＜0.05）；對照組、0.1 mg/kg LPS組、0.5 mg/kg LPS組間差異均無統(tǒng)計學意義，見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of LPS表2不同劑量LPS組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平比較（±s）

Tab.2 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of LPS表2不同劑量LPS組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與0.1 mg/kg LPS組比較，c與0.5 mg/kg LPS組比較，P＜0.05。

組別對照組0.1 mg/kg LPS組0.5 mg/kg LPS組2.5 mg/kg LPS組F HNF4α 1.00±0.00 0.94±0.10 0.86±0.07 0.47±0.03abc 156.332＊＊Cleaved caspase-3 1.00±0.00 1.06±0.10 2.44±0.14 7.40±0.16abc 7 022.815＊＊組別對照組0.1 mg/kg LPS組0.5 mg/kg LPS組2.5 mg/kg LPS組F n 12 12 12 12 ALT（U/L）32.92±5.89 37.67±9.12 53.33±8.51 5 725.50±109.62abc 29 112.963＊＊TBil（μmol/L）1.18±0.29 1.48±0.21 1.50±0.21 5.44±0.22abc 836.544＊＊

2.3 LPS及CCl4對小鼠肝損傷及肝細胞凋亡的影響CCl4組、0.1 mg/kg LPS+CCl4組和0.5 mg/kg LPS+CCl4組小鼠血清ALT、TBil水平，肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數(shù)均高于對照組（P＜0.05）。0.1 mg/kg LPS+CCl4組和0.5 mg/kg LPS+CCl4組小鼠血清ALT、TBil水平，肝組織Cleaved caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數(shù)均高于CCl4組，HNF4α蛋白表達水平低于CCl4組（P＜0.05）；0.5 mg/kg LPS+CCl4組與0.1 mg/kg LPS+CCl4組間差異無統(tǒng)計學意義，見表3，圖3、4。

Fig.2 Western blot detection of HNF4α and Cleaved caspase-3 protein expression in liver tissue induced by different doses of LPS圖2 Western blot檢測不同劑量LPS誘導組肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達

Tab.3 Comparison of serum ALT and TBil levels,protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue and apoptotic index between the four groups表3各組血清ALT、TBil水平，肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

Tab.3 Comparison of serum ALT and TBil levels,protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue and apoptotic index between the four groups表3各組血清ALT、TBil水平，肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CCl4組比較，P＜0.05。

組別對照組CCl4組0.1 mg/kg LPS+CCl4組0.5 mg/kg LPS+CCl4組F n 12 12 12 12 ALT（U/L）34.75±2.24 3 412.08±122.68a 5 683.00±177.65ab 6 269.92±98.71ab 6 236.269＊＊TBil（μmol/L）1.26±0.26 3.38±0.29a 5.40±0.20ab 6.28±0.16ab 1 011.176＊＊組別對照組CCl4組0.1 mg/kg LPS+CCl4組0.5 mg/kg LPS+CCl4組F HNF4α 1.00±0.00 3.41±0.26a 2.45±0.14ab 1.55±0.08ab 513.070＊＊Cleaved caspase-3 1.00±0.00 2.29±0.15a 2.78±0.23ab 3.23±0.31ab 238.550＊＊凋亡指數(shù)0.52±0.11 27.58±0.83a 31.93±0.73ab 36.71±0.82ab 6 101.197＊＊

Fig.3 Western blot detection of HNF4α and Cleaved caspase-3protein levels in liver tissue of mice圖3 Western blot檢測各組小鼠肝臟HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達水平

Fig.4 TUNEL detection of hepatocyte apoptosis of mice in each group(×20)圖4原位末端標記染色檢測各組小鼠肝細胞凋亡情況（×20）

3 討論

肝臟損傷與代謝紊亂、飲酒、肝炎病毒感染等多種因素有關，如合并細菌感染會顯著加重肝臟損傷，但其具體機制尚未明確［10-11］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶（PERK）-磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α）信號通路可通過抗肝細胞凋亡減輕小鼠肝損傷［2］，與文獻［12-13］報道一致。有研究表明，肝損傷時，將觸發(fā)內質網(wǎng)（ER）應激，激活PERK、活化轉錄因子6（ATF6）和需肌醇酶1α（IRE1α）以阻礙蛋白質合成，減輕肝臟負荷，促進細胞存活［14］。一旦ER穩(wěn)態(tài)受到破壞，ER應激將觸發(fā)促凋亡信號，凋亡的激活受多種信號通路共同影響。目前主要有3條凋亡途徑：C/EBP同源蛋白（CHOP）基因的激活轉錄、Jun-氨基末端激酶（JNK）的激活通路及內質網(wǎng)特有的caspase-3激活等［15］。有研究表明，HNF4α表達短暫性下調對急性肝損傷可能有益，可以重新分配轉錄資源；但持續(xù)存在的刺激將促使HNF4α表達持續(xù)下調，其下調程度與肝損傷程度密切相關［16］。本研究結果顯示，與對照組相比，CCl4及LPS均可加重小鼠肝損傷及肝細胞凋亡，肝毒性劑量LPS組肝損傷程度更為顯著，且可下調HNF4α蛋白表達；而CCl4組肝組織HNF4α蛋白表達上調，提示HNF4α在不同原因引起的肝損傷中存在多種表達模式。有研究表明，肝臟因其解剖位置易成為細菌誘導損傷和產(chǎn)生炎癥的主要受累器官；累積的LPS可參與肝細胞直接損傷或通過促進炎癥反應加重肝損傷［17］。大量LPS可以參與肝細胞損傷并誘導其凋亡，血清LPS水平與肝細胞凋亡呈正相關［18］。肝損傷合并細菌感染及內毒素血癥均可導致肝損傷程度加重［19-20］。本研究結果顯示，非肝毒性劑量LPS誘導組小鼠血清ALT、TBiL及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達無明顯差異，均未引起肝損傷；肝毒性劑量LPS誘導組小鼠血清ALT、TBiL及Cleaved caspase-3蛋白表達顯著增加，HNF4α蛋白表達下調，與相關研究結果一致［21］，提示肝細胞凋亡與肝臟損害程度相關，但HNF4α對肝細胞凋亡及肝損害的作用及機制尚未確定。

本研究通過CCl4聯(lián)合非肝毒性劑量的LPS模擬肝損傷合并內毒素血癥實驗模型，發(fā)現(xiàn)0.1 mg/kg LPS+CCl4組和0.5 mg/kg LPS+CCl4組小鼠血清ALT、TBil水平，肝組織Cleaved caspase-3蛋白表達水平及肝細胞凋亡指數(shù)均高于對照組和CCl4組，HNF4α蛋白表達水平低于對照組和CCl4組。由此進一步說明，在肝損傷的基礎上非肝毒性劑量的LPS也能夠通過抑制HNF4α表達，增加肝細胞對凋亡的敏感性來加劇肝損害。

綜上所述，內毒素血癥對肝損傷的影響除與內毒素水平有關外，還與肝細胞的基礎狀態(tài)及損傷后HNF4α的反應性上調水平有關。HNF4α可能通過調控肝細胞凋亡影響肝損傷進展過程，HNF4α在不同肝損傷模型中存在多種調節(jié)模式。但在肝損傷中差異調控HNF4α的機制，及HNF4α在肝細胞凋亡和肝損傷中的具體作用機制尚待進一步研究。