吳瑋熙，劉帥輝，周賽君，劉紅巖，張睿，于珮

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病較嚴重的并發(fā)癥之一［1-2］。目前，控制血糖、血壓或阻斷腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）等傳統(tǒng)治療方法可以延緩DKD的進展，但尚無有效的方法預防或逆轉(zhuǎn)DKD向腎功能衰竭進展［3］。因此，深入探討DKD的發(fā)病機制，挖掘DKD治療的新靶點，為臨床預防和治療DKD提供新的思路顯得十分重要和緊迫。DKD早期的主要病理特征是腎小球肥大，逐漸導致腎小球細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積和腎小管間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展為腎臟不可逆的結(jié)構(gòu)損傷［4］。研究表明，微小RNA（microRNA，miR）-192在腎小球系膜細胞外基質(zhì)增生及系膜細胞肥大等方面發(fā)揮重要作用，抑制miR-192的表達可以改善DKD的腎臟纖維化［5］，但具體機制尚不明確。本課題組前期通過尿蛋白組學篩選并驗證了表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）可作為DKD早期標志物，并檢索miRNA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)小窩蛋白1（caveolin 1，CAV-1）可能是miR-192的靶蛋白，但確切調(diào)控機制有待進一步探索［6］。本研究旨在探討miR-192在高糖誘導的人腎小球系膜細胞損傷的作用及相關(guān)機制，及其可否通過調(diào)節(jié)CAV-1和EGF表達參與DKD的進展，為研究DKD發(fā)生、發(fā)展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-192inhibitor/micmics、DEPC水購自中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，實時熒光定量PCR（qPCR）引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑購自北京Solarbio科技有限公司；小鼠抗人CAV-1、EGF、1型膠原蛋白（COLⅠ）、纖連蛋白（FN）、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的兔抗小鼠IgG購自Protein Tech公司；NC膜購自美國Pall Corporation公司；ECL超敏化學發(fā)光液購自美國Advansta公司；預染蛋白Marker、Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scienfic公司；Takara RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseHPlus）購自日本寶生物工程有限公司；CCK-8試劑盒購自中國MCE有限公司；Western blot系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)和細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置熒光顯微鏡購自Olympus公司；酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng)人腎小球系膜細胞系（HMCs）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)院，用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況，每1～2 d換1次液，待細胞處于對數(shù)生長期進行后續(xù)實驗。

1.3細胞轉(zhuǎn)染及分組細胞按照隨機數(shù)字表法分為6組：正糖組（NG組，5.6 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG組，25 mmol/L葡萄糖）、NG+mimics組（5.6 mmol/L葡萄糖+miR-192模擬物）、HG+mimics組（25 mmol/L葡萄糖+miR-192模擬物）、NG+inhibitor組（5.6 mmol/L葡萄糖+miR-192抑制劑）、HG+inhibitor組（25 mmol/L葡萄糖+miR-192抑制劑）。HMCs接種于6孔板上，細胞匯合至80%～90%時，按照Lipofectamine 2000操作說明書將miR-192抑制劑和模擬物分別轉(zhuǎn)入生長狀態(tài)良好的腎小球系膜細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，根據(jù)不同條件更換液體培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖活性將細胞按照5×103/mL的密度接種在96孔板中，每組設置5個復孔，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后用不同培養(yǎng)基干預細胞24 h，然后向每孔中加入10 μL的CCK-8工作液后再放回培養(yǎng)箱中孵育0.5～4 h，每隔0.5 h用酶標儀測定450 nm處的光密度值（OD值），評估細胞活力。根據(jù)OD值計算細胞增殖率，增殖率=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.5劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力將細胞按1×105/孔接種于6孔板中，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，用200 μL的高壓滅菌槍頭垂直沿著無菌直尺劃痕，盡量保證使劃痕寬度一致。用磷酸鹽緩沖液沖洗掉細胞劃痕產(chǎn)生的碎屑，加入2 mL無血清培養(yǎng)基后放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h時拍照記錄結(jié)果。用Image J軟件計算劃痕面積（S），并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=［1-（S24h/S0h）］×100%。

1.6qPCR檢測miR-192、EGF、CAV-1、FN、COLⅠmRNA表達利用Trizol法提取細胞總RNA，測量RNA濃度和純度，利用試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物設計見表1。取1 μL的cDNA產(chǎn)物進行qPCR擴增。擴增條件：預變性95℃30 s；95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，45個循環(huán)；溶解曲線分析：95℃5 s，65℃60 s，95℃1 s，采用2-ΔΔCt法計算各個指標相對表達量。

1.7Western blot檢測蛋白表達將干預后的細胞收集到2 mL離心管中，離心后用PBS重懸細胞清洗3遍，加入RIPA裂解液和廣譜蛋白酶抑制劑，充分裂解后吸取到1.5 mL離心管中。4℃、12 000×g離心10 min取上清液，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min。取10 μL蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌后分別加入CAV-1、EGF、COLⅠ、FN一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。TBST再次洗滌10 min×3次后加入二抗（1∶4 000）常溫孵育1 h，TBST洗滌后利用電化學（ECL）發(fā)光法顯色，掃描儀檢測結(jié)果。Image J軟件分析蛋白的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

Tab.1 The primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖的情況與NG組相比，HG組和NG+mimics組細胞增殖率升高，NG+inhibitor組細胞增殖率下降（P＜0.05）。與HG組相比，HG+mimics組細胞增殖率增加，HG+inhibitor組細胞增殖率下降（P＜0.05）。與NG+inhibitor組相比，HG+inhibitor組細胞增殖率下降更明顯（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of proliferative activity of mesangial cells between the six groups圖1各組人腎小球系膜細胞的增殖活性比較

2.2 各組細胞遷移能力比較與NG組相比，HG組、NG+mimics組細胞劃痕愈合率增加（P＜0.05）；NG+inhibitor組劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+mimics組劃痕愈合率增加（P＜0.05），HG+inhibitor組 劃 痕 愈 合 率 降 低（P＜0.05），見圖2、3。

2.3 各組miR-192及CAV-1、EGF、FN、COLⅠmRNA相對表達水平比較與NG組相比，HG組和NG+mimics組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達上調(diào)，CAV-1 mRNA表達下調(diào)（均P＜0.05）；NG+inhibitor組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達下調(diào)，CAV-1 mRNA表達上調(diào)（P＜0.05）。與HG組相比，HG+mimics組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達上調(diào)，CAV-1 mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；HG+inhibitor組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達下調(diào)，CAV-1 mRNA表達上調(diào)（P＜0.05），見表2。

2.4 各組CAV-1、EGF、FN、COLⅠ蛋白相對表達水平與NG組相比，HG組CAV-1表達降低，EGF、FN和COLⅠ表達升高（均P＜0.05）。在NG組和HG組加入miR-192 mimics后，CAV-1表達降低，EGF、FN和COLⅠ表達升高（均P＜0.05）。在NG組和HG組分別加入miR-192 inhibitor后，CAV-1蛋白表達升高，EGF、FN和COLⅠ表達水平均降低，HG組加入miR-192 inhibitor趨勢更加明顯（均P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Migration ability of cells of the six groups(×200)圖2各組細胞的遷移能力（×200）

圖3 Comparison of the migration ability of cells between the six groups圖3各組細胞的遷移能力比較

Tab.2 Comparison of miR-192,CAV-1,EGF,FN,COLI mRNA levels of cells between the six groups表2各組細胞miR-192及CAV-1、EGF、FN、COLI mRNA水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of miR-192,CAV-1,EGF,FN,COLI mRNA levels of cells between the six groups表2各組細胞miR-192及CAV-1、EGF、FN、COLI mRNA水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NG組比較，b與HG組比較，c與NG+mimics組比較，d與NG+inhibitor組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組NG+mimics組HG+mimics組NG+inhibitor組HG+inhibitor組F miR-192 1.01±0.03 1.45±0.01a 1.23±0.01a 1.56±0.01bc 0.21±0.01a 0.18±0.02bd 2 943.628＊＊CAV-1 1.07±0.06 0.83±0.01a 0.51±0.01a 0.48±0.01bc 1.43±0.01a 1.66±0.01bd 1 001.858＊＊組別NG組HG組NG+mimics組HG+mimics組NG+inhibitor組HG+inhibitor組F EGF 1.01±0.03 1.53±0.01a 1.37±0.01a 1.62±0.00bc 0.74±0.01a 0.61±0.04bd 1 302.088＊＊FN 1.01±0.03 1.49±0.06a 1.52±0.03a 1.65±0.02bc 0.72±0.02a 0.68±0.01bd 1 244.431＊＊COLⅠ1.00±0.03 1.63±0.02a 1.52±0.01a 1.72±0.08bc 0.62±0.02a 0.57±0.01bd 619.000＊＊

Fig.2 Changes of CAV-1,EGF,FN and COLⅠprotein detected by Western blot assay圖2 Western blot法檢測CAV-1、EGF、FN、COLⅠ蛋白變化

Tab.3 Comparison of the protein levels of CAV-1,EGF,FN and COLI between the six groups表3各組細胞CAV-1、EGF、FN、COLI蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of the protein levels of CAV-1,EGF,FN and COLI between the six groups表3各組細胞CAV-1、EGF、FN、COLI蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NG組比較，b與HG組比較，c與NG+mimics組比較，d與NG+inhibitor組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組NG+mimics組HG+mimics組NG+inhibitor組HG+inhibitor組F CAV-1 0.95±0.01 0.93±0.01a 0.80±0.01a 0.55±0.01bc 1.06±0.01a 1.20±0.01bd 1 740.498＊＊EGF 0.71±0.02 0.78±0.11a 0.88±0.11a 0.88±0.11b 0.66±0.02a 0.48±0.01bd 509.618＊＊FN 0.67±0.01 0.95±0.02a 0.73±0.05a 1.07±0.11bc 0.58±0.02a 0.41±0.01bd 68.769＊＊COLⅠ0.81±0.01 0.84±0.01a 0.93±0.01a 1.08±0.08bc 0.78±0.08a 0.54±0.01bd 76.459＊＊

3 討論

DKD的主要病理特征包括腎小球基底膜增厚、系膜擴張和肥大以及ECM異常積累。FN和COLⅠ通常被認為是ECM的主要成分［7］，它們隨著間質(zhì)ECM的積累增加，可明顯促進腎臟組織纖維化。研究表明，糖尿病患者的腎臟細胞可以調(diào)控ECM蛋白質(zhì)如COLⅠ的表達，長期慢性高血糖刺激腎小球系膜細胞增殖，促使系膜細胞分泌細胞外基質(zhì)增多，是導致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化和蛋白尿產(chǎn)生的重要病理機制［8］。COLⅠ是一種基膜膠原，是腎小球ECM的主要成分，在系膜細胞間相互交叉形成網(wǎng)絡［9］。FN是一種大分子糖蛋白，在細胞外基質(zhì)中相互交叉形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為其他細胞外基質(zhì)成分沉積提供支架［10］。在高糖刺激下ECM異常累積，系膜細胞增殖且隨著病情加重，這種趨勢更加顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，和正常條件下培養(yǎng)的細胞比，高糖條件下培養(yǎng)的腎小球系膜細胞的增殖率和遷移愈合率均出現(xiàn)升高，ECM生成增多。利用miR-192 mimics或inhibitor處理系膜細胞，當miR-192表達增多或減少時，細胞增殖、遷移和ECM表現(xiàn)出相同的趨勢，說明miR-192參與了DKD的發(fā)生發(fā)展。

miR-192屬于microRNA家族中目前研究較為廣泛的一員，其可以影響細胞的分化以及增殖代謝，直接或間接地參與多種疾病發(fā)生發(fā)展［11-13］，包括DKD。有研究表明，miR-192在糖尿病患者腎臟中高度且完全特異表達，但其具體功能或靶標尚不完全清楚［14］。在慢性腎臟病小鼠模型中，高表達的miR-192可能作為保護因素發(fā)揮抗纖維化的作用，上調(diào)miR-192的表達可以通過Smad同源物3（Smad3）延緩腎間質(zhì)纖維化［15］。與該結(jié)果相反的是，在DKD模型的小鼠的腎小球系膜細胞中，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）通過miR-192誘導Smad相互作用蛋白1（SIP1）下調(diào)，減少E盒抑制因子1（EF1）對2型膠原（COLⅠA2）的抑制作用，增加COLⅠA2的表達，促進ECM增生，最終導致腎臟纖維化［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常葡萄糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞比，高糖干預后的系膜細胞miR-192的表達水平增高，并通過靶向CAV-1，進一步引起系膜細胞增殖、遷移和ECM累積，促進DKD的進展。

CAV-1是形成富含膽固醇的膜微區(qū)小窩所需的完整膜蛋白，它是細胞黏附和遷移的重要調(diào)節(jié)劑，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展［17］，對DKD的信號轉(zhuǎn)導很重要。過表達CAV-1能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，減少系膜細胞的增殖［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞中，miR-192通過靶向CAV-1抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，和正常糖濃度培養(yǎng)的腎小球系膜細胞對比，高糖培養(yǎng)的細胞miR-192表達增高，CAV-1的mRNA和蛋白表達水平均降低；用miR-192 inhibitor轉(zhuǎn)染系膜細胞下調(diào)miR-192的表達后，CAV-1的表達水平升高，而在轉(zhuǎn)染miR-192 mimics后發(fā)現(xiàn)，隨著系膜細胞miR-192表達水平的增高，CAV-1表達水平降低，說明miR-192抑制CAV-1的表達。

EGF是由十二指腸、腎臟等器官分泌的多肽［20-21］，參與增殖、代謝、分化等多種生物過程的調(diào)控，具有促進上皮細胞增殖分化作用，能促進包括腎小球系膜細胞和上皮細胞的增殖分化，與DKD早期腎小球肥大和腎小管硬化有關(guān)［22］。本課題組前期通過STRING分析發(fā)現(xiàn)EGF與CAV-1具有相互作用［12］。Orlichenko等［23］發(fā)現(xiàn)CAV-1能夠通過促進EGF的生成調(diào)節(jié)黏附結(jié)合蛋白（E-cadherin），增加胰腺腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過高糖培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染miR-192 micmics的腎小球系膜細胞，CAV-1表達水平降低，EGF表達水平升高，細胞增殖率升高；而在下調(diào)miR-192導致CAV-1過表達后，EGF表達水平受到抑制，提示在系膜細胞中，CAV-1可以抑制EGF表達。

綜上所述，高糖上調(diào)腎小球系膜細胞內(nèi)miR-192表達，進而抑制CAV-1的表達，從而減弱CAV-1對下游蛋白EGF的負向調(diào)控作用，進而引起系膜細胞增殖和遷移，ECM生成增多，這一調(diào)控機制可能是DKD進展的關(guān)鍵因素之一。通過抑制miR-192的表達延緩腎小球系膜細胞增殖和遷移以及ECM的形成，可為防治和DKD提供新的靶點，也為DKD發(fā)病機制的初步探索提供了新的視角。