方玉美，程順利，黃玉喜，彭子涵，赫玲玲，肖進(jìn)彬

（河南省高新技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司，河南 鄭州 450002）

0 引言

煤氣化廢水是含芳香族化合物和雜環(huán)化合物的典型廢水，主要來源于煤氣發(fā)生爐的煤氣洗滌、冷凝及凈化等過程中。煤氣化廢水成分復(fù)雜，含有殘留的焦油、酚和氨等污染物和其他物質(zhì)，COD 濃度高，一般呈深褐色，有一定粘度，多泡沫，有濃烈的酚、氨臭味[1-3]。我國在“十二五”，“十三五”，“十四五”生態(tài)環(huán)境保護(hù)規(guī)劃中，明確了NH4+-N，TN 為國家水體污染約束性控制指標(biāo)，因此煤氣化廢水的NH4+-N 脫除問題一直是關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來，相比磷酸銨鎂沉淀法、蒸氨法、催化電解法等工藝，生物脫氮法因其操作簡便、低成本效益高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于廢水脫氮處理[4-5]，其中短程硝化反硝化、厭氧氨氧化脫氮工藝已逐漸發(fā)展成為一種趨勢。但傳統(tǒng)硝化細(xì)菌生長緩慢，平均代時均在10 h 以上，且受外界環(huán)境，如pH 值、溫度、微生物種類等影響較大[6-7]，同時煤氣化廢水作為處理難度較大的工業(yè)廢水之一，COD 質(zhì)量濃度在2 000 mg/L 以上，NH4+-N 質(zhì)量濃度在200 mg/L 以上[1]，若 利用一般硝化菌劑處理高濃度NH4+-N 煤氣化廢水，且考慮廢水中有毒有害有機(jī)物對微生物菌群的不利影響，出水中NH4+-N 和TN 濃度易出現(xiàn)不達(dá)標(biāo)現(xiàn)象。研究在工業(yè)煤氣化廢水環(huán)境中，利用活性污泥曝氣馴化硝化菌液，期望獲得耐受高濃度NH4+-N 的耐毒硝化菌液[8-9]，進(jìn)一步為硝化菌劑應(yīng)用于煤氣化廢水的工業(yè)化處理提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

試劑：（NH4）2SO4，KH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O（NaCO3為分析純，F(xiàn)e-EDTA 為化學(xué)純）。

儀器：TU-1810 紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；水質(zhì)指標(biāo)快速檢測儀（鄭州沃特測試技術(shù)有限公司）；LHZ-111A 全溫振蕩器（上海程捷儀器設(shè)備有限公司）；PHS-3E pH 計(jì)和DO-957 溶解氧測定儀（上海雷磁儀器有限公司）。

用于馴化硝化菌液的污泥取自甲胺污水處理廠的活性污泥；煤氣化廢水取自河南某化工廠煤氣洗滌污水。原水水質(zhì)指標(biāo)見表1。mg·L-1

表1 煤氣化廢水原水水質(zhì)指標(biāo)

對照組菌劑為市售硝化菌劑（適用于各類含NH4+-N 廢水的處理）；實(shí)驗(yàn)組菌劑為煤氣化廢水連續(xù)培養(yǎng)裝置曝氣池中的硝化菌液。

硝化菌培養(yǎng)基和脫氨能力測試培養(yǎng)基：(NH4)2SO4，KH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，F(xiàn)e-EDTA 質(zhì)量濃度分別為2.5，0.7，13.5，0.5，0.1，0.005，0.001 g/L。

pH 值調(diào)節(jié)液：Na2CO3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%）。

1.2 方法

1.2.1 硝化菌液的馴化與富集

以甲胺污水處理廠的活性污泥為接種物，接種體積分?jǐn)?shù)為30%，在連續(xù)培養(yǎng)裝置中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～15%的煤氣化廢水曝氣馴化培養(yǎng)，使曝氣池NH4+-N 質(zhì)量濃度維持在300 ～500 mg/L，DO 質(zhì)量濃度維持在2 ～5 mg/L，pH 值為6 ～9，馴化時間6個月。取適量馴化后的廢水樣品接入到100 mL 硝化菌培養(yǎng)基中進(jìn)行硝化菌液的富集培養(yǎng)，培養(yǎng)時間15 d，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，連續(xù)培養(yǎng)3 代后收集菌種。

1.2.2 硝化菌液氨態(tài)氮脫除能力測試

共設(shè)3 組處理組：對照組1 和對照組2 分別為不同市售菌劑，試驗(yàn)組為馴化后的硝化菌液。設(shè)計(jì)NH4+-N 初始質(zhì)量濃度為450 mg/L，配制脫氨能力測試培養(yǎng)基，按菌數(shù)量1.0×106cfu/mL 接種，在30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min 條件下培養(yǎng)20 d，通過檢測NH4+-N 濃度的變化考察硝化菌液脫除能力。

1.2.3 不同pH 值對硝化菌NH4+-N 轉(zhuǎn)化的影響

設(shè)計(jì)NH4+-N 初始質(zhì)量濃度為450 mg/L，培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH 值分別為7.0，7.5，8.0，8.5，通過檢測NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的濃度考察馴化后硝化菌液的適宜NH4+-N 轉(zhuǎn)化的pH 環(huán)境及3 種價(jià)態(tài)氮的轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1.2.4 處理時間對硝化菌液氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化的影響

設(shè)計(jì)NH4+-N 初始質(zhì)量濃度為450 mg/L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH 值為8.0，通過檢測NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的濃度考察馴化后硝化菌液的脫除NH4+-N適宜的pH 值及3 種價(jià)態(tài)氮的轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1.2.5 溫度對硝化菌液氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化的影響

設(shè)計(jì)NH4+-N 初始質(zhì)量濃度為450 mg/L，在25，30，35 ℃溫度條件培養(yǎng)，通過檢測NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的濃度考察馴化后硝化菌液的適宜NH4+-N轉(zhuǎn)化的溫度及3 種價(jià)態(tài)氮的轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1.2.6 馴化后硝化菌液的微生物多樣性分析

取馴化前后的水樣作為樣品送至戊碳糖生物檢測，采用16SrRNA 基因文庫高通量測序、alpha 多樣性分析馴化后硝化菌液的優(yōu)勢菌屬及相對豐度。

1.2.7 水質(zhì)指標(biāo)測定方法

NH4+-N 采用HJ 535—2009 納氏試劑分光光度法；NO3--N 采用GB 7480—87 酚二磺酸分光光度法；NO2--N 采用GB 7493—87 分光光度法；pH 值采用玻璃電極及精密pH 試紙法檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

式中：N0為NH4+-N 初始質(zhì)量濃度，mg/L；Nx為培養(yǎng)x天后的NH4+-N 質(zhì)量濃度，mg/L。

式中：B0表示NO2--N 初始質(zhì)量濃度，mg/L；Bx表示培養(yǎng)x天后的NO2--N 質(zhì)量濃度，mg/L。

式中：C0表示NO3--N 初始質(zhì)量濃度，mg/L；Cx表示培養(yǎng)x天后的NO3--N 質(zhì)量濃度，mg/L。

相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用Origin92 軟件處理完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化菌NH4+-N 脫除能力測試

考察馴化后的硝化菌液對NH4+-N 的脫除能力，結(jié)果見圖1。

圖1 不同來源的硝化菌對NH4+-N 的去除效果

由圖1 可知，培養(yǎng)20 d 后，對照組1 的NH4+-N質(zhì)量濃度降至402.65 mg/L，NH4+-N 去除率為9.4%；對照組2 的NH4+-N 質(zhì)量濃度降至385.21mg/L，NH4+-N 去除率為13.3%；實(shí)驗(yàn)組的NH4+-N 質(zhì)量濃度降至140.96 mg/L，NH4+-N 去除率為68.78%。對比采購的2 種市售菌劑，在NH4+-N 初始質(zhì)量濃度為450 mg/L 時，馴化后的硝化菌液具有顯著優(yōu)勢。

2.2 pH 值對硝化菌液NH4+-N 轉(zhuǎn)化的影響

不同pH 值條件下NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的轉(zhuǎn)化規(guī)律見圖2。由圖2 可知，培養(yǎng)12 d 后，在pH值為7.0 時，NH4+-N 質(zhì)量濃度降至186.3 mg/L，去除率為58.6%；NO2--N 質(zhì)量濃度為226.9 mg/L，積累率為50.43%；NO3--N 質(zhì)量濃度為25.6 mg/L，積累率為5.68%。在pH 值為7.5 時，NH4+-N 質(zhì)量濃度降至18.9 mg/L，去除率為95.8%；NO2--N 質(zhì)量濃度為224.0 mg/L，積累率為49.79%，NO3--N 質(zhì)量濃度為25.1 mg/L，積累率為5.57%。在pH 值為8.0 時，NH4+-N 質(zhì)量濃度低于檢測限（0.1 mg/L）；NO2--N 質(zhì)量濃度為210.4 mg/L，積累率為46.76%；NO3--N 質(zhì)量濃度為24.7 mg/L，積累率為5.50%。在pH 值為8.5 時，NH4+-N 濃度降至46.75 mg/L，去除率為89.61%；NO2--N 質(zhì)量濃度為215.9 mg/L，積累率為47.98%；NO3--N 質(zhì)量濃度為25.0 mg/L，積累率為5.56%。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，經(jīng)煤氣化廢水馴化的硝化菌液在pH 值為7.5 ～8.5 環(huán)境下，NH4+-N 去除率均超過80%。

圖2 NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的質(zhì)量濃度變化

2.3 處理時間對硝化菌液NH4+-N 轉(zhuǎn)化的影響

考察14 d 內(nèi)NH4+-N 的轉(zhuǎn)化規(guī)律，結(jié)果見圖3。

圖3 NH4+-N，NO2--N，NO3--N 轉(zhuǎn)化曲線

由圖3 可知，經(jīng)煤氣化廢水馴化的硝化菌液在第2 天開始起效，14 d 內(nèi)將質(zhì)量濃度為450 mg/L 的NH4+-N 全部轉(zhuǎn)化。NO2--N 質(zhì)量濃度在第7 天達(dá)到峰值（221.73 mg/L），之后的7 d 內(nèi)NO2--N 濃度達(dá)到動態(tài)平衡；NO3--N 質(zhì)量濃度在第7 天達(dá)到峰值25.0 mg/L，之后的7 d 內(nèi)NO3--N 濃度達(dá)到動態(tài)平衡。第7天后，NH4+-N 繼續(xù)減少，但NO2--N 和NO3--N 均未檢測到明顯增加，分析原因?yàn)槌糠譄o機(jī)氮被微生物自身生長利用外，可能存在某類好氧反硝化菌，將NO2--N 和NO3--N 還原為N2脫除，維持NO2--N 和NO3--N 的動態(tài)平衡。

2.4 溫度對硝化菌液NH4+-N 轉(zhuǎn)化的影響

考察不同溫度條件下3 種價(jià)態(tài)氮的轉(zhuǎn)化規(guī)律，結(jié)果見圖4。

圖4 不同溫度條件下NH4+-N，NO2--N，NO3--N的轉(zhuǎn)化規(guī)律

由圖4 可知，NH4+-N 在30 ℃環(huán)境下脫除效率較高，培養(yǎng)8 d 后，NH4+-N 質(zhì)量濃度降至10 mg/L 以下；在35 ℃環(huán)境下，NH4+-N 的脫除效率優(yōu)于25℃時的脫除效率，由此可推測，硝化菌液中氨氧化菌的適宜溫度為30 ℃左右；在30 和35 ℃環(huán)境下，NO2--N的積累量相差不大，25 ℃環(huán)境下NO2--N 的積累量稍低，推測亞硝化菌在30 ～35 ℃生長狀態(tài)良好；由于硝化細(xì)菌的代時較長，在培養(yǎng)至14 天時，NO3--N積累量變化仍較小，表明該菌群中硝化細(xì)菌生長緩慢，倍增時間長達(dá)十幾天。

2.5 微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成分析

通過2 組樣品16SrRNA 基因文庫高通量測序，經(jīng)煤氣化廢水馴化后的樣品（NF1）與馴化前的樣品（NF2）alpha 多樣性指標(biāo)計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 alpha 多樣性指標(biāo)計(jì)算結(jié)果

由表2 可知，2 個樣品的文庫覆蓋率均大于0.98，表明測序深度已經(jīng)基本覆蓋樣本中的所有物種。NF1 的Chao1和ACE指數(shù)均大于NF2，因此，NF1 具有較大的OTU 數(shù)，即馴化后的樣品物種豐富度大于馴化前的樣品，具有較多的物種總數(shù)。而NF2的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)大于NF1，說明馴化前樣品群落多樣性高于馴化后的樣品。多樣性指數(shù)較高的原始污泥群落各種之間分配較均勻，而馴化后的樣品各種之間生物差異較大，優(yōu)勢種群明顯。

群落分部情況見圖5，優(yōu)勢菌屬中優(yōu)勢菌株的占比見表3。由圖5 及表3 可知，馴化前樣品菌群分布均勻，稍有優(yōu)勢的前3 類菌群為：甲基菌屬（Methylobacillus），申氏菌屬（Shinella），短鏈單胞菌（Brevundimonas）。馴化后的樣品中優(yōu)勢菌群明顯，前4 類優(yōu)勢菌種為：螺桿菌（Helicobacter），亞硝化單胞菌（Nitrosomonas），硝基黃桿菌（Diaphorobacter），假單胞菌屬（Pseudomonas）。檢測到的Nitrosomonas菌種主要為歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaeaATCC 19718），在檢測樣品的中相對豐度為21.76%；Diaphorobacter屬主要為嗜酸菌（Acidovorax ebreus），相對豐度為5.89%，假單胞菌（Pseudomonas）主要為Pseudomonassp.SGb396，相對豐度為4.62%。

圖5 樣品在屬層次的群落結(jié)構(gòu)（前10 種）

表3 優(yōu)勢菌屬中優(yōu)勢菌株的占比

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果初步表明，馴化后的硝化菌液在pH值為8.0，溫度為30 ℃條件下，具有較強(qiáng)的氨氧化能力，這與報(bào)道文獻(xiàn)中氨氧化細(xì)菌的較適pH 值、溫度條件一致[10-11]。目前已報(bào)道的氨氧化菌的較適pH 值多數(shù)為偏堿性，當(dāng)pH 值降低時，NH3將轉(zhuǎn)化為NH4+，影響氨氧化菌（AOB）底物NH3的獲得，從而影響氨氧化細(xì)菌豐度甚至種類[12]。在氧化脫氨過程中需補(bǔ)加堿液維持pH 環(huán)境，提高菌群的氨氧化速率和脫氨效率。從3 種價(jià)態(tài)氮的轉(zhuǎn)化規(guī)律來看，馴化后硝化菌液中氨氧化能力較強(qiáng)，硝化能力偏弱，具有短程硝化的應(yīng)用潛能。

在污水處理中硝化細(xì)菌作為功能菌群，其種類和數(shù)量決定了污水中NH4+-N 及其它污染物的降解程度。受處理水質(zhì)的影響，馴化前活性污泥樣品中Methylobacillus，Shinella，Brevundimonas3 種菌屬相對豐度較大，其中Shinella具有脫除NH4+-N、降解酚類的功能[13-15]。馴化后樣品中優(yōu)勢菌群與馴化前相差較大，前4 類優(yōu)勢菌種為螺桿菌（Helicobacter），亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas），硝基黃桿菌（Diaphorobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中螺桿菌屬是污水中常見菌群[16]；亞硝化單胞菌屬的菌種主要是歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaea ATCC19718），是一種自養(yǎng)氨氧化菌，具有將NH4+-N 轉(zhuǎn)化成NO2--N 的功能[17]，是短程硝化的主要菌種；硝基黃桿菌屬中優(yōu)勢菌種為Acidovoraxebreus，張念鑫等[18]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸菌（Acidovoraxebreus）既可利用有機(jī)氮又可利用無機(jī)氮；硝基黃桿菌屬具有異養(yǎng)反硝化、降解酚和烴的功能，寇悅等[19]將Diaphorobacter稱為酚降解菌，RITIGALA 等[21]檢測到Diaphorobacter屬在反硝化中占優(yōu)勢[20-21]，WANG P 等[22]檢測到Diaphorobacter以多環(huán)芳烴為唯一碳源，具有多環(huán)芳烴生物修復(fù)作用，劉攀龍[23]檢測到Diaphorobacter nitroreducens有氨態(tài)氮脫除功能；假單胞菌是一種常見的反硝化細(xì)菌，同時還具有有氧反硝化以及反硝化吸磷的功能，假單胞菌中有關(guān)Pseudomonas sp.SGb396 菌種的報(bào)道較少，但其同類菌株有研究報(bào)道，ZHANG D 等[24]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬Pseudomonas sp.Y39-6 具有好氧-異氧反硝化功能，HENTATI 等[25]檢測到銅綠假單胞菌NAPH6具有降解萘，脂肪烴等功能。綜上所述，經(jīng)過煤氣化廢水馴化后，一些適應(yīng)該廢水水質(zhì)的微生物被富集，氨氧化菌、酚烴類降解的菌成為優(yōu)勢菌群。異養(yǎng)反硝化菌的存在更好地解釋了結(jié)果2.3 中存在的氮素部分消失現(xiàn)象。

對于較高NH4+-N 濃度的廢水，尤其是工業(yè)廢水，由于污水中毒害物質(zhì)對微生物的抑制作用，加上硝化菌群的繁殖代時長，硝化菌劑直接加入污水處理系統(tǒng)，往往存在起效慢，效果不理想的情況。經(jīng)實(shí)際廢水馴化培養(yǎng)后，優(yōu)勢菌群的相對豐度會有所改變，耐受性強(qiáng)的適應(yīng)水質(zhì)的微生物菌群得到富集成為優(yōu)勢菌群，再作為菌種加入相應(yīng)的污水處理系統(tǒng)中能夠較快適應(yīng)水質(zhì)，獲得較理想的效果。

4 結(jié)論

（1）在較高NH4+-N 濃度環(huán)境下，經(jīng)過煤氣化廢水馴化后的硝化菌液較市售硝化菌劑有較優(yōu)的脫氨性能。

（2）經(jīng)過煤氣化廢水馴化后硝化菌液的氨氧化能力較強(qiáng)，硝化能力相對較弱，在NH4+-N 初始質(zhì)量濃度為450 mg/L，pH 值為8.0，30 ℃條件下，反應(yīng)14 d 后，NH4+-N 去除率可達(dá)100%，NO2--N 積累率為50%，NO3--N 積累率為5.5%。

（3）煤氣化廢水馴化后的硝化菌液通過16SrRNA基因文庫高通量測序分析，得出馴化后樣品的優(yōu)勢菌 群 為Nitrosomonas，Diaphorobacter，Pseudomonas；經(jīng)過煤氣化廢水馴化培養(yǎng)后，一些有利于氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化、酚類降解的菌群得到富集。