向麗萍，吳金春，覃宇，張祖文，李霞，王蘭蘭

遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院，貴州 遵義 563000

邊銷茶作為銷往邊疆少數(shù)民族地區(qū)的緊壓茶,其生產(chǎn)成品主要為茯磚、康磚、青磚、金尖、花磚、黑磚等。黑磚、茯磚、花磚作為邊銷茶中的主要幾種茶葉類別，在加工過程中會進(jìn)行“人工發(fā)花”，其原理是讓微生物在濕熱等條件下大量繁殖發(fā)生特殊的反應(yīng)形成“金花”，俗稱金花菌[1-2]。金花菌能使茶葉轉(zhuǎn)化多酚類物質(zhì)，改善茶葉的品質(zhì)，有清除自由基、降脂、降壓以及調(diào)節(jié)糖類代謝的功效[3]。“金花菌”的數(shù)量和質(zhì)量對于判定茯磚茶品質(zhì)好壞起重要作用[4]。

現(xiàn)階段針對“金花菌”開展的研究有感官質(zhì)量評價(jià)、ITS通用引物測序分析、微生物菌落形態(tài)特征等方面。“金花菌”通常意義上主要是指冠突散囊菌，但邊銷茶中散囊菌屬有很多類，包含冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、匍匐散菌（Eurotium repens）、間型散囊菌（Eurotium intermedius）、謝百散囊菌（Eurotium chevalieri）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）、赤散囊菌（Eurotium rubrum）和一種未定名的散囊菌（Eurotiumsp），其中前5 個菌是優(yōu)勢種類[5]。許多文獻(xiàn)表明，ITS 通用引物分析鑒定“金花菌”只能鑒別到真菌門類曲霉屬子囊菌綱，到具體哪一種真菌存在一定不確定性，通過NCBI網(wǎng)站Blastn比對分析，同源性高達(dá)99%以上的真菌種類有多種[6]。篩選Score得分最高的和相似性最強(qiáng)的前十幾條目錄，可以知道“金花菌”中散囊菌的范圍，優(yōu)勢真菌群為哪幾類。本研究從收集的15組邊銷茶茶樣中檢測其“金花菌”菌落數(shù)量，ITS 通用引物測序分析測出各茶樣之間親緣性強(qiáng)弱，篩選優(yōu)化出一種快速提取其“金花菌”DNA的方法，為后續(xù)開展“金花菌”的研究，提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶樣來自10 家邊銷茶生產(chǎn)企業(yè)（貴州省9家、湖南省1家），生產(chǎn)于2012—2021年間。

供試藥品：氯化鈉（分析純），天津科密歐生化試劑有限公司生產(chǎn)；孟加拉紅瓊脂，廣州陸橋檢測技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（細(xì)菌真菌直接裂解液）、Premix TaqTM、瓊脂糖（Agarose）、DL1000 DNA Maker、6*Loading Buffer 均由寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司生產(chǎn)；GeneGreen 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。

主要儀器設(shè)備：生物安全柜，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；隔水式霉菌培養(yǎng)箱、全自動立式壓力滅菌器均由上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司生產(chǎn)；CFX96 熒光定量pcr 儀Bio-Rad、電泳儀及電泳槽Bio-Rad、核酸蛋白分析儀均由美國伯樂生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 “金花菌”的菌落數(shù)量

將15 組茶葉樣品分別編號為G1～G15，按照《緊壓茶 第3 部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）[7]、《黑 茶 第5 部 分：茯 茶》（GB/T 32719.5—2018）[8]中規(guī)定的冠突散囊菌按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）[9]進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)，具體步驟和方法如下。

稱取25 g樣品→加入225 mL無菌生理鹽水→充分振搖，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min→10倍系列梯度稀釋→每個稀釋度2個無菌平皿，分別加入1 mL稀釋液→傾注20～25 mL 的孟加拉紅瓊脂→28 ℃培養(yǎng)5 d→菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 “金花菌”的DNA提取及方法優(yōu)化

傳統(tǒng)真菌DNA 提取方法需要刮取真菌菌絲，液氮研磨，費(fèi)事費(fèi)力；而選擇某些商業(yè)試劑盒提取DNA又耗時長，提取效果不佳，經(jīng)過篩選，本試驗(yàn)選用細(xì)菌真菌直接裂解液進(jìn)行提取。但在實(shí)驗(yàn)中按照DNA提取試劑盒使用說明書進(jìn)行時，出現(xiàn)DNA提取失敗現(xiàn)象，因此對于試驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)2 組不同培養(yǎng)時間對照試驗(yàn)，通過PCR電泳結(jié)果篩選出一種適合的“金花菌”DNA快速提取的方法。

處理1：15 組樣品，按照GB 4789.15—2016標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)5 d（120 h）后，使用細(xì)菌真菌直接裂解液試劑盒，取50 μL細(xì)菌真菌直接裂解液于滅菌的Micortube中，用滅菌槍頭挑取單菌落，置于Micortube中攪動幾下后取出，80 ℃熱變形15 min，5 000 r/min離心15 min，取1～5 μL裂解后上清液作為PCR反應(yīng)模板。

處理2：15 組樣品，按GB 4789.15—2016 方法培養(yǎng)3 d（72 h）后，使用細(xì)菌真菌直接裂解液試劑盒，剩余步驟同處理1。

1.2.3 “金花菌”系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

ITS 通用引物序列對于提取15 組“金花菌”進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，并在NCBI 網(wǎng)站Blastn 比對分析，根據(jù)同源性最高的比對序列，了解此次“金花菌”中優(yōu)勢散囊菌種群分類，然后用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，了解其親緣性。

PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3'） 和ITS4 （5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），預(yù)混液使用Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）體系，反應(yīng)體系總體積25 μL（12.5 μL Premix TaqTM、2 μL 樣品提取

DNA、0.5 μL ITS1、0.5 μL ITS4、9.5 μLddH2O）。

PCR 反應(yīng)條件程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30 次，最后72 ℃延伸8 min 后得PCR 產(chǎn)物。擴(kuò)增結(jié)束后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳查看DNA提取及擴(kuò)增效果。然后將其送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 “金花菌”菌落數(shù)量及ITS測序分析菌群范圍

“金花菌”菌落數(shù)量根據(jù)GB 4789.15—2016檢測方法檢驗(yàn)結(jié)果及ITS 測序分析鑒定，通過NCBI網(wǎng)站Blastn 比對分析[10]，同源性前20 組的序列進(jìn)行比對，得出子囊菌綱，曲霉菌屬，及“金花菌”鑒定優(yōu)勢菌群范圍。此次15 組樣品ITS 序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，顯示該菌ITS序列與蒙地曲霉(Ascomycetes montevidensis）、阿姆斯特丹曲霉（Ascomycetes amstelodami）、赤曲霉（Ascomycetes ruber）、謝瓦曲霉（Ascomycetes chevalieri）、冠突曲霉（Ascomycetes cristatum）、雪花曲霉（Ascomycetes niveoglaucus）具有極高的同源性，且期望值均為0。ITS 序列分析對于“金花菌”只能鑒別到曲霉菌屬，子囊菌綱。試驗(yàn)表明此次試驗(yàn)的15組“金花菌”中優(yōu)勢菌種為6種。

“金花菌”的菌落形態(tài)在孟加拉紅瓊脂上培養(yǎng)120 h 后，菌株周圍呈金黃色，中心變?yōu)楹谏▓D1）。

圖1 “金花菌”孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)120 h生長圖

從“金花菌”的菌落數(shù)量（表1）可知，15組樣品中生產(chǎn)日期最早的G11為2012年1月壓制，其菌落數(shù)量1.4×106CFU/g；生產(chǎn)日期最晚的G5為2021年4月壓制，其菌落數(shù)量為3.5×105CFU/g，均超過其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的≥20×104CFU/g，表明“金花菌”在合適的儲存環(huán)境下，其菌落數(shù)量較為穩(wěn)定，對生長環(huán)境要求不高，適合長期保存。比較同一廠家不同年份生產(chǎn)的茶葉金花菌數(shù)量，G2和G11 為貴州FJ 茶葉有限公司間隔約8年生產(chǎn)的茶葉，其“金花菌”數(shù)量均超過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值的5倍以上，表明該公司發(fā)花工藝穩(wěn)定、成熟；G7和G13為鎮(zhèn)寧自治縣JP農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司間隔約1年生產(chǎn)且至今年份較近的產(chǎn)品，其“金花菌”數(shù)量未達(dá)到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，生產(chǎn)工藝需改進(jìn)。

表1 測試樣品ITSq測序分析菌落鑒定結(jié)果

2.2 “金花菌”DNA提取及擴(kuò)增效果

由1.2.2不同培養(yǎng)時間對照試驗(yàn)的PCR電泳結(jié)果可知，培養(yǎng)時間為120 h 的處理1 無電泳條帶（圖2），表示DNA 提取失??；處理2 條帶清晰明顯（圖3），表示DNA提取成功，方法優(yōu)化的效果較好。對15 組“金花菌”菌落使用處理2 即優(yōu)化后的DNA提取方法提取DNA，使用核酸蛋白分析儀測定其純度，其在吸光度OD260/OD280的比值為1.6～1.9 之間，以及PCR 產(chǎn)物凝膠電泳查看DNA 提取和擴(kuò)增效果。自左向右G1～G15，由電泳圖可知目的條帶大小約為500 bp，條帶清晰明顯，DNA提取及擴(kuò)增效果良好。由此驗(yàn)證出一種快速提取“金花菌”DNA的方法，選用細(xì)菌真菌裂解液，控制菌株生長時間，在孟加拉紅瓊脂上，培養(yǎng)72 h 最佳，通過接種環(huán)刮取菌絲，至裂解液中，最快20 min提取DNA成功，節(jié)約大量時間。

圖2 金花菌培養(yǎng)120 h后DNA提取及擴(kuò)增效果凝膠電泳圖

圖3 金花菌培養(yǎng)72 h后DNA提取及擴(kuò)增效果凝膠電泳圖

2.3 “金花菌”系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對G1～G15 共15 組邊銷茶茶樣中“金花菌”的測序結(jié)果通過NCBI 分析選取Score 最高、同源性最大的1組。G1～G15的ITS序列比對結(jié)果如表2，據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，知曉15 組邊銷茶的親緣性。對不同產(chǎn)地及不同年份出廠的茶葉中“金花菌”有預(yù)估性了解，對“發(fā)花”生產(chǎn)工藝所產(chǎn)生的“金花菌”菌群穩(wěn)定性有所掌握。

以表2 中同源性最高的鑒定結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖4 可見，此次篩選的15 組樣品，主要分為3 個分支。每個分支上遺傳距離極為接近，而G12 和G5，G2 和G11，G4 和G10 均屬于同一廠家不同年份生產(chǎn)的邊銷茶，都聚集在同一分支上，表示這些廠家的生產(chǎn)工藝比較穩(wěn)定。G1為外省公司生產(chǎn)的邊銷茶和本省4 家公司的產(chǎn)品在同一分支上，表明邊銷茶中“金花菌”通過自然發(fā)花方式生產(chǎn)，其菌群比較穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群明顯。

圖4 15株“金花菌”基于ITS序列比對Score最高的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 同源性及分值最高的ITS序列比對結(jié)果

3 小結(jié)與討論

ITS序列分析廣泛應(yīng)用于真菌的鑒定，但是對于“金花菌”只能鑒定到散囊菌屬，對于下一步鑒定到種還需要結(jié)合其他鑒定手段。如真菌學(xué)中的形態(tài)分類學(xué)以孢子形態(tài)和子實(shí)體特征為主要分類依據(jù)，同時結(jié)合電子顯微鏡觀察菌絲的結(jié)構(gòu)、生態(tài)等特征；也可以進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析或全基因分析。此次ITS序列分析對于15組測試樣品比對分析后，得出優(yōu)勢菌群范圍為Ascomycetes montevidensis、Ascomycetes amstelodami、Ascomycetes ruber、Ascomycetes chevalieri、Ascomycetes cristatum、Ascomycetes niveoglaucus6種。

“金花菌”作為茯磚茶和黑磚茶等的一個特有的標(biāo)志性特征，其菌落數(shù)量是衡量這一特征的關(guān)鍵性指標(biāo)，生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定和成熟與否與該指標(biāo)存在極大關(guān)系。本次試驗(yàn)中，同一廠家相隔8年生產(chǎn)的G2和G11兩個茶樣“金花菌”是標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值的5 倍以上；15 組試驗(yàn)茶葉據(jù)今生產(chǎn)日期最近的至少有2年時間，其中有7組茶葉“金花菌”數(shù)量均超過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值，表明在合適的儲存條件下，“金花菌”數(shù)量保持一定的穩(wěn)定性，下降趨勢不明顯。對于“金花菌”菌落數(shù)量的檢驗(yàn)是必不可少的，在“金花菌”菌落數(shù)量試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)制樣環(huán)節(jié)也極為重要，應(yīng)使用均質(zhì)器充分震蕩搖勻，否則結(jié)果出入較大。

此次研究中也優(yōu)化出一種快速提取“金花菌”DNA的方法，可以縮短提取時間，且提取效果良好。在此提取過程中一定要控制“金花菌”的培養(yǎng)時間，培養(yǎng)時間過長，易導(dǎo)致菌生長老化，使用試劑盒不易裂解其真菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致其DNA提取失敗。因此培養(yǎng)時間選用72 h為宜，配合試劑盒操作方法，可以快速提取該菌DNA，為后續(xù)開展“金花菌”的分子生物學(xué)研究提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。