黃正壯

(南寧市第一人民醫(yī)院，南寧 530016)

0 引言

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分析方法包括氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)、高壓液相色譜(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和生物傳感器等，其大多敏感性好但耗時(shí)長(zhǎng)，需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員[1]。過(guò)去的幾十年里，科學(xué)研究重點(diǎn)越來(lái)越多的放在開發(fā)和優(yōu)化便攜、廉價(jià)、易用的快速診斷實(shí)驗(yàn)上[2]。而免疫化學(xué)生物分析方法因其高度的特異性和靈敏性備受關(guān)注。目前，大多數(shù)篩查和快速方法都是基于免疫分析。該方法基于分析物/抗原(Ag)與選擇性抗體(Ab)反應(yīng)，形成Ab-Ag復(fù)合物。免疫分析的有效性主要取決于抗體-Ag復(fù)合物形成的效率和檢測(cè)復(fù)合物的形成速度[3]。

側(cè)流免疫層析技術(shù)(lateral flow immunoassay，LFIA)是迄今為止對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)最成功的分析平臺(tái)之一，檢測(cè)速度快，簡(jiǎn)單易用，價(jià)格低廉，應(yīng)用廣泛，已從用于臨床分子、生物體和(生物)標(biāo)志物檢測(cè)擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，包括食品和飼料安全、獸醫(yī)、環(huán)境控制諸多領(lǐng)域。LFIA具有快速、簡(jiǎn)便、易讀、現(xiàn)場(chǎng)適用性好、保質(zhì)期長(zhǎng)、所需體積小、生產(chǎn)成本相對(duì)較低、靈敏度和特異度好、可與電子和電化學(xué)系統(tǒng)集成等優(yōu)點(diǎn)[4]，適用于檢測(cè)多種樣本類型，可以在15 min內(nèi)完成檢測(cè)，通過(guò)對(duì)抗體、標(biāo)記劑和運(yùn)行緩沖液等試劑進(jìn)行優(yōu)化。LFIA設(shè)備可以在室溫下儲(chǔ)存至少2年，非常適合在資源有限的條件下使用[5]。

1 LFIA的基本組成

LFIA由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組成，其按順序固定于背板上面，組成測(cè)試試紙條[6]。

樣品墊作為反應(yīng)的起始點(diǎn)，主要起到加載樣品的作用，材料一般為聚酯纖維膜或玻璃纖維膜。為保證樣品墊能屏蔽樣品內(nèi)非目標(biāo)基質(zhì)對(duì)目標(biāo)基質(zhì)的檢測(cè)干擾，處理不同標(biāo)本時(shí)，根據(jù)標(biāo)本的不同，通常需要不同的預(yù)處理液對(duì)樣品墊進(jìn)行預(yù)處理。

金標(biāo)結(jié)合墊一般由吸水性和均一性良好的玻璃纖維、無(wú)紡布或聚酯纖維制成，根據(jù)使用要求的不同，對(duì)結(jié)合墊的材料、厚度、釋放速度和浸泡前處理進(jìn)行調(diào)整，以保證結(jié)合物的結(jié)合穩(wěn)定性及持續(xù)均勻地遷移至硝酸纖維素膜上。

硝酸纖維素膜是整個(gè)試紙條的檢測(cè)區(qū)域，根據(jù)檢測(cè)樣品的不同，可以在硝酸纖維素膜上包埋不同的抗原或檢測(cè)抗體對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。不同孔徑和不同液體遷移速度的硝酸纖維素膜有不同的特性，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。

吸水墊主要用于吸收廢液，一般由性能穩(wěn)定、吸水量大、吸水性能好的吸水紙制作而成。

襯板主要用于對(duì)各個(gè)組成部分的支撐和組裝，一般由PVC材料制成[7]。

圖1 膠體金免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural diagram of colloidal gold immunochromatographic test strips

如圖1所示，T檢測(cè)線與C質(zhì)控線固定在硝酸纖維素膜上，金標(biāo)結(jié)合墊固定了納米標(biāo)記物，當(dāng)樣品滴加到樣品墊上時(shí)，由于毛細(xì)作用，檢測(cè)樣品從樣品墊方向吸水墊方向流動(dòng)，流經(jīng)金標(biāo)結(jié)合墊時(shí)，樣品與金標(biāo)結(jié)合墊上的納米粒子-抗體復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)形成樣品-納米粒子-抗體復(fù)合物。當(dāng)樣品-納米粒子-抗體復(fù)合物流經(jīng)硝酸纖維素膜時(shí)，又分別與硝酸纖維素膜上的T檢測(cè)線與C質(zhì)控線發(fā)生反應(yīng)，然后根據(jù)T線和C線上的顯色程度進(jìn)行結(jié)果判定[8]。

2 應(yīng)用進(jìn)展

目前，基于LFIA的設(shè)備已被廣泛用于臨床、獸醫(yī)、農(nóng)業(yè)食品和環(huán)境等領(lǐng)域，能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)、核酸、藥物、激素、毒素、病毒和細(xì)菌等[4]。基于以往的研究可以看到，LFIA結(jié)構(gòu)方面，許多納米粒子如脂基納米粒子、聚合物納米粒子及無(wú)機(jī)納米粒子及量子點(diǎn)、磁性、陶瓷和金屬納米粒子(銅、銀、金、鐵)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染檢測(cè)上。在這些金納米粒子中，金納米粒子(AuNPs)由于其表面功能化、優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性、生物識(shí)別和信號(hào)放大特性，提高了與捕獲抗體的偶聯(lián)性，并在LFIA試條上充當(dāng)具有獨(dú)特光學(xué)特性的顏色標(biāo)記，能比其他納米粒子更有效地對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行檢測(cè)[9]。基于金屬納米顆粒(MNPs)的標(biāo)記，特別是金納米顆粒(AuNPs)和銀納米顆粒(AgNPs)具有良好的分析性能、高靈敏度和對(duì)多種檢測(cè)格式的適應(yīng)性，在熒光定量分析中得到了廣泛應(yīng)用。不僅如此，基于金屬納米顆粒(MNPs)的標(biāo)記可以為L(zhǎng)FIA膜的光譜學(xué)或光學(xué)成像提供定量信息。通常使用包括光源、用于收集最佳光信號(hào)的光學(xué)透鏡和易于使用的檢測(cè)器(如互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)或電荷耦合器件(CCD)相機(jī))，通過(guò)測(cè)量對(duì)應(yīng)于T線和C線的信號(hào)并對(duì)背景信號(hào)進(jìn)行信號(hào)校正，和預(yù)先存儲(chǔ)的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)來(lái)獲得目標(biāo)分析物濃度?；谥悄苁謾C(jī)的LFIA，通過(guò)使用智能手機(jī)上配備的閃光燈、高性能CMOS攝像頭和數(shù)據(jù)處理能力，使它能對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定量分析，因此成為L(zhǎng)FIA發(fā)展的新趨勢(shì)[4]。

2.1 臨床應(yīng)用進(jìn)展

孫永等利用膠體金側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)對(duì)新型冠狀病毒IgG/IgM進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)可以在10 min內(nèi)完成。將檢測(cè)結(jié)果與臨床血清樣本檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，達(dá)到80%的準(zhǔn)確率。因其便攜、易用且準(zhǔn)確，因此可用于疫情早期的大量樣本篩查，作為臨床血清檢測(cè)等檢測(cè)手段的有效補(bǔ)充[10]。

隨著細(xì)菌感染的高患病率及全球抗生素耐藥性的增加，如何早期確定病原菌成為臨床實(shí)踐中的一項(xiàng)日益緊迫和困難的任務(wù)。世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告稱，抗生素耐藥性是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因此需要一種快速而準(zhǔn)確的技術(shù)來(lái)對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行檢測(cè)。LFIA是一種對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速診斷的理想技術(shù)。近年來(lái)，幾種基于LFIA的試條被用于檢測(cè)細(xì)菌感染，其目標(biāo)是從致病菌、全細(xì)胞、DNA或生物標(biāo)記物等范圍內(nèi)的分析特定的分析物[9]。Martina Zangheri等開發(fā)了一種基于智能手機(jī)集成的化學(xué)發(fā)光(CL)-側(cè)向流動(dòng)免疫分析(LFIA)方法的生物傳感器，用于定量檢測(cè)唾液皮質(zhì)，檢出限為0.3 ng/mL，定量分析范圍為0.3～60 ng/mL[11]。

2.2 食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

食品安全是全球衛(wèi)生工作的重中之重。國(guó)外有團(tuán)隊(duì)將基于智能手機(jī)的檢測(cè)應(yīng)用于傳統(tǒng)的LFIA技術(shù)，發(fā)明了一種便攜式生物傳感器，用于葡萄酒和速溶咖啡樣品中赭曲霉毒素A(OTA)的定量檢測(cè)，可迅速識(shí)別可疑食品批次，及早追查污染源頭，從而大大改善食品安全[12]。國(guó)內(nèi)亦有類似報(bào)道，姚幫本等利用膠體金側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)對(duì)多種蔬菜中腐霉利進(jìn)行檢測(cè)[13]。另有使用雙重膠體試紙條檢測(cè)法對(duì)牛乳中四環(huán)素和青霉素的檢測(cè)[14]及有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)等[15]。

2.3 其他領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

LFIA還應(yīng)用于其他領(lǐng)域。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近10年來(lái)，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的40%，其中LFIA主要用于檢測(cè)植物病害。其次是工業(yè)產(chǎn)品或過(guò)程質(zhì)量監(jiān)測(cè)占22%。法醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用達(dá)22%，如血液和非法物質(zhì)檢測(cè)及環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)[3]。LFIA在文物研究和保護(hù)領(lǐng)域也得到了應(yīng)用，可通過(guò)LFIA來(lái)檢測(cè)文化遺產(chǎn)項(xiàng)目中的蛋白質(zhì)物質(zhì)[16]。或使用膠體金標(biāo)記多克隆抗體的便攜式免疫層析試條(ICS)對(duì)絲綢進(jìn)行定性檢測(cè)等[17]。

3 發(fā)展趨勢(shì)

LFIA的簡(jiǎn)單、易用、便攜等特性使其得到了廣泛應(yīng)用。但是，LFIA的廣泛應(yīng)用也存在著一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。非專業(yè)或未經(jīng)培訓(xùn)的人員使用其可能會(huì)出現(xiàn)因操作失誤或?qū)Y(jié)果的判讀失誤而造成相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)或損失。讓LFIA結(jié)果更準(zhǔn)確易讀、操作更加簡(jiǎn)單將是LFLA的發(fā)展方向。

目前，大多數(shù)LFIA還只能用于定性診斷。未來(lái)的發(fā)展方向?qū)⑹菍?duì)分析物進(jìn)行靈敏的定量檢測(cè)，使用手機(jī)對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行定量判讀將成為未來(lái)的重要趨勢(shì)[12]。LFIA檢測(cè)方法中，基于AuNPs及其衍生物的光學(xué)方法最有可能發(fā)展并成為最可行的快速診斷實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，因?yàn)槠浜?jiǎn)單且容易集成在傳統(tǒng)LFIA條帶中。此外，使用具有較小熱響應(yīng)的基膜可以進(jìn)一步提高熱敏LFIA檢測(cè)方法的檢測(cè)極限。隨著微型機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)、光電光源和傳感器技術(shù)的進(jìn)步和智能手機(jī)等移動(dòng)設(shè)備的使用，將促進(jìn)LFIA向智能化方向發(fā)展。智能手機(jī)的無(wú)線網(wǎng)絡(luò)連接能力使遠(yuǎn)程診斷成為現(xiàn)實(shí)，通過(guò)智能手機(jī)，檢測(cè)結(jié)果可以在手機(jī)上顯示、存檔，并傳輸給初級(jí)保健醫(yī)生或醫(yī)療中心，進(jìn)行詳細(xì)分析[18]。

4 結(jié)語(yǔ)

LFIA技術(shù)因其低廉、便攜、可靠、易用等特性得到了廣泛應(yīng)用，已成為臨床、食品安全、獸醫(yī)和環(huán)境檢測(cè)中重要快速的診斷手段。目前，金納米粒子比色檢測(cè)仍是最廣泛使用的檢測(cè)方法。提高LFIA技術(shù)的靈敏度及對(duì)檢測(cè)物進(jìn)行定量分析是近幾十年來(lái)研究最多的內(nèi)容。