楊志，秦冬梅*，周波，肖光軍

(1.大英縣人民醫(yī)院，四川 大英 629300；2.遂寧市中心醫(yī)院，四川 遂寧 629000)

自2020年1月11日初步判定“不明原因病毒肺炎”的病原體為一種新的冠狀病毒以來[1]，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)逐漸在全球范圍內(nèi)大流行，且不斷變異，世界衛(wèi)生組織已發(fā)布多個需要關(guān)注的變異株(VOC)和需要留意的變異株(VOI)。2021年11月9日在南非第一次被檢測出、并逐漸成為世界各地流行的優(yōu)勢毒株的奧密克戎(Omicron)變異株正是屬于VOC，初步證據(jù)表明其對人群再感染風(fēng)險增高[2]；另外，已接種新冠疫苗的病例分類以無癥狀感染者為主[3]。以上雙重因素使病毒可能會更快速且隱匿地傳播，增加了及早發(fā)現(xiàn)并迅速控制疫情的難度。因此，當(dāng)前疫情防控壓力仍然巨大，不可松懈。

2021年8月國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗(yàn)中心舉辦的新型冠狀病毒德爾塔變異株核酸檢測室質(zhì)評活動中，有來自31 個省(市、自治區(qū))的共8 488 家實(shí)驗(yàn)室參加[4]，這些實(shí)驗(yàn)室為全面落實(shí)“外防輸入、內(nèi)防反彈”的防控策略和“及時發(fā)現(xiàn)散發(fā)病例和聚集性疫情”提供了有力保障[5]。然而在上述實(shí)驗(yàn)室中，屬于新建的比例很高，工作人員缺乏核酸檢測實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的比例也相應(yīng)很高，但是新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性對疫情防控來說至關(guān)重要，故任何可能對結(jié)果準(zhǔn)確性造成影響的因素都值得探討。實(shí)時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)是我國檢測新冠病毒核酸時使用比例最高的方法[4]，其反應(yīng)體系(擴(kuò)增試劑和核酸樣本的混合液)是需要先混勻再瞬離后上機(jī)檢測，還是直接瞬離后上機(jī)檢測，《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[6]和試劑說明書等相關(guān)資料均未對此給出明確的答案，亦未見相關(guān)報道。本研究探討了上述操作差異對檢測結(jié)果的影響，以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室《標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》的編寫，從而規(guī)范人員操作，保證新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑及耗材

兩種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)：試劑1由圣湘生物科技股份有限公司提供，試劑2由達(dá)安基因股份有限公司提供。8聯(lián)PCR管(0.2 mL，光學(xué)平蓋)則由帝恩生物科技(香港)有限公司提供。生理鹽水由四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 儀器

全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(Gentier96E)由西安天隆科技有限公司提供，快速混勻器(XK80-A)由江蘇新康醫(yī)療器械有限公司提供，掌上離心機(jī)(D1008E)由大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司提供。

1.2 樣本來源

以試劑盒中的陽性對照為試驗(yàn)樣本，其中樣本1為試劑1的陽性對照，樣本2為試劑2的陽性對照。

1.3 方法

1.3.1 試劑1的檢測方法

用生理鹽水對樣本1進(jìn)行系列稀釋，制備成含不同初始模板數(shù)量的試驗(yàn)樣本：高濃度試驗(yàn)樣本(1∶1)、中濃度試驗(yàn)樣本(1∶10)和低濃度試驗(yàn)樣本(1∶100)，每個濃度水平均設(shè)置混勻組和未混勻組，每組各8 孔。用試劑1進(jìn)行檢測，觀察每個濃度水平兩組的檢測結(jié)果，以閾值循環(huán)數(shù)(Ct)表示。觀察每個濃度水平兩組檢測結(jié)果的差異。兩組試驗(yàn)按下文1.3.3的處理方法。試驗(yàn)參數(shù)：樣本量20 μL、試劑量30 μL。循環(huán)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃，30 min；預(yù)變性95 ℃，1 min；擴(kuò)增95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s(采集熒光)，循環(huán)45 次。

1.3.2 試劑2的檢測方法

用生理鹽水對樣本2進(jìn)行系列稀釋，制備成含不同初始模板數(shù)量的試驗(yàn)樣本：高濃度試驗(yàn)樣本(1∶1)、中濃度試驗(yàn)樣本(1∶10)和低濃度驗(yàn)樣本(1∶100)，每個濃度水平均設(shè)置混勻組和未混勻組。每組8 孔，用試劑2進(jìn)行檢測，觀察每個濃度水平兩組檢測結(jié)果(以Ct值表示)的差異。兩組試驗(yàn)按下文1.3.3的處理方法。試驗(yàn)參數(shù)：樣本量5 μL、試劑量20μL。循環(huán)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 2min；預(yù)變性95 ℃2 min；預(yù)擴(kuò)增95 ℃ 5 s，60 ℃ 35s，循環(huán)10次；擴(kuò)增95 ℃ 5 s，65 ℃ 35 s(采集熒光)，循環(huán)32 次。

1.3.3 混勻組與未混勻組的處理方法

混勻組的處理方式：將樣本加入裝有擴(kuò)增試劑的8聯(lián)管，蓋嚴(yán)管蓋，先用掌上離心機(jī)離心5 s(將管壁液體集中于管底)，再用快速混勻器振蕩10 s，最后用掌上離心機(jī)離心15 s，立即用PCR分析儀進(jìn)行擴(kuò)增分析。未混勻組的處理方式：將樣本加入裝有擴(kuò)增試劑的8聯(lián)管，蓋嚴(yán)管蓋，用掌上離心機(jī)離心15 s，立即用PCR分析儀進(jìn)行擴(kuò)增分析。每對混勻組和未混勻組平行進(jìn)行，其所用樣本、試劑均為同批同瓶，耗材批號相同，儀器設(shè)備為同一臺。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 試劑1各濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結(jié)果比較

用試劑1檢測時，每個濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結(jié)果見表1；兩個靶基因各濃度水平的組間結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 試劑1混勻組與未混勻組Ct值比較

2.2 試劑2各濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結(jié)果比較

用試劑2檢測時，每個濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結(jié)果見表2。各濃度水平的兩組結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示高濃度兩個靶基因和中濃度N基因的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對有統(tǒng)計學(xué)意義的組間差異進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示各組間的均值之差在0.5以內(nèi)則在臨床可接受范圍，即可認(rèn)為這些組間差異無臨床意義(見表3)。

表2 試劑2混勻組與未混勻組Ct值的比較

3 討 論

新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果是確定新冠肺炎確診病例和無癥狀感染者的關(guān)鍵依據(jù)[5]，其準(zhǔn)確性的重要性不言而喻。我國普遍使用實(shí)時熒光RT-PCR法，在檢測核酸時具有操作簡便、效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8]，但樣本的質(zhì)量、檢測人員的操作、儀器設(shè)備的狀態(tài)、試劑的質(zhì)量、核酸污染、非特異性擴(kuò)增等眾多因素都會影響檢測結(jié)果[9]。為了規(guī)范實(shí)驗(yàn)室工作人員的操作，以提高人員之間和實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，本研究初步探討了反應(yīng)體系混勻與否對新型冠狀病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測結(jié)果的影響。

本研究結(jié)果顯示，對于逆轉(zhuǎn)錄時間較長的實(shí)時熒光PCR試劑(試劑1)而言，其檢測高、中、低濃度水平的樣本時，各混勻組與非混勻組檢測結(jié)果的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明其反應(yīng)體系混勻與否對檢測結(jié)果無影響；而逆轉(zhuǎn)錄時間較短的試劑(試劑2)在檢測不同濃度水平的樣本時則表現(xiàn)出一定差異：部分組間結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些組間的結(jié)果差異在0.5以內(nèi)。而實(shí)時熒光PCR試驗(yàn)的樣本初始模板量X與Ct值的關(guān)系如下：

logX=-Ct×log(1+E)+logYCt

其中，E表示擴(kuò)增效率，YCt表示熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值時擴(kuò)增產(chǎn)物的量[10]。

根據(jù)以上關(guān)系，可以計算出當(dāng)Ct值偏差<0.5時，logX差異不足0.15(假設(shè)擴(kuò)增效率E為1)，滿足分子診斷領(lǐng)域?qū)傇试S誤差(TEa)的要求(靶值±0.4對數(shù)值)[11]，陳培松等[7]認(rèn)為偏差小于1的Ct值可視為一致。因此可以認(rèn)為試劑2檢測不同濃度水平的樣本時，反應(yīng)體系混勻與否對檢測結(jié)果亦無影響。對于兩種試劑所表現(xiàn)出的細(xì)微差異，可能與液體間的擴(kuò)散特性有關(guān)，試劑和樣本加在一起后，即使不通過振蕩混勻，兩者也可通過液體間相互擴(kuò)散而自然達(dá)到混勻狀態(tài)，但自然混勻與溫度、時間等因素有關(guān)：在一定范圍內(nèi)，溫度越高、時間越長則兩者混勻越充分。兩種試劑的逆轉(zhuǎn)錄溫度均為50 ℃，較高的溫度有利于樣本與試劑自然混勻，但兩者在此階段的時長差別顯著，可能是造成它們表現(xiàn)不同的原因之一。試劑1的逆轉(zhuǎn)錄時間為30 min，試劑2為2 min。對于試劑1來說，除去自然混勻所需的時間，此階段剩余的時間仍然足夠長，兩組反應(yīng)體系反應(yīng)的充分程度幾乎無差別，所以組間結(jié)果無差異；而對于試劑2，因其此階段時間太短，未混勻組反應(yīng)體系反應(yīng)的充分程度可能不及混勻組，所以組間結(jié)果有細(xì)微差異。至于試劑2在檢測不同濃度樣本時所表現(xiàn)出的差異，則可能與檢測系統(tǒng)的精密度隨分析物濃度降低而降低這一規(guī)律有關(guān)，即對于低濃度樣本，其檢測結(jié)果的精密度相對較差[12]，掩蓋了操作差異引起的結(jié)果偏差。從表1和表2也可以看出，隨著樣本濃度降低，檢測結(jié)果的精密度變小(標(biāo)準(zhǔn)差變大)。

綜上所述，本研究認(rèn)為：在用實(shí)時熒光RT-PCR法檢測新型冠狀病毒核酸時，反應(yīng)體系是否預(yù)先混勻?qū)τ跈z測結(jié)果無影響。因此在工作中反應(yīng)體系不必進(jìn)行瞬離前的混勻操作，可以減少操作步驟，提高工作效率，其效果在大規(guī)模核酸檢測時會顯得更明顯。

本研究的局限性在于：樣本來自于試劑盒的陽性對照，可能與臨床樣本存在差異；兩種試劑來自于不同廠家，兩者除了逆轉(zhuǎn)錄時長不同，樣本與試劑的體積亦不同，因此兩種試劑表現(xiàn)出的細(xì)微差異不能充分說明是由逆轉(zhuǎn)錄時長不同造成的，亦可能與樣本試劑體積有關(guān)。本研究所選用試劑種類較少，結(jié)論是否適用其他相同方法的試劑盒還有待驗(yàn)證。