徐夢(mèng)婷 郝艷賓 齊建勛 丁保淼 陳永浩

蛋白質(zhì)是人體所需的六大營(yíng)養(yǎng)素之一，主要存在于畜禽肉、奶類(lèi)、蛋類(lèi)、谷物、豆類(lèi)等食物中。在以蛋白質(zhì)為主要組分的食品體系中，蛋白質(zhì)可與碳水化合物、脂肪、無(wú)機(jī)鹽等相互作用，共同決定食品體系的營(yíng)養(yǎng)特性和感官特性。具有抗氧化活性的酚類(lèi)物質(zhì)同樣可與蛋白組分形成復(fù)合物，使蛋白在結(jié)構(gòu)、功能和營(yíng)養(yǎng)特性等方面發(fā)生變化。

多酚作為植物源食品原料的重要組成成分，廣泛存在于核桃、花生、杏仁、栗仁、谷物、豆類(lèi)中。在很多植源性食品加工中，多酚組分往往需要脫除以減少給產(chǎn)品帶來(lái)色澤、風(fēng)味等方面的不利影響。但多酚組分的脫除不僅增加了加工成本，還減少了多酚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，如何使多酚與蛋白在食品體系中共存是植源性食品加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。此外，多酚對(duì)蛋白特性的影響也受到不少研究者關(guān)注。目前，有關(guān)多酚與蛋白相互作用的研究主要集中在多酚生物可及性[1]、運(yùn)載體系功能活性[2]等方面，研究擬在聚焦食品原料體系中多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)特性的影響，著重闡述多酚與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)、加工特性等方面的研究進(jìn)展，以期為相關(guān)食品的研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 多酚與蛋白質(zhì)相互作用

多酚與蛋白質(zhì)的相互作用取決于蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)與類(lèi)型，同時(shí)也受溫度和pH的影響[3]，多酚和蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)制涉及共價(jià)作用、非共價(jià)作用、共價(jià)—非共價(jià)的相互作用。目前用于鑒定蛋白質(zhì)和多酚相互作用的方法包括熒光猝滅、圓二色譜、傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡、反相高效液相色譜、電噴霧電離質(zhì)譜、X射線衍射分析等[4]。

1.1 非共價(jià)作用

非共價(jià)相互作用一般是可逆的，并且比共價(jià)對(duì)應(yīng)物弱。通常，氫鍵和疏水相互作用是多酚和蛋白質(zhì)發(fā)生非共價(jià)結(jié)合時(shí)的主要作用力[5-6]，離子鍵在蛋白質(zhì)和多酚相互作用中起次要作用，如圖1所示。例如，Xu等[8]研究表明茶黃素通過(guò)疏水相互作用與β-乳球蛋白的Met-107、Asn-90、Asn-88、Leu-87、Ala-86、Lys-69、Lys-60、Val-41和Leu-39殘基相互作用。Jiang等[9]觀察到新橙皮苷二氫查耳酮和α-乳清蛋白的相互作用主要是依靠疏水相互作用。此外，多酚中的羥基有助于多酚與氨基酸殘基的潛在氫結(jié)合。例如，表兒茶素(epicatechin，EC)B環(huán)上的羥基可通過(guò)氫鍵與唾液中富含脯氨酸的蛋白質(zhì)中的羰基或酰胺基團(tuán)結(jié)合[10]。兒茶素也可以通過(guò)氫鍵與大豆7S蛋白的Trp328、Gln365、Asn369和Asp334結(jié)合[11]。此外，離子鍵也會(huì)參與多酚和蛋白質(zhì)之間的相互作用。Carnovale等[12]發(fā)現(xiàn)，鈣的存在會(huì)影響αS1-酪蛋白和EGCG之間的相互作用，隨著鈣離子的加入，去質(zhì)子化的EGCG可通過(guò)離子鍵與αS1-酪蛋白上的羧基或磷酸基團(tuán)形成橋接，導(dǎo)致粒徑的大幅增加。

圖1 蛋白質(zhì)和多酚的非共價(jià)結(jié)合[7]Figure 1 Noncovalent conjugation of proteins and polyphenols

此外，研究[13]表明，熱力學(xué)參數(shù)可用于確定多酚和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合類(lèi)型。焓和熵大于零(ΔH>0，ΔS>0)的變化被用來(lái)表示疏水相互作用，焓和熵小于零(ΔH<0，ΔS<0)的變化被用來(lái)表示范德華力和氫鍵，而焓小于零、熵大于零(ΔH<0，ΔS>0)的變化被用來(lái)表示靜電相互作用。例如，膠原蛋白和沒(méi)食子酸自由能變化(ΔG)全部小于0，表明鍵合過(guò)程是自發(fā)的。此外，溫度也會(huì)影響多酚和蛋白質(zhì)之間非共價(jià)相互作用的類(lèi)型。據(jù)報(bào)道[14]，在EGCG與β-乳球蛋白的復(fù)合物中，范德華力和氫鍵作用在60 ℃以上出現(xiàn)，而靜電相互作用在85 ℃以上出現(xiàn)。

1.2 共價(jià)作用

共價(jià)鍵是多酚和蛋白質(zhì)之間不可逆結(jié)合的結(jié)果。多酚與蛋白質(zhì)之間出現(xiàn)共價(jià)鍵主要是因?yàn)轷虬膈杂苫男纬?。多酚在堿性條件下容易被氧化成半醌自由基，隨后半醌自由基重新排列成醌。同時(shí)由于醌類(lèi)物質(zhì)具有親電性，它們可以與蛋白質(zhì)分子上的親核基團(tuán)反應(yīng)，從而形成共價(jià)鍵。豬血漿蛋白水解物與氧化酚類(lèi)化合物之間，通過(guò)C—S或C—N共價(jià)鍵與多肽的巰基或氨基側(cè)鏈形成二聚體或共價(jià)偶聯(lián)物，誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)的微聚集[15]。因此，巰基和氨基的減少被認(rèn)為是蛋白質(zhì)共價(jià)修飾的標(biāo)志。例如，Liu等[16]研究結(jié)果表明蛋白質(zhì)中巰基和游離氨基含量降低且偶聯(lián)物分子量增加，這證實(shí)了乳清蛋白分離物與多酚之間形成了共價(jià)鍵。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)南瓜籽分離蛋白和焦沒(méi)食子酸之間的共價(jià)相互作用依賴(lài)于蛋白質(zhì)的游離氨基，由于氧的存在，焦沒(méi)食子酸相鄰的兩個(gè)酚羥基被氧化形成鄰醌，然后鄰醌被蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基還原，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和焦沒(méi)食子酸之間形成C—N共價(jià)鍵。此外，在高溫條件下多酚和蛋白質(zhì)也可能發(fā)生共價(jià)結(jié)合[18]。據(jù)報(bào)道[19]，大蒜素與乳清蛋白b-乳球蛋白在高溫處理?xiàng)l件下發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以及氨基酸暴露程度增加。

多酚的羥基和芳香環(huán)的數(shù)量決定了其與蛋白質(zhì)共價(jià)相互作用的程度。據(jù)報(bào)道[20]，與苯甲酸衍生物相比，肉桂酸衍生物與蛋白質(zhì)會(huì)形成更多的共價(jià)鍵。此外，多酚的濃度也會(huì)影響與蛋白質(zhì)共價(jià)相互作用的穩(wěn)定性。例如，低濃度的氧化EGCG由于交聯(lián)與大豆分離蛋白形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而高濃度的氧化EGCG會(huì)使蛋白質(zhì)反應(yīng)位點(diǎn)飽和從而阻礙交聯(lián)[21]。

2 多酚與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響

多酚和蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)改變天然蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)、晶體和微觀結(jié)構(gòu)。例如，綠原酸和乳清蛋白分離物非共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致無(wú)序結(jié)構(gòu)形成，具體表現(xiàn)為α-螺旋和β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量增加[22]。其中氫鍵是維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的主體力量，因此α-螺旋構(gòu)象的變化與蛋白質(zhì)疏水區(qū)域內(nèi)氫鍵與多酚結(jié)合有關(guān)，而β-折疊含量的減少則與蛋白質(zhì)疏水性區(qū)域展開(kāi)后蛋白質(zhì)位點(diǎn)暴露增加有關(guān)，特征結(jié)構(gòu)的變化使得蛋白質(zhì)變得高度無(wú)序。但多酚和蛋白質(zhì)絡(luò)合也可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成有序結(jié)構(gòu)，例如，樟樹(shù)籽仁蛋白和酚類(lèi)化合物通過(guò)共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致β-折疊增加(從19.81%增加到21.39%)和無(wú)規(guī)卷曲減少(從26.07%減少到24.87%)[23]。

有研究[24]表明，與天然蛋白質(zhì)相比，多酚的濃度、類(lèi)型、結(jié)構(gòu)和反應(yīng)pH值會(huì)導(dǎo)致多酚—蛋白復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。例如，單寧酸、沒(méi)食子酸和EGCG這些多酚主要通過(guò)氫鍵與肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)相互作用，使MP的二級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)并降低了MP的表面疏水性，而槲皮素和槲皮苷主要通過(guò)靜電相互作用與MP發(fā)生相互作用，從而保留了α螺旋結(jié)構(gòu)，提高了蛋白表面疏水性[25]。pH值對(duì)多酚和蛋白質(zhì)之間相互作用影響主要體現(xiàn)在結(jié)合位點(diǎn)上，當(dāng)pH<7.0時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生解離，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與多酚相互作用的結(jié)合位點(diǎn)暴露，因而蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的親和力。例如，牛血清白蛋白在pH 4.9 下與單寧酸結(jié)合的親和力高于pH 7.8時(shí)的[26]。

熒光光譜法可以廣泛用于監(jiān)測(cè)與多酚相互作用后，天然蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，具體變化表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，例如，乳清蛋白分離物的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為335.8 nm，與酚類(lèi)化合物結(jié)合后最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，并且與對(duì)照組相比，酚類(lèi)化合物和乳清蛋白分離物的絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度明顯降低。這些現(xiàn)象表明，多酚和蛋白相互作用誘導(dǎo)了乳清蛋白分離物三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[27]。此外，最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移還可能與芳香族氨基酸殘基周?chē)植凯h(huán)境極性的變化有關(guān)。例如，扁豆蛋白與槲皮素、鞣花酸和蘆丁的相互作用未出現(xiàn)紅移，主要是由于扁豆蛋白的芳香族氨基酸殘基極性環(huán)境無(wú)太大變化[28]。

與天然蛋白質(zhì)相比，多酚和蛋白復(fù)合物具有更高的結(jié)晶度、更大的晶體尺寸以及具有更大的片狀結(jié)構(gòu)和更光滑的表面。這也進(jìn)一步證明多酚和蛋白的相互作用會(huì)使有序蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲。例如，單寧酸和沒(méi)食子酸二者均通過(guò)疏水相互作用改變了酪蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，分別使酪蛋白形成了致密和松散的結(jié)構(gòu)。綜上，多酚和蛋白相互作用會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生至關(guān)重要的影響，從而引起蛋白特性的改變。

3 多酚與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)蛋白特性的影響

表1例舉了一些多酚和蛋白質(zhì)相互作用的例子及二者相互作用對(duì)蛋白特性的影響。

3.1 對(duì)溶解性的影響

由表1可知，蛋白質(zhì)與多酚相互作用可以增加或減少蛋白質(zhì)的溶解性。例如，綠原酸通過(guò)非共價(jià)相互作用與酪蛋白和乳清分離蛋白相互作用形成復(fù)合物，導(dǎo)致酪蛋白和乳清分離蛋白的溶解度顯著提高[29]；MP與槲皮素的偶聯(lián)暴露了蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水氨基酸以及增加了α螺旋含量，在MP中產(chǎn)生更多的疏水位點(diǎn)，導(dǎo)致MP溶解度降低[25]。類(lèi)似研究[30]還有MP在茶多酚存在下溶解度顯著降低，主要是由于茶多酚會(huì)導(dǎo)致MP聚集，使最初可溶性MP形成更大的不溶性MP聚集體。因此，單個(gè)肌原纖維蛋白分子和多酚之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解性降低。

表1 蛋白質(zhì)—多酚相互作用對(duì)結(jié)構(gòu)變化和蛋白特性的影響Table 1 Effects of protein-polyphenol interactions on structural changes and protein characteristics

3.2 對(duì)凝膠性的影響

由表1可知，多酚和蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)引起凝膠性能發(fā)生變化。例如，交聯(lián)明膠—多酚顯著增強(qiáng)了凝膠強(qiáng)度，并且使表面更緊湊[38]；酶促反應(yīng)制備的墨魚(yú)皮明膠和沒(méi)食子酸的偶聯(lián)物提高了墨魚(yú)皮明膠的凝膠強(qiáng)度[31]。此外，據(jù)報(bào)道[39]茶多酚也能促進(jìn)β-乳球蛋白的變形和聚集性，使β-乳球蛋白凝膠的相對(duì)黏彈性降低，并通過(guò)較低的膠凝溫度和較短的膠凝時(shí)間證明了凝膠化的增強(qiáng)。綜上，不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)和多酚相互作用可改善凝膠性能。

然而，Tang等[32]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)自由基移植法制備的迷迭香酸—蛋白質(zhì)復(fù)合物對(duì)MP凝膠化產(chǎn)生不利影響。迷迭香酸—半胱氨酸相互作用阻斷了MP上硫醇基團(tuán)形成二硫鍵交聯(lián)，并通過(guò)破壞蛋白質(zhì)凝膠化削弱凝膠強(qiáng)度。Jia等[40]研究發(fā)現(xiàn)，添加兒茶素后，MP的凝膠強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯降低，且添加的兒茶素濃度越高，MP凝膠強(qiáng)度下降越顯著。

3.3 對(duì)熱穩(wěn)定性的影響

由表1可知，多酚和蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)引起產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性發(fā)生變化。例如，糖化MP-EGCG偶聯(lián)物的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白表現(xiàn)出高的熱變形溫度，分別為67.52，72.94 ℃，明顯高于對(duì)照MP的值，表明EGCG可以提高糖化MP的熱穩(wěn)定性[41]；亞麻籽分離蛋白與酚類(lèi)化合物的共價(jià)結(jié)合顯著提高了亞麻籽分離蛋白的變性溫度，表明復(fù)合物熱穩(wěn)定性增加[33]。因此，多酚和蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)熱穩(wěn)定性有積極影響。多酚與蛋白質(zhì)相互作用也會(huì)導(dǎo)致焓變化。例如，阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)與牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)相互作用后熔點(diǎn)溫度升高，表明BSA與FA絡(luò)合時(shí)牛血清蛋白的熱穩(wěn)定性增加[34]。另外，乳鐵蛋白與多酚(綠原酸和EGCG)的結(jié)合也可以抑制乳鐵蛋白在中性pH下的熱聚集[35]。因此，動(dòng)物蛋白和多酚相互作用是增強(qiáng)經(jīng)過(guò)熱處理的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的潛在技術(shù)。

3.4 對(duì)乳化性的影響

控制乳化性能的關(guān)鍵因素是蛋白質(zhì)的表面疏水性，較高的表面疏水性可以增強(qiáng)乳化性和穩(wěn)定性。多酚和蛋白質(zhì)的偶聯(lián)可以增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，從而增強(qiáng)天然蛋白質(zhì)的乳化性。例如，Abd El-Maksoud等[36]將咖啡酸與β-乳球蛋白在堿性條件下共價(jià)偶聯(lián)，所得的復(fù)合物顯示出比天然β-乳球蛋白更好的乳化性能；Chen等[15]研究表明當(dāng)氧化綠原酸和氧化單寧酸加入豬血漿蛋白水解物中時(shí)，水解物的乳化活性指數(shù)和乳液穩(wěn)定性指數(shù)顯著增加，可能原因是豬血漿蛋白水解物與氧化綠原酸的復(fù)合物可以迅速吸附在界面上，并在油滴周?chē)纬筛竦慕缑婺ぃ瑥亩鰪?qiáng)乳化性能。然而，多酚和蛋白質(zhì)相互作用也會(huì)對(duì)乳液乳化性產(chǎn)生負(fù)面影響，但對(duì)乳液穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響。例如，Chen等[42]觀察到卵清蛋白和單寧酸的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)產(chǎn)生了掩蔽作用，從而降低了卵清蛋白在其等電點(diǎn)附近的界面活性，并通過(guò)延緩乳液在卵清蛋白等電點(diǎn)的乳化作用，提高了乳液的穩(wěn)定性。

3.5 對(duì)致敏性的影響

多酚和蛋白質(zhì)的相互作用可降低蛋白致敏性。食品過(guò)敏反應(yīng)通常由免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)介導(dǎo)引起[43]，而蛋白質(zhì)—多酚復(fù)合物可通過(guò)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，允許消化酶破壞IgE結(jié)合表位，使抗原表位在消化過(guò)程中不被含有過(guò)敏原特異性IgE的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞識(shí)別[44]。例如，Wu等[37]研究發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白與EGCG和綠原酸結(jié)合后β-乳球蛋白的致敏能力降低；Plundrich等[45]用蔓越莓或藍(lán)莓多酚修飾花生蛋白，發(fā)現(xiàn)IgE與花生蛋白的結(jié)合降低了38%。因此，讓多酚與食物中蛋白質(zhì)相互作用可能是生產(chǎn)低過(guò)敏性食物的新思路。

3.6 對(duì)抗氧化活性的影響

諸多研究表明，多酚和蛋白質(zhì)相互作用形成的復(fù)合物比天然蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更好的抗氧化活性。例如，F(xiàn)an等[46]采用自由基誘導(dǎo)的嫁接法制備了BSA和咖啡酸(CA)復(fù)合物，BSA-CA復(fù)合物的DPPH自由基清除活性顯著高于BSA，表明BSA-CA復(fù)合物抗氧化活性顯著提高；Jing等[47]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用堿性/自由基方法與茶多酚共價(jià)結(jié)合，蛋清蛋白的抗氧化活性顯著提高；乳清蛋白分離物(whey protein isolate，WPI)和4種多酚(EGCG、QC、AG和NC)的偶聯(lián)物與未修飾的WPI相比，WPI-EGCG、WPI-QC、WPI-AG和WPI-NG的DPPH自由基清除活性分別顯著提高了42.26%，34.20%，26.56%，34.41%，即所有偶聯(lián)物都表現(xiàn)出更高的抗氧化活性[16]。多酚和蛋白質(zhì)復(fù)合物的溶解度變化會(huì)影響蛋白抗氧化活性。例如，Pham等[48]報(bào)道亞麻籽蛋白分離物(FPI)與酚類(lèi)化合物(亞麻籽多酚和羥基酪醇)絡(luò)合顯著改變了FPI的溶解度，并且與FPI穩(wěn)定乳液相比，酚醛配合物乳液具有更高的抗氧化穩(wěn)定性。因此，蛋白質(zhì)的抗氧化活性可以通過(guò)與多酚形成復(fù)合物來(lái)增強(qiáng)，從而改善食品的氧化穩(wěn)定性。

4 結(jié)語(yǔ)

多酚與蛋白之間的相互作用可以是非共價(jià)的，比如疏水相互作用或氫鍵等；也可以是在多酚轉(zhuǎn)變成醌或半醌自由基后與蛋白質(zhì)進(jìn)行的共價(jià)結(jié)合。二者之間的相互作用受蛋白質(zhì)和酚類(lèi)化合物類(lèi)型、溫度和pH的共同影響，最終引起蛋白質(zhì)特性的改變。未來(lái)在多酚與蛋白相互作用的機(jī)理研究方面，進(jìn)一步明確不同種類(lèi)的多酚及混合多酚與特定蛋白組分之間的相互作用機(jī)制是該領(lǐng)域的重要研究方向，在應(yīng)用層面，通過(guò)多酚與蛋白相互作用研究，調(diào)控食品加工和貯運(yùn)過(guò)程中蛋白的特性，為開(kāi)發(fā)多酚與蛋白等多組分共存的食品奠定基礎(chǔ)，更好地發(fā)揮多酚和蛋白兩種組分的有益作用，同時(shí)減少在原料處理階段多酚與蛋白的分離，簡(jiǎn)化操作單元設(shè)置，降低生產(chǎn)成本，這也將是未來(lái)發(fā)展方向之一。