董紅影 龐會娜 肖鳳琴 邵 帥 嚴(yán)銘銘

高脂血癥主要是由于脂質(zhì)代謝異常所引起。在機體內(nèi)脂類物質(zhì)甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)偏高則會導(dǎo)致高血脂癥[1]。目前的降血脂藥物通過與膽固醇結(jié)合為膽酸鹽排出體外，起到降血脂作用[2]。

葛根為豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根，含有黃酮類、三萜類、生物堿類等多種化合物[3]，其中葛根黃酮是其主要有效活性成分之一[4]。研究[5-6]表明，黃酮類化合物能夠清除人類血液中的膽固醇與脂肪。目前黃酮類化合物的制備方法較多，包括水提法、有機溶劑萃取法、酸堿水解法等[7]，而乙醇提取法可克服水提物易霉變、其他有機溶劑毒性大等缺點，提取率高，后續(xù)的干燥及過濾等操作也比較容易進行，且有關(guān)葛根醇提物的降脂活性尚未見報道。

研究擬以膽固醇、油脂吸附量及膽酸鹽結(jié)合量為評價指標(biāo)優(yōu)化葛根醇提工藝，并用棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建脂肪肝細(xì)胞模型進一步驗證，探究葛根醇提物體外降脂功效，以期為其進一步體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根藥材：長春市某藥房；

無水乙醇：分析純，無錫市晶科化工有限公司；

DMEM高糖培養(yǎng)基(含雙抗)：美國Gibco公司；

油紅O染色液：上海源葉生物科技有限公司；

棕櫚酸(PA)：美國Solarbio公司；

總膽固醇(TC)試劑盒以及甘油三酯(TG)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計：UV-1700型，日本島津(中國)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-6數(shù)顯型，金壇市佳美儀器有限公司；

離心機：Sigma微型，德國Sigma公司；

電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

酶標(biāo)儀：Bio-red 550型，上海領(lǐng)成生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 體外降脂指標(biāo)測定

(1) 油脂吸附作用：根據(jù)文獻[8]。按式(1)計算葛根醇提物結(jié)合油脂量。

(1)

式中：

OA——油脂吸附量，g/g；

W1——稱取葛根醇提物質(zhì)量，g；

W2——葛根醇提物吸油后質(zhì)量，g。

(2) 膽固醇吸附作用：

① 膽固醇吸附標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：根據(jù)文獻[9]并修改。按0.05的梯度分別精確吸取0.1 mg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.00～0.40 mL)于比色管中，加入冰醋酸至0.40 mL，然后向各管中依次加入0.2 mL鄰苯二甲醛(1 mg/mL)試劑及4.0 mL混合酸(V濃硫酸∶V冰醋酸=1∶1)，混勻后37 ℃水浴10 min，于550 nm處測定各管的吸光度值，重復(fù)3次，將平均值進行線性回歸，以膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

② 膽固醇吸附作用測定：根據(jù)文獻[10]并修改。取50 mL 10 mg/mL樣品與100 mL 1 mg/mL膽固醇溶液混合，pH值調(diào)至7，80 r/min、37 ℃恒溫振蕩2 h，取0.4 mL 待測溶液加入0.2 mL鄰苯二甲醛溶液和混酸4 mL，37 ℃水浴10 min，在4 000 r/min離心20 min，取上清液于550 nm處測定其吸光度。按式(2)計算膽固醇吸附率。

(2)

式中：

CA——膽固醇吸附率，%；

C1——膽固醇加入量，mg/g；

C2——膽固醇剩余量，mg/g。

(3) 膽酸鹽結(jié)合能力：

① 繪制膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)文獻[11]并修改。配制甘氨膽酸鈉與?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)溶液0.12 mmol/L(pH 6.3的磷酸緩沖溶液)，取7個10 mL的具塞試管，分別加入0.0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液，加入磷酸緩沖液補充至2.5 mL，再加入7.5 mL 60% H2SO4，70 ℃水浴20 min，冰浴5 min，在387 nm處測定吸光度。分別以甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

② 膽酸鹽結(jié)合試驗：根據(jù)文獻[12]。分別按(3)和式(4) 計算剩余甘胺膽酸鈉和?；悄懰徕c含量。

(3)

式中：

SG——甘胺膽酸鈉吸附率，%；

c0——加入甘胺膽酸鈉的量，mmol；

c1——剩余甘胺膽酸鈉的量，mmol。

(4)

式中：

ST——?；悄懰徕c吸附率，%；

c2——加入?；悄懰徕c的量，mmol；

c3——剩余牛磺膽酸鈉的量，mmol。

1.3.2 葛根醇提物的提取工藝 將葛根飲片粉碎，過100目篩，稱取干燥粉末，乙醇回流提取，合并濾液，濃縮，得葛根醇提物浸膏，將所得提取物干燥，粉碎，過200目篩，備用。

1.3.3 單因素試驗

(1) 提取時間對體外降脂活性影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取次數(shù)為3次，考察提取時間(0.5，1.0，1.5，2.0 h)對體外降脂指標(biāo)的影響。

(2) 提取次數(shù)對體外降脂活性影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間為1 h，考察提取次數(shù)(1，2，3，4次)對體外降脂指標(biāo)的影響。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對體外降脂活性影響：固定提取次數(shù)3次，提取時間為1 h，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%，50%，70%，90%)對體外降脂指標(biāo)的影響。

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，分別選擇提取時間、提取次數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以多個降脂指標(biāo)作為響應(yīng)值，采用多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)化葛根的醇提工藝。

綜合評分：為使試驗結(jié)果全面反映葛根醇提工藝，研究賦予4種降脂指標(biāo)權(quán)重均為0.25，根據(jù)式(5)計算綜合評分。

W=(OA×0.25+CA×0.25+SG×0.25+ST×0.25)×100%，

(5)

式中：

W——綜合評分，%；

OA——油脂吸附量，g/g；

CA——膽固醇吸附率，%；

SG——甘胺膽酸鈉吸附率，%；

ST——?；悄懰徕c吸附率，%。

1.3.5 葛根醇提物棕櫚酸誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞(HepG2)脂肪肝模型影響

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：用DMEM高糖(10%胎牛血清，1%青霉素與鏈霉素雙抗)培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，置于含5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱生長，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進行傳代試驗[13]。

(2) 細(xì)胞毒性測定：采用MTT法對葛根醇提物(AL)和棕櫚酸(PA)進行細(xì)胞毒性試驗。通過細(xì)胞計數(shù)使96孔板中每孔細(xì)胞密度為1.5×104個/100 μL，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用顯微鏡觀察，待細(xì)胞長滿96孔板板底后，加入不同濃度的藥物，PA以50的梯度設(shè)置(50～550 μmol/L)共11個濃度，AL設(shè)置0.5，1.0，10，20，50，80，100，200，500，800，1 000 μg/mL共11個濃度，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，加5 mg/mL MTT溶液20 μL 后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去溶液后加入150 μL二甲基亞砜，充分反應(yīng)10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔的吸光值。按式(6)計算細(xì)胞存活率。

(6)

式中：

CV——細(xì)胞存活率，%；

A0——調(diào)零組吸光度；

A1——空白組吸光度；

A2——樣品組吸光度。

(3) 細(xì)胞內(nèi)TC、TG水平測定：通過細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度大約為1.5×105個/mL，待細(xì)胞80%融合后加藥，共設(shè)5個試驗組，每個試驗組設(shè)置3個復(fù)孔。空白組加DMEM完全培養(yǎng)基，PA組加200 μmol/L PA，3個藥物組分別加質(zhì)量濃度為100，200，300 μg/mL的AL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，參照文獻[14]方法制備細(xì)胞勻漿上清，將其按照檢測試劑盒的說明檢測細(xì)胞中TC和TG含量。

(4) HepG2細(xì)胞油紅O染色：根據(jù)文獻[15]并修改。將HepG2細(xì)胞均勻接種在6孔板上，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁,吸去上清液，并用PBS洗滌孔板2次，加入ORO Fixative固定液固定30 min，棄去固定液，用蒸餾水洗滌2次，加入60%異丙醇浸洗5 min，棄去異丙醇后加入新配置好的ORO Stain，浸染10～20 min，棄去染色液，水洗2～5次，直到無多余染液，加入Mayer蘇木素染色液，復(fù)染1～2 min，棄去染色液后水洗2～5次，加入ORO Bufffer 1 min，棄去，加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗圖表均采用Origin 2019軟件進行繪制，響應(yīng)面試驗使用Design-Expert.V8.0.6.1進行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，每組試驗均重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1和圖2可知，隨提取時間、提取次數(shù)增加，降脂活性先增加后減小，可能由于長時間的提取破壞了葛根中異黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]；當(dāng)提取時間為1 h、提取次數(shù)為3次時降脂活性指標(biāo)均達最高值；因此，最佳提取時間應(yīng)選擇1 h，最佳提取次數(shù)應(yīng)選擇3次。由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達70%時降脂活性最強，可能由于此時溶液極性與葛根中活性物質(zhì)極性相似[17]；因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)選取70%。

圖1 提取時間對降脂活性影響Figure 1 Effects of extraction time on lipid-lowering activity

圖2 提取次數(shù)對降脂活性的影響Figure 2 Effects of extraction times on lipid-lowering activity

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對降脂活性的影響Figure 3 Effects of ethanol volume fraction on lipid-lowering activity

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以油脂吸附量、膽固醇吸附率、甘胺膽酸鈉吸附率及?；悄懰徕c吸附率的綜合評分為評價指標(biāo)，對提取時間、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)3個因素進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。試驗因素水平取值見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立與數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表2中17個試驗點的響應(yīng)值進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=97.91+2.39A+1.76B-0.60C-0.28AB-1.40AC+1.95BC-9.80A2-6.99B2-13.87C2。

(7)

由表3可知，模型P<0.000 1，表明模型極顯著，說明二次回歸模型的選用有意義；失擬項P>0.05，表明失擬不顯著，即模型與試驗的差異較小，可以說明其他因素對試驗結(jié)果的干擾較??；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.989 6，說明該回歸方程的擬合程度較高，可用于葛根醇提物工藝的優(yōu)化與分析。通過P值可以看出，A、A2、B2、C2差異極顯著，B、BC差異顯著。通過方差分析表可知影響綜合評分的主次因素順序為提取時間>提取次數(shù)>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3 響應(yīng)面分析 通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件得到提取時間、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對葛根醇提物工藝綜合評分影響的3D響應(yīng)面圖和等高線圖，試驗結(jié)果見圖4。3D圖傾斜度越大，等高線的形狀越扁平說明二者交互作用越強[18]，由圖4可以看出，AB交互作用不顯著，AC、BC交互作用較顯著，與上述方差分析表結(jié)論一致。

2.2.4 工藝優(yōu)選及驗證 通過對回歸模型方程求解，得出葛根最佳醇提工藝為提取時間1.06 h，提取次數(shù)3.13次，乙醇體積分?jǐn)?shù)72.10%，在此條件下綜合評分預(yù)計為98.28%。為了便于試驗，將提取工藝參數(shù)進行調(diào)整：提取時間1 h，提取次數(shù)3次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

為了進一步驗證所選工藝為最優(yōu)且穩(wěn)定性良好，重復(fù)進行3組驗證實驗，結(jié)果見表4。由表4可知，各指標(biāo)效果較好且RSD值均較小，綜合評分較預(yù)測值高，說明響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝為最佳提取工藝，且工藝穩(wěn)定性較好。

2.3 葛根醇提物體外降脂細(xì)胞試驗

2.3.1 PA及AL對細(xì)胞的毒性測定 如圖5所示，用0～550 μmol/L PA處理細(xì)胞24 h，MTT結(jié)果顯示，當(dāng)PA濃度達到200 μmol/L時，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷，存活率明顯下降，故在建立脂肪堆積模型時，選用100 μmol/L的PA誘導(dǎo)細(xì)胞并培養(yǎng)24 h。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Box-Behnken response surface test factor level table

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果?Table 3 Response surface quadratic regression equation model variance analysis results

圖4 響應(yīng)面分析圖Figure 4 Response surface analysis diagram

表4 提取工藝驗證實驗結(jié)果Table 4 Extraction process validation test results

如圖6所示，用0～1 000 μg/mL AL處理細(xì)胞24 h，MTT結(jié)果顯示，在0～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)的AL對細(xì)胞生長無顯著影響，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達到800 μg/mL時，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力降至69.91%，故在給藥時，選取的樣品最高質(zhì)量濃度為500 μg/mL。

2.3.2 葛根醇提物對棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的影響 PA能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)的TC含量提升，膽固醇代謝和脂質(zhì)代謝的關(guān)系密不可分，F(xiàn)ungwe等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)攝入膽固醇的同時TG含量也會隨之升高，膽固醇還可以通過抑制脂肪酸的氧化分解從而增加TG水平。由圖7可知，PA處理HepG2細(xì)胞后，使得細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量明顯升高，在給予AL干預(yù)后能夠降低細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量，且呈劑量依賴，AL高劑量組TG和TC含量分別降至1.24，0.89 mmol/L，幾乎與空白組的含量持平。說明AL可能是通過膽固醇代謝進而影響脂質(zhì)代謝，降低TG和TC的含量，進一步驗證了葛根醇提物有較好的體外降脂活性。

2.3.3 HepG2細(xì)胞油紅O染色 如圖8所示，未經(jīng)PA處理的空白對照組的細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰可見，未見明顯脂滴聚集。經(jīng)過24 h PA處理后的細(xì)胞，黃色脂滴量明顯增加，而與PA組相比，AL和PA共同作用組隨著AL濃度的增加其細(xì)胞內(nèi)脂滴量逐漸減少，細(xì)胞周圍脂質(zhì)積累也有所降低。由此表明，AL可抑制HepG2細(xì)胞周圍脂滴聚集。

圖5 PA對HepG2細(xì)胞活力影響Figure 5 Effects of PA on the viability of HepG2 cells

圖6 AL對HepG2細(xì)胞活力影響Figure 6 Effects of AL on the viability of HepG2 cells

圖7 HepG2細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量Figure 7 Contents of TC and TG in HepG2 cells

圖8 對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響Figure 8 Effects of lipid accumulation in hepatoma cells

3 結(jié)論

以油脂吸附量、膽固醇及膽酸鹽吸附率進行綜合評分，在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定試驗水平后通過響應(yīng)面法并結(jié)合回歸模型方程，得出葛根醇提物最佳提取工藝為提取時間1 h，提取次數(shù)3次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。隨后測定了棕櫚酸誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇含量并對其進行油紅O染色，結(jié)果顯示，人肝癌細(xì)胞中的甘油三酯、總膽固醇含量明顯下降及胞內(nèi)脂滴聚集逐漸減少，葛根醇提物體外降脂作用較好。