胡 陽 鄭麗燕 楊遠帆 吳錦輝 倪 輝

黃酮類化合物是一類重要的多酚類次級代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物中，對果實色澤、風味和營養(yǎng)及植物抗逆性和抗病蟲害具有重要影響[1-2]。常見的黃酮類化合物有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香苷和槲皮素等，其抗氧化和清除自由基功能使其可以應用于生產(chǎn)抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒抑菌等藥物及功能性保健食品中[3]。此外，黃酮類化合物還具有一定的顏色和風味，在食品工業(yè)中可作為天然食品添加劑(如食用色素、風味改良劑等)用于食品、飲料的生產(chǎn)等[4]。黃酮類物質(zhì)在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)均具有廣闊的發(fā)展前景和應用潛力[5-6]。

目前，常見的黃酮提取方法有有機溶劑提取法和水提取法等，黃酮類物質(zhì)精制純化方法包括色譜法(常壓柱層析法、高壓制備型HPLC法、高速逆流色譜法)和結(jié)晶法等[7]。高麗等[8]利用大孔樹脂精制荷葉黃酮，黃酮純度達55.28%；康彤[9]利用大孔樹脂精制甘草黃酮粗品，黃酮純度為66.8%；江正祥等[10]利用甲醇與異丙醇的混合溶液作結(jié)晶溶劑純化曲克盧丁，純度可達95%，回收率為75%；劉艷杰[11]利用甲醇反溶劑重結(jié)晶法純化黃酮純度為99.8%。相比較而言，采用色譜法對黃酮進行純化設備昂貴、耗時長、溶劑消耗大，而采用重結(jié)晶法分離純化黃酮類物質(zhì)具有對分離設備要求低、操作簡單、溶劑用量少等優(yōu)點，因此是黃酮產(chǎn)品工業(yè)生產(chǎn)中精制純化普遍采用方法。同時，不同植物來源的黃酮種類及特性不同，溶劑種類、酸堿度、添加量，以及結(jié)晶溫度和時間等均對黃酮重結(jié)晶具有一定影響，進而影響重結(jié)晶黃酮的純度和產(chǎn)量[12]。

相關研究[2]表明，柑橘類水果中含有大量的黃酮類化合物，是人類膳食中黃酮類化合物攝入的主要來源之一，也是食品和準制藥工業(yè)中黃酮類化合物的主要來源。柚類水果是重要的柑橘類水果，中國柚類水果產(chǎn)量占全球12%左右，僅福建省平和縣琯溪蜜柚產(chǎn)量就達到了120萬t[13]。柚類水果的殘次廢果及加工副產(chǎn)物含有橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等黃酮類物質(zhì)，含量達1%～6%[14]，是工業(yè)化生產(chǎn)黃酮的潛在優(yōu)質(zhì)原料。課題組[15]前期已優(yōu)化建立了柚皮黃酮乙醇提取工藝，提取得率為柚皮干重的4.90%。研究擬在此基礎上，進一步優(yōu)化柚皮黃酮的重結(jié)晶工藝參數(shù)，并對重結(jié)晶產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)和純度分析，以期為植物黃酮的重結(jié)晶精制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

琯溪蜜柚：福建省漳州市平和縣；

蘆丁(純度≥95.0%)、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Thermo公司；

高速粉碎機：JP-500C型，永康市久品工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-501型，上海力辰科技有限公司；

酶標儀：Epoch 2T型，美國伯騰儀器有限公司；

超聲波清洗機：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

島津液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柚皮黃酮粗品制備 參照晏幸等[15]的方法并修改。設置提取液料比30∶1 (mL/g)、乙醇體積分數(shù)67%、超聲頻率163 W、超聲溫度35 ℃，超聲時間50 min，提取兩次后收集提取液，真空濃縮至粗提液中黃酮質(zhì)量濃度≥2.0 mg/mL，于4 ℃析出晶體沉淀，過濾，60 ℃烘干后制得黃酮粗品。

1.2.2 重結(jié)晶單因素試驗

(1) 乙醇體積分數(shù)對黃酮重結(jié)晶得率的影響：稱取0.50 g 黃酮粗品，液料比為30∶1 (mL/g)，乙醇體積分數(shù)分別為10%，20%，30%，40%，50%，對黃酮結(jié)晶粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，調(diào)節(jié)pH值為4.0，4 ℃下進行重結(jié)晶，24 h后收集重結(jié)晶沉淀，計算晶體重結(jié)晶得率。

(2) 液料比對黃酮重結(jié)晶得率的影響：稱取0.50 g黃酮粗品，液料比分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)，乙醇體積分數(shù)為20%，對黃酮粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，并調(diào)節(jié)pH值為4.0，4 ℃下進行結(jié)晶，24 h后收集重結(jié)晶沉淀，計算晶體重結(jié)晶得率。

(3) pH值對黃酮重結(jié)晶得率的影響：稱取0.50 g黃酮粗品，乙醇體積分數(shù)為20%，液料比為30∶1 (mL/g)，對黃酮粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，并分別調(diào)節(jié)pH為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，4 ℃下進行結(jié)晶，24 h后收集重結(jié)晶沉淀，計算晶體重結(jié)晶得率。

(4) 結(jié)晶時間對黃酮重結(jié)晶得率的影響：稱取0.50 g黃酮粗品，乙醇體積分數(shù)為20%、液料比為30∶1 (mL/g)，對黃酮粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，并調(diào)節(jié)pH為4.0，4 ℃下進行結(jié)晶，結(jié)晶時間分別為6，12，24，36，48 h，收集重結(jié)晶沉淀，計算晶體重結(jié)晶得率。

1.2.3 響應面試驗設計與優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原則，以單因素試驗結(jié)果為基礎，利用Design-Expert 8.06軟件對選定因素進行響應面試驗設計、方差分析以及回歸分析，獲得最佳重結(jié)晶工藝。

1.2.4 指標測定方法

(1) 黃酮總含量：參照晏幸等[15]的方法。

(2) 黃酮重結(jié)晶得率：按式(1)計算提取液中黃酮重結(jié)晶得率。

(1)

式中：

X1——黃酮重結(jié)晶得率，%；

m1——重結(jié)晶的晶體質(zhì)量，g；

m0——被結(jié)晶物的質(zhì)量，g。

(3) 黃酮主要成分的HPLC分析：采用Shim-pack GIS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對樣品進行HPLC分析，進樣體積5 μL；流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長284 nm；梯度洗脫條件：0～15 min，35%流動相A(超純水)、65%流動相B(乙腈)。采用標準品對照確定主要成分含量。

(4) 黃酮純度：分別取0.02 g柚皮苷標準品、黃酮粗品和黃酮重結(jié)晶樣品溶解于10 mL乙腈中，定容；過0.22 μm濾膜進行HPLC分析。根據(jù)標準品與樣品的HPLC峰面積之比，按式(2)計算重結(jié)晶樣品純度。

(2)

式中：

X2——黃酮純度，%；

A1——重結(jié)晶晶體的液相峰面積；

A0——標準品的液相峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進行平均值、標準偏差的計算和圖表繪制；采用RStudio 2022.02.0對數(shù)據(jù)進行單因素顯著性分析；通過Design-Expert 8.06軟件進行響應面試驗設計與數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對黃酮重結(jié)晶得率的影響 由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的升高，黃酮晶體重結(jié)晶得率先增大后顯著減少，當乙醇體積分數(shù)為20%時達最大值2.41%，與林芳等[16]的結(jié)論一致，是因為隨著乙醇體積分數(shù)的上升，乙醇溶液極性下降，黃酮溶解度下降，而低體積分數(shù)的乙醇溶液極性更接近于黃酮極性，更有利于黃酮的溶解以及混合液體系的飽和，從而利于晶體的析出。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 乙醇體積分數(shù)對黃酮重結(jié)晶得率的影響Figure 1 Effects of ethanol volume fraction on the recrystallization yield of flavonoids

2.1.2 液料比對黃酮重結(jié)晶率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增大，溶液中的黃酮含量和黃酮重結(jié)晶得率呈明顯下降趨勢，當液料比為10∶1 (mL/g)時，重結(jié)晶得率達到最大值8.21%。

2.1.3 pH值對黃酮重結(jié)晶得率的影響 由圖3可知，隨著pH值的升高，黃酮重結(jié)晶得率先升高后下降，當pH值為4.0時黃酮重結(jié)晶得率達最大值8.45%，與甄暢迪等[17]的結(jié)論一致，說明酸性條件下更有利于黃酮物質(zhì)的溶解以及結(jié)晶速度的提高。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 液料比對黃酮重結(jié)晶得率的影響Figure 2 Effects of the liquid-solid ratio on the recrystallization yield of flavonoids

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 pH對黃酮重結(jié)晶得率的影響Figure 3 Effects of pH value on the recrystallization yield of flavonoids

2.1.4 結(jié)晶時間對黃酮重結(jié)晶得率的影響 由圖4可知，結(jié)晶時間對黃酮重結(jié)晶得率的影響與一般規(guī)律相同，當結(jié)晶時間為24 h時黃酮重結(jié)晶得率達8.26%，并趨于穩(wěn)定，當結(jié)晶時間為36 h時達最大值8.47%，但無顯著性差異，說明結(jié)晶時間為24 h左右，粗品中的黃酮已接近全部析出，考慮到工業(yè)生產(chǎn)中的成本與效益，取結(jié)晶時間24 h為最優(yōu)結(jié)晶時間。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 結(jié)晶時間對黃酮重結(jié)晶得率的影響Figure 4 Effects of crystallization time on the recrystallization yield of flavonoids

2.2 響應面試驗

2.2.1 Box-Behnken設計方案及試驗結(jié)果 固定液料比為10∶1 (mL/g)，以黃酮重結(jié)晶率為響應值，對乙醇體積分數(shù)、pH和結(jié)晶時間3個因素進行響應面設計，試驗因素水平見表1，試驗設計及結(jié)果見表2。

經(jīng)Design-Expert 8.06多項擬合回歸后，得二次項回歸方程為：

Y=-19.703+1.442A+6.479B-0.045C-8.775×10-2AB+2.083×10-4AC+4.292×10-2BC-2.324×10-2A2-7.888×10-2B2-1.571×10-3C2。

(3)

2.2.2 回歸模型方差分析 由表3可知，回歸模型F=19.97，P<0.05，說明該回歸模型顯著；一次項A、B、C，交互項AB及二次項A2和B2均具有顯著影響(P<0.05)。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

因此，二次項回歸方程修訂為Y=-19.703+1.442A+6.479B-0.045C-8.775×10-2AB-2.324×10-2A2-7.888×10-2B2。各因素的效應關系為A(乙醇體積分數(shù))>C(結(jié)晶時間)>B(pH)。相關系數(shù)R2=0.973，變異系數(shù)CV=8.31%<10%，表明模型可信且擬合程度良好，試驗誤差小，可用該模型對黃酮重結(jié)晶工藝進行分析、優(yōu)化和預測。

2.2.3 響應面分析與優(yōu)化 由圖5可知，乙醇體積分數(shù)與pH的交互作用對黃酮重結(jié)晶率的影響比較顯著，與方差分析結(jié)果一致。

對二次多項式回歸方程進行求導計算，得出黃酮重結(jié)晶最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)24.09%，pH 3.75，結(jié)晶時間36 h，預測黃酮重結(jié)晶得率最高為9.13%。結(jié)合實際生產(chǎn)情況，將其參數(shù)修正為液料比10∶1 (mL/g)，乙醇體積分數(shù)24%，pH 3.75，結(jié)晶時間24 h，重復3次實驗測得黃酮重結(jié)晶得率為8.76%，與預測值相近，由此驗證了響應面法優(yōu)化所得的黃酮重結(jié)晶工藝模型的可靠性和合理性。

2.3 黃酮晶體的初步鑒定

由圖6可知，精制黃酮的保留時間與柚皮苷標準品完全對應，由此可以判定黃酮重結(jié)晶產(chǎn)物為柚皮苷。經(jīng)重結(jié)晶精制純化后雜質(zhì)含量明顯減少，說明重結(jié)晶精制黃酮粗品的方法具有一定效果。

表2 響應面試驗優(yōu)化設計與結(jié)果Table 2 The optimization design and results of response surface test

2.4 黃酮晶體純度

柚皮中的黃酮類物質(zhì)有柚皮苷、蘆丁、橙皮苷和新橙皮苷，其中柚皮苷和蘆丁含量較多[18]。根據(jù)標準曲線計算可得精制品中柚皮苷純度為83.38%，相對于粗結(jié)晶樣CV=8.31%。

表3 基于黃酮重結(jié)晶得率的方差分析結(jié)果?Table 3 Analyses of variance results based on the recrystallization yield of flavonoids

圖5 各因素交互作用對柚皮黃酮重結(jié)晶得率的影響Figure 5 Effects of interaction of various factors on the recrystallization yield of flavonoids from pomelo peel

圖6 精制黃酮、黃酮粗品和柚皮苷標準品的HPLC圖Figure 6 HPLC diagram of refined flavonoid, crude flavonoid and naringin standard

品，純度提高了36%。許鷺[19]通過D101型大孔樹脂分離純化柚皮苷3次，經(jīng)60%乙醇溶液重溶后，得到純度為92.44%的柚皮苷精制品；項飛等[12]通過乙醇溶液提取黃酮后，經(jīng)多次重結(jié)晶和洗滌得到純度為70.36%的黃酮化合物；涂招秀等[20]利用大孔樹脂—結(jié)晶法精制蔓三七葉黃酮，得到純度為91.8%的黃酮精品。賈冬英[21]采用DM130大孔吸附樹脂法粗提柚皮中的柚皮苷后，經(jīng)3次不同條件的重結(jié)晶后，得到柚皮苷精制品純度為85.07%。試驗精制品中柚皮苷純度與上述報道的純度對比略低，但相對于多次重結(jié)晶，該精制過程步驟簡潔，純度較高。相比于大孔樹脂純化或大孔樹脂與重結(jié)晶相結(jié)合精制黃酮類化合物，該工藝操作簡單、省時高效、無污染，提取的黃酮純度與其他方法無大差別，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

通過響應面法優(yōu)化了乙醇重結(jié)晶精制黃酮工藝。結(jié)果表明，精制黃酮粗品的最優(yōu)工藝方案為液料比10∶1 (mL/g)、乙醇體積分數(shù)24%、pH值3.75、結(jié)晶時間24 h。此條件下蜜柚黃酮重結(jié)晶率為8.76%，結(jié)晶產(chǎn)物主要為柚皮苷，純度為83.38%。研究尚未更深入地鑒定結(jié)晶產(chǎn)物，后續(xù)將采用紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等技術手段作進一步探究，明確細化結(jié)晶產(chǎn)物中的黃酮種類。