吳連連，秦瀅，胡安康

（徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004）

癲癇是一種以大腦異常放電為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，伴隨著大腦內(nèi)部一系列顯著的變化，如海馬功能障礙，主要表現(xiàn)為神經(jīng)退行性變、神經(jīng)發(fā)生異常等［1］。姜黃素是一種小分子多酚化合物，主要提取自姜科植物的根莖，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多方面的藥理作用［2］，被廣泛應(yīng)用于多種疾病的防治。研究顯示姜黃素在腦缺血和外傷性腦損傷中具有顯著的神經(jīng)保護(hù)的作用［3－4］。本研究旨在探究姜黃素對(duì)海仁藻酸（kainic aciq，KA）誘導(dǎo)的癲癇海馬神經(jīng)損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57/BL6雄性小鼠45只，10～12周齡，體質(zhì)量20～22 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2020－0011。在溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%、燈光12 h/12 h 晝/夜控制的SPF 環(huán)境中飼養(yǎng)，小鼠能自由攝食及飲水。

1.2 試劑與儀器

KA、BrdU、姜黃素（美國(guó)Sigma－Aldrich 公司）；尼氏染色液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；大鼠抗BrdU 抗體、兔抗Cleaved Caspase－3 抗體、山羊抗大鼠IgG H&L（FITC）（英國(guó)Abcam 公司）；兔抗Bax 抗體、兔抗Bcl－2 抗體（美國(guó)proteintech公司）；IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG（H+L）（VICMED公司）；徠卡冰凍切片機(jī)（CM1950）；日本OLYMPUS 正置熒光顯微鏡（BX53）；美國(guó)Li－Cor 公司的Odyssey CLX雙紅外激光成像系統(tǒng)。

1.3 癲癇模型制備

45 只小鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和姜黃素組3組，每組15只。模型組小鼠腹腔注射KA（25 mg/kg）建立癲癇模型，KA 提前用生理鹽水溶解配置成1 mg/mL的濃度；對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水；姜黃素組小鼠在KA 給藥前12 h 按400 mg/kg 劑量腹腔注射姜黃素，姜黃素提前用少量DMSO 助溶。觀察3 組小鼠行為變化，根據(jù)Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行評(píng)價(jià)。Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，行為正常；Ⅰ級(jí)，面部肌肉痙攣，表現(xiàn)為眨眼、咀嚼、動(dòng)須運(yùn)動(dòng)等以及濕狗樣顫動(dòng)；Ⅱ級(jí)，頸部肌肉痙攣，表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；Ⅲ級(jí)，單側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)，站立伴有雙前肢陣攣；Ⅴ級(jí)，身體失去平衡倒下，四肢持續(xù)抽動(dòng)。小鼠癥狀達(dá)到Ⅲ級(jí)及其以上，且連續(xù)發(fā)作30 min 以上時(shí)，可視為癲癇造模成功；發(fā)作達(dá)1 h 給與10%水合氯醛腹腔注射以終止發(fā)作。

1.4 尼氏染色

癲癇造模后24 h，小鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35 mL/100 g），打開(kāi)胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室插入灌注針，灌注4 ℃生理鹽水，待肝、肺臟顏色轉(zhuǎn)白，右心室流出的液體澄清無(wú)血時(shí)，灌注4%多聚甲醛直至小鼠身體變硬，斷頭取腦，多聚甲醛中固定過(guò)夜，替換至30%蔗糖中脫水直至腦組織沉底。進(jìn)行冰凍切片，切片厚10 μm。4 ℃冰凍切片經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗滌2 次，再次換新鮮蒸餾水洗滌2 次，尼氏染色液室溫染色10 min，經(jīng)蒸餾水洗滌2 次，過(guò)95%乙醇約5 s，70%乙醇洗滌2 次，封片晾干后顯微鏡下觀察拍照。

1.5 TUNEL染色

切片經(jīng)4%多聚甲醛固定，室溫下30 min，PBS 緩沖液洗滌3次。用PBS按照1∶100的比例稀釋Proteinase K（2 mg/mL），使其終濃度為20 μg/mL，每個(gè)組織樣本滴加稀釋好的Proteinase K，室溫孵育10 min 后經(jīng)PBA洗滌。滴加TUNEL 檢測(cè)液于37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌后封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Western blot法檢測(cè)

海馬組織加入適量的蛋白裂解液，勻漿器勻漿，靜置15 min，4 ℃，8 000 rpm × 20 min 離心，吸取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入相應(yīng)量的4×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min 處理蛋白。等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離后，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至NC 膜上。經(jīng)5%BSA 封閉后加入抗體，Cleaved Caspase－3 抗體（1∶1 500），Bax 抗體（1∶500），Bcl－2 抗體（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌后加入相應(yīng)的二抗（1∶5 000），室溫避光孵育1 h；洗膜。Odyssey激光成像系統(tǒng)掃描，結(jié)果以圖像處理儀分析處理。

1.7 BrdU免疫熒光染色

先配制好10 mg/mL 的BrdU 溶液，按預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)給各組小鼠進(jìn)行BrdU 腹腔注射。給藥劑量為每次50 mg/kg，腹腔注射6 次，每12 h 給1 次，連續(xù)3 d，最后一次注射24 h 后灌注固定取腦。小鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定，取腦，固定過(guò)夜。經(jīng)30%蔗糖脫水沉糖，進(jìn)行冰凍切片，切片厚20 μm，先以2 mol/L的HCl溶液處理使DNA 變性，于37 ℃放置30 min，以pH 值8.5 的0.1 mol/L 硼酸在室溫環(huán)境中和10 min，10%山羊血清室溫封閉40 min，滴加一抗，BrdU 抗體（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜。滴加熒光二抗（1∶100）孵育1.5 h，封片并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用圖像分析軟件和Photoshop 5.0 軟件（Adobe）對(duì)圖像進(jìn)行處理，所有資料用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析（One－Way ANOVA），兩組比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇模型評(píng)估

根據(jù)癲癇發(fā)作等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，模型組小鼠癲癇發(fā)作達(dá)到3 級(jí)及以上的有14 只，只有1 只未達(dá)3 級(jí)；姜黃素組發(fā)作等級(jí)達(dá)3 級(jí)的有4 只，11 只未達(dá)3 級(jí)。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 38.34，P= 0.009 7）。見(jiàn)表1。

表1 各組癲癇小鼠判定結(jié)果（只）

2.2 尼氏染色評(píng)定神經(jīng)元損傷

尼氏染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA1 和CA3 區(qū)的神經(jīng)元出現(xiàn)顯著損傷，神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，姜黃素組CA1 和CA3 神經(jīng)元損傷減輕，神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1，表2。

表2 各組尼氏染色CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較（±s）

表2 各組尼氏染色CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。

組別對(duì)照組模型組姜黃素組n4 4 4 CA1區(qū)74.00±3.47 41.00±2.10a 69.00±3.72b CA3區(qū)126.00±6.36 88.00±3.87a 115.00±7.12b

圖1 各組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)尼氏染色結(jié)果

2.3 TUNEL染色檢測(cè)海馬細(xì)胞凋亡

TUNEL 染色標(biāo)記海馬凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果顯示對(duì)照組海馬CA1 區(qū)和CA3 區(qū)均出現(xiàn)少量凋亡神經(jīng)細(xì)胞，模型組CA1 區(qū)和CA3 區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，姜黃素組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 各組海馬CA1和CA3區(qū)TUNEL染色結(jié)果

表3 各組CA1區(qū)和CA3區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比例比較（±s，%）

表3 各組CA1區(qū)和CA3區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比例比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05。

組別對(duì)照組模型組姜黃素組n4 4 4 CA1區(qū)9.48±0.45 33.10±2.33a 16.54±1.02b CA3區(qū)9.16±0.76 44.22±2.87a 23.71±2.17b

2.4 凋亡蛋白表達(dá)水平

模型組海馬凋亡蛋白Cleaved Caspase－3 和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，抗凋亡蛋白Bcl－2相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；姜黃素組凋亡蛋白Cleaved Caspase－3 和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組，抗凋亡蛋白Bcl－2 相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 Western blot檢測(cè)各組海馬組織凋亡蛋白

表4 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表4 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01。

組別對(duì)照組模型組姜黃素組n4 4 4 Cleaved Caspase－3 0.19±0.01 0.71±0.04a 0.26±0.02b Bax 0.12±0.01 0.74±0.30a 0.17±0.02b Bcl－2 0.46±0.03 0.10±0.01a 0.41±0.02b

2.5 BrdU染色檢測(cè)海馬細(xì)胞增殖

經(jīng)BrdU 熒光染色標(biāo)記DG 區(qū)新增殖細(xì)胞，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組DG 區(qū)BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；姜黃素組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 各組DG區(qū)BrdU熒光染色圖

表5 各組DG區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

表5 各組DG區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05。

組別對(duì)照組模型組姜黃素組n4 4 4 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)30.00±2.10 98.00±4.55a 51.00±3.98b

3 討論

姜黃素是從姜黃中提取的一種膳食多酚，具有抗氧化、抗炎、抗微生物感染、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用，已被證明在腫瘤、代謝性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腸炎等多種疾病中具有治療作用［6］。近年來(lái)，姜黃素對(duì)一些中樞神經(jīng)退行性疾病的保護(hù)作用已在體內(nèi)和體外研究中得到證實(shí)。

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常伴有反復(fù)發(fā)作。癲癇發(fā)作會(huì)引起大腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，其病理機(jī)制仍未確定。一些基于誘發(fā)性癲癇模型的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以延緩或完全抑制癲癇發(fā)作［7］。海馬是癲癇發(fā)作后的易損區(qū)，其形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為CA1 區(qū)和CA3 區(qū)錐體細(xì)胞的不同程度的受損和凋亡，神經(jīng)元數(shù)的大量減少［8］。并且，在顳葉癲癇患者海馬中也出現(xiàn)海馬神經(jīng)元丟失的情況，以CAl 區(qū)和CA3 區(qū)丟失最顯著［9］。Caspase－3 是在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)蛋白，屬于凋亡執(zhí)行者。當(dāng)接受到凋亡信號(hào)時(shí)會(huì)被剪切成有活性的Cleaved Caspase－3，導(dǎo)致核DNA 鏈斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體，出現(xiàn)細(xì)胞死亡［10－11］。此外，Bcl－2與Bax 也是凋亡過(guò)程中的一對(duì)功能相互對(duì)立的重要基因，可作為Caspase－3的上游調(diào)控基因，協(xié)助完成細(xì)胞凋亡的調(diào)控行為［12］。

本研究通過(guò)KA 誘導(dǎo)小鼠癲癇急性發(fā)作模型，觀察了姜黃素在癲癇引起的海馬損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后海馬CA1 區(qū)和CA3 區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元丟失損傷，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加，而姜黃素治療組卻能極大地改善此種現(xiàn)象，神經(jīng)元數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)都趨于正常。模型組海馬Cleaved Caspase－3 和Bax 表達(dá)顯著上升，Bcl－2蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，姜黃素組凋亡蛋白表達(dá)趨于正常水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素可以減輕癲癇造成的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡。

神經(jīng)發(fā)生伴隨在整個(gè)生命過(guò)程中，是神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，新的神經(jīng)元不斷生成并整合到海馬體回路的過(guò)程，對(duì)維持正常的生理功能至關(guān)重要。然而，在病理?xiàng)l件下會(huì)形成異常神經(jīng)發(fā)生，產(chǎn)生異常的神經(jīng)回路導(dǎo)致腦功能障礙［13－14］。癲癇發(fā)生是在癲癇損傷的最初階段發(fā)生的過(guò)程，不僅涉及神經(jīng)元損傷凋亡，還會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生增加［15］。對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究表明，癲癇發(fā)作可促進(jìn)齒狀回亞顆粒帶（SGZ）的細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生［16－17］。這種神經(jīng)前體細(xì)胞增殖可能有助于異常神經(jīng)回路的形成。在本實(shí)驗(yàn)中，以BrdU 標(biāo)記新增殖細(xì)胞，結(jié)果顯示模型組SGZ 區(qū)增殖細(xì)胞數(shù)顯著增多，與以往報(bào)道一致，提示癲癇發(fā)作導(dǎo)致異常神經(jīng)發(fā)生。姜黃素組細(xì)胞增殖活性顯著降低，接近對(duì)照組，表明姜黃素可以抑制癲癇海馬異常神經(jīng)發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，姜黃素能減少癲癇海馬神經(jīng)元損傷和凋亡，抑制神經(jīng)發(fā)生，這提示姜黃素對(duì)癲癇發(fā)作引起的一系列海馬損傷能起到一定的保護(hù)作用。