黃景文 李生強 陳玄 謝麗華 陳賽楠 黃小彬 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥科學院，福建 福州 350001

中醫(yī)學認為骨質疏松癥(osteoporosis，OP)與腎精虧虛、脾氣虛弱有相當密切的關系[1-2]，因此中醫(yī)理論指導下，課題組選用續(xù)苓健骨方來治療骨質疏松癥。本方主要出自于《中醫(yī)傷科學講義》續(xù)骨活血湯和《古今醫(yī)鑒》清熱調血湯，具有補腎壯骨、健脾益氣、活血止痛的功效，其臨床療效明確[3]，前期研究已確定部分機制[4-6]，但主要作用機制尚不明確。因此，課題組通過對OP大鼠模型進行體內研究，利用基因表達譜芯片篩選各組間差異表達基因，尋找相關的作用靶點和信號通路，為續(xù)苓健骨方治療OP提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠15只，6月齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學院比較醫(yī)學實驗中心，合格證號：SYXK(閩)2009-000。

1.2 藥品與試劑

續(xù)苓健骨方由 12 味中藥組成(續(xù)斷、白術、紅花、陳皮、赤芍等)，購自福建省鷺燕醫(yī)藥有限公司，傳統(tǒng)方法熬制，每劑中藥含量為1.5 g/mL，取汁81.33 mL，4 ℃保存。

1.3 實驗儀器

NanoDrop ND-1000(上?？党缮镉邢薰?；Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)(上?？党缮镉邢薰?。

1.4 模型制備

參考文獻[7-8]方法，配制4 %戊巴比妥鈉，根據(jù)體重以0.22 mL/100 g進行腹腔注射麻醉，腹部開口，切除大鼠雙側卵巢，造模后連續(xù)3 d使用青霉素預防感染。假手術組同法但是不切除卵巢。

1.5 分組與給藥

隨機將15只大鼠分為假手術組、模型組和續(xù)苓健骨方組，每組5只。造模后1周后開始灌胃給藥，給藥周期為連續(xù)13周，根據(jù)體重調整給予藥物量，續(xù)苓健骨方組灌胃1 mL/100 g，每日1次；假手術組和模型組按1 mL/100 g灌胃生理鹽水，每日1次。

1.6 樣本制備

13周后，所有大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉后，取雙側股骨，生理鹽水浸濕紗布并包裹左側股骨保存于-20 ℃，實驗前取出，低溫下研磨加入TRIZOL于液氮速凍后放-80 ℃保存，備用。

1.7 RNA提取及測序

將3組樣本，共15個樣本，送至上?？党缮镉邢薰具M行RNA提取、基因表達譜芯片掃描和差異表達基因分析及功能分析。

1.8 差異表達基因分析

樣品處理，利用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1) 讀取芯片圖獲得原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對原始數(shù)據(jù)進行Quantile標準化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標準化后經過篩選高質量探針(某探針在15個樣品中至少有5個被標記為Detected)進行進一步分析。樣品間具有統(tǒng)計學意義的差異表達基因通過火山圖篩選。設置丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05篩選組間差異表達基因。使用R腳本進行層次聚類。使用標準的富集計算方法進行GO分析和Pathway分析。

2 結果

2.1 基因表達芯片分析結果

實驗共掃描15 828個表達基因，模型組(OVX組)相比假手術組(Sham)通過顯著性分析獲得1 336個表達差異的基因(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，其中上調623個基因，下調713個基因。實驗組(XU組)相比模型組共篩選出1 673個差異表達的基因，上調1 060個基因，下調613個基因，見圖1、圖2。

注：紅色為基因表達上調，綠色為基因表達下調；A：Sham組與OVX組差異表達熱圖，B：XU組與OVX組差異表達熱圖。

注：紅色代表基因表達上調，綠色代表基因表達下調；橫坐標為基因的差異倍數(shù)，縱坐標為差異表達的顯著性水平。A：Sham組和OVX組對比；B：OVX組和XU組對比。

2.2 組間差異表達基因GO分析

通過將Sham組和OVX組的差異表達基因與OVX組和XU組的差異表達基因進行分析(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，篩選出10個造模后表達顯著降低但是用藥后顯著提高的基因，218個造模后表達顯著提高但是用藥后表達顯著降低的基因。將篩選的228個基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因與生物過程相關的GO條目有326條，主要集中在應激反應和細胞間通訊上，細胞組分有29條，主要集中在細胞連接和質膜轉運功能上，分子功能有66條，主要集中在跨膜活性上。表達基因結果顯示生物過程(表1)、細胞組分(表2)、分子功能(表3)取前10的富集項，如圖3。

表1 GO分析生物過程富集結果前十Table 1 top ten biological process enrichment results of GO analysis

表2 GO分析細胞組分富集結果前十Table 2 top ten cell component enrichment results of GO analysis

表3 GO分析分子功能富集結果前十Table 3 top ten molecular functional enrichment results of GO analysis

注：橫坐標為GO富集項，縱坐標為富集顯著性。

2.4 差異表達基因的KEGG富集分析

對228個差異基因進行KEGG富集分析，差異表達基因富集到36條通路，主要參與癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、長效抑制過程、軸突引導、生熱作用等通路(見圖5)。文獻檢索發(fā)現(xiàn)其中PI3K-Akt通路與骨質疏松癥密切相關。

2.5 組間差異表達基因分析

將228個差異表達基因進一步進行篩選(丨log2 Fold change丨≥2，q<0.01)，共選出4個顯著差異基因，4個均為造模后表達顯著提高但是用藥后表達顯著降低的基因，見表5。

表4 與骨質疏松癥密切相關的顯著性富集通路Table 4 Significant enrichment pathways closely related to osteoporosis

表5 組間差異表達基因Table 5 differentially expressed genes between groups

注：橫坐標為富集顯著性，縱坐標為KEGG通路名稱。

3 討論

課題組利用基因表達譜芯片對骨質疏松癥模型組、假手術組和使用續(xù)苓健骨方治療的實驗組股骨組織進行測序，結果分析表明，Sham組和OVX組有1 336個差異表達基因(丨log2 Fold change丨≥1，q<0.05)，其中上調623個基因，下調713個基因。OVX組和XU組有1 673個差異表達基因，其中上調基因有1 060個，下調基因有613個。將各組間芯片結果進行分析，篩選出10個造模后表達顯著降低但是用藥后顯著提高的基因，218個造模后表達顯著提高但是用藥后表達顯著降低的基因。將篩選的228個基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因在生物過程中、應激反應、細胞間通訊所占比例最多；在細胞組分中，主要與細胞連接、神經元突觸功能組成相關；在分子功能中，主要參與跨膜活性功能。將KEGG富集分析到的前十通路進行分析，與骨質疏松癥密切相關的顯著性富集通路有PI3K-Akt通路等。其中通路主要相關基因有MAPK3、MYC、TP53等。PI3K-Akt信號通路被認為是包括軟骨細胞、成骨細胞等細胞分化的關鍵途徑。體內外研究均表明PI3K-Akt細胞信號通路在治療骨質疏松癥中的主要功能是促進成骨細胞增殖、分化和骨形成[9]。MAPK3有研究表明其參與的MAPK通路被證實參與骨代謝調節(jié)過程。MYC蛋白有延緩衰老的功能，其治療骨質疏松癥的機制主要在于同時能促進成骨分化，抑制破骨分化[10]。TP53編碼的P53可以通過miRNA信號通路影響骨髓間充質干細胞的功能來影響成骨細胞，敲低P53能部分反轉骨密度的降低[11]。課題組前期實驗表明續(xù)苓健骨方可以上調骨形成基因的表達，促進成骨細胞MC3T3-E1的成骨能力，但作用通路不明確[5]，本芯片研究發(fā)現(xiàn)續(xù)苓健骨方治療骨質疏松癥的機制可能與PI3K-Akt信號通路促進成骨分化相關，因此基因表達譜芯片實驗對前期實驗的通路不明進行了補充，為后續(xù)進一步深入研究提供了方向。

在差異表達基因分析中，Dnajb6是熱休克蛋白超家族之一，其參與線粒體凋亡途徑，與肌肉營養(yǎng)不良[12]、食管癌細胞增殖生長[13]等能量代謝相關疾病密切相關；LOC102548682是組蛋白H4相關的編碼基因，功能主要與控制細胞周期相關[14]；Rplp0參與多種生理和病理的過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[15]；Cnpy2可作為肝癌的治療靶點[16]；目前以上4個基因暫時還沒發(fā)現(xiàn)有與骨質疏松癥相關的報道。但是文獻挖掘發(fā)現(xiàn)有研究[17]表明Rplp0的缺失能導致活性氧(ROS)的積累，激活MAPK1/ERK2信號通路，有大量研究[18]表明MAPK1/ERK2的激活能促進成骨基因表達和成骨細胞的增殖，同時也有研究[19]發(fā)現(xiàn)Cnpy2的過表達能激活Akt/GSK3β通路，降低GSK3β的表達，有研究[20]發(fā)現(xiàn)抑制Akt/GSK3β通路，促進GSK3β表達能調控促進骨髓基質細胞的增殖，對成骨細胞凋亡產生抑制。因此綜上所述，Rplp0和Cnpy2其有可能是OP相關靶點之一，且也可能是續(xù)苓健骨方治療OP的關鍵基因。

傳統(tǒng)中藥歷史悠久，越來越多的臨床文獻報道中藥治療骨質疏松具有療效明顯且不良反應相對較少的特點，但是中藥治療骨質疏松癥的治療機制和骨質疏松癥的具體發(fā)病機制都較為復雜。隨著芯片技術在基因表達水平研究上的普及，研究疾病機制和藥物治療機制有了新的手段。雖然本研究樣本量較少，有一定的局限性，需要進一步進行驗證，但是分析結果為今后的研究提供了新的思路。