張應新，盛鋒，杜雪竹，胡琴

(湖北大學生命科學學院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)安全和糧食安全對維持社會穩(wěn)定，保障人民利益，推動國家發(fā)展具有重要的意義[1-2].水稻(OryzasativaL.)是我國最重要的糧食作物，水稻高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、綠色是育種家追求的重要目標.近年來，因為農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的日益惡化、耕地面積減少、極端氣候多發(fā)等因素，對水稻生產(chǎn)造成了重大的損失[3].干旱、高溫、鹽害等非生物逆境是限制水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要因素[4-6].進一步挖掘和鑒定水稻抗逆相關(guān)基因資源，結(jié)合分子育種技術(shù)，推動水稻抗逆品種(系)的開發(fā)與培育，對保障水稻產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重大的意義.

未知功能域蛋白(Domain of unknown Function，DUF)是一大類功能尚未被表征的蛋白家族，目前在蛋白家族 Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中已收錄超過5 000種含有DUF結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，約占所有已知蛋白家族的27%[7].隨著分子生物學研究方法的不斷創(chuàng)新，大量未知功能基因被分離鑒定，其生物學功能也得到了初步驗證.但是，即便是擬南芥、水稻等模式植物，也依舊有著大量功能未知的基因.近年來，迅速發(fā)展的基因組學和蛋白質(zhì)組學的為研究DUF家族基因功能提供了有力的生物學信息支撐，有關(guān)DUF參與植物生長發(fā)育和逆境應答方面的研究報道越來越多，表明DUF家族在植物生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8].

模式植物擬南芥和水稻中的研究表明，大量DUF基因家族在植物響應非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用.Xin等發(fā)現(xiàn)，擬南芥DUF231家族成員ESK1(At3g55990)負調(diào)控植物對冷脅迫的適應性，該基因突變后對冷脅迫的耐受性明顯增強，且不依賴于傳統(tǒng)的冷適應機制[9].在擬南芥中超量表達DUF966基因家族成員AtAuxRP3(At3g46110)后，轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)出葉片畸形、花序異常等生長素異位積累相關(guān)表型；進一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素含量增加，下游生長素響應相關(guān)基因表達量也明顯上調(diào)表達，同時對NaCl和滲透脅迫更加敏感，表明AtAuxRP3可能通過調(diào)控生長素的合成以及信號轉(zhuǎn)導協(xié)同調(diào)控植物的生長發(fā)育以及對非生物逆境的抗性[10].Yang等對擬南芥DUF4228基因家族進行非生物脅迫誘導表達模式分析以及互作蛋白研究時發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的擬南芥DUF4228基因成員都不同程度受到非生物逆境脅迫(NaCl、冷和干旱脅迫)的誘導差異表達，且在部分基因在地上和地下部分的表達模式存在明顯差異；蛋白互作實驗證實部分DUF4228成員能夠與已報道的非生物逆境調(diào)控因子發(fā)生互作，如AT1G21010和AT1G29195能夠與PP2A互作[11-13], AT1G28190能夠與WRKY15和ATL6互作[14], AT1G76660能夠與WRKY40和CML38互作[15]，暗示擬南芥DUF4228蛋白可能通過上述逆境調(diào)控因子參與植物對非生物脅迫的應答[16].在水稻中，Luo等發(fā)現(xiàn)水稻DUF966基因家族成員OsDSR2顯著受到鹽、干旱、高溫等逆境脅迫誘導下調(diào)表達，OsDSR2超表達的轉(zhuǎn)基因水稻對高鹽和干旱脅迫的耐受性明顯降低，抗逆相關(guān)基因如OsNCED4、SNAC1、OsbZIP23的表達量也顯著減少[17].Cui 等發(fā)現(xiàn)超量表達水稻DUF1 645家族成員OsSGL能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對干旱的耐受性，轉(zhuǎn)基因材料中脯氨酸和可溶性糖含量明顯增加，丙二醛含量降低，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也表明在超量表達材料中逆境響應相關(guān)基因明顯上調(diào)表達，說明OsSGL正向調(diào)控水稻對干旱脅迫耐受性[18].以上研究結(jié)果表明，DUF基因家族在植物響應非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，且相關(guān)成員通常會在轉(zhuǎn)錄水平上對各種脅迫做出響應，為利用反向遺傳學的研究方法篩選植物非生物逆境相關(guān)基因提供了便利.

DUF761基因家族起源于裸子植物并廣泛存在于維管植物中.近年來在棉花纖維細胞中發(fā)現(xiàn)一類新的微絲結(jié)合蛋白GhCFE1，該結(jié)合蛋白含有DUF761和DUF4408結(jié)構(gòu)域,超量表達該基因后出現(xiàn)抑制棉纖維細胞的起始和伸長[19]，這兩個結(jié)構(gòu)域均可在擬南芥DUF761家族中發(fā)現(xiàn)，但其具體的生物學功能尚未可知.本研究利用生物信息學的研究方法對 DUF76家族進行了系統(tǒng)的分析同時結(jié)合非生物逆境誘導表達模式鑒定水稻中與非生物逆境響應相關(guān)的DUF761成員，為后續(xù)進一步開展DUF761基因功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)搜索和OsDUF761基因的鑒定以“DUF761”為關(guān)鍵詞在國家水稻數(shù)據(jù)庫RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中檢索水稻DUF761基因成員并下載其DNA序列、編碼區(qū)序列和蛋白質(zhì)序列以及染色體位置.分別使用在線分析軟件ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對OsDUF761s蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析；利用CELLOv.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)軟件進行亞細胞定位預測.

1.2 水稻DUF761的染色體定位以及蛋白質(zhì)進化分析從RGAP database下載OsDUF761家族成員的物理位置信息并繪制染色體物理定位圖.分別從RGAP database和中TAIR(https://www.arabidopsis.org)下載水稻和擬南芥 DUF761家族成員蛋白質(zhì)序列，利用MEGA6.0軟件，采用 NJ (neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

1.3 水稻DUF761基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析從RGAP database中下載水稻DUF761的基因組信息以及外顯子-內(nèi)含子分布數(shù)據(jù)，利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制DUF761家族基因結(jié)構(gòu)分布圖.利用在線軟件Pfam(http://pfam.janelia.org/)進行蛋白質(zhì)保守域分析.

1.4 水稻DUF761基因啟動子順式作用元件分析利用RGAP database獲取了7個OsDUF761基因 (起始密碼子ATG)上游序列的1 500 bp基因組片段作為啟動子區(qū)段，通過在線分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行OsDUF761家族成員啟動子順式作用元件分析.

1.5 植物材料與處理本研究選用野生型日本晴水稻幼苗進行非生物脅迫研究來明確OsDUF761基因家族逆境脅迫應答機制.具體操作參照本實驗室前人研究進行[20].

1.6 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄利用Eastep? Super Total RNA Extraction試劑盒(Promega)抽提上述試驗葉片總RNA，具體步驟參照說明書進行.RNA于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?利用Go ScriptTMReverse Transcription Kit (Promega) 進行cDNA合成，cDNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?RT-qPCR分析利用qPrimerDB-qPCR Primer Database(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)設計RT-qPCR引物，以Ubiquitin7(UB7, LOC_Os03g13170)作為內(nèi)參基因，引物序列如表2所示.參照Power Up SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)試劑盒說明書，于CFX ConnectTMReal-Time System(BIO-RAD)進行RT-qPCR反應,并采用 2-ΔΔCT計算基因的相對表達水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻DUF761鑒定以7個擬南芥DUF761蛋白為探針，在水稻全基因組(Oryzasativa)中共檢索到7個編碼包含DUF761結(jié)構(gòu)域的水稻OsDUF761成員，進一步利用 Pfam 數(shù)據(jù)庫搜索 DUF761 結(jié)構(gòu)域證實這7個成員都屬于DUF761 家族，并將這些基因命名為OsDUF761.01～OsDUF761.07.對其基因和蛋白質(zhì)序列進行初步分析發(fā)現(xiàn)，OsDUF761所編碼的蛋白質(zhì)含有696～1 002個氨基酸殘基，相對分子量為25.50～36.66 kD，等電點為3.87～10.2.蛋白亞細胞定位預測結(jié)果顯示部分OsDUF761蛋白在兩種軟件(CELLO v.2.5和PSORT)下的預測結(jié)果有明顯差異，其中OsDUF761.01和OsDUF761.07定位于質(zhì)膜，OsDUF761.02定位于線粒體內(nèi)膜或葉綠體類囊膜，OsDUF761.03定位于質(zhì)膜或細胞核，OsDUF761.04定位于質(zhì)膜或細胞質(zhì)，OsDUF761.05和OsDUF761. 06定位于質(zhì)膜或葉綠體類囊體膜(表1).亞細胞定位預測結(jié)果表明水稻DUF761蛋白有著非常復雜的亞細胞定位，但是均含有生物膜定位信號，暗示其生物學功能可能依賴其膜定位特征實現(xiàn).

表1 水稻DUF761s基因的序列特征

亞細胞定位，“A”和“B”表示分別通過軟件CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)預測蛋白的亞細胞定位的結(jié)果；P.M：質(zhì)膜；Nucl：細胞核；Cyto：細胞質(zhì)；C.t.m：葉綠體類囊體膜；M.t.m：線粒體內(nèi)膜.

2.2 OsDUF761家族基因染色體定位從RGAP database中獲取OsDUF761s的物理位置信息，分析發(fā)現(xiàn)7個OsDUF761基因分別定位于3、 6、7、8、10和12號染色體上.除12號染色體上含有2個OsDUF761基因外，其他染色體上均只含有1個OsDUF761基因(圖1).

圖1 OsDUF761s基因在水稻染色體中定位和分布情況

2.3 水稻和擬南芥DUF761家族進化樹分析為更加直觀地了解DUF761蛋白的進化關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件對水稻和擬南芥DUF761蛋白進行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥和水稻DUF761 蛋白成員可以劃分為3個亞族(Ⅰ～Ⅲ).其中AT2G26110與OsDUF761.01、OsDUF761.04、OsDUF761.05、OsDUF761.06和OsDUF761.07屬于亞族Ⅰ；AT5G54300、AT1G61260、AT1G11210、AT1G11220、AT1G11230與OsDUF761.03屬于亞族Ⅱ； AT4G04990、AT1G15385與OsDUF761.04屬于亞族Ⅲ(圖2).

2.4 水稻DUF761家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析進一步我們獲取了RGAP database中OsDUF761s的基因序列、編碼區(qū)(CDS)序列和蛋白序列.基因結(jié)構(gòu)分析顯示，OsDUF761s基因結(jié)構(gòu)相似，均只含有一個外顯子(圖3).蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預測顯示，OsDUF761家族成員大多含有2個保守的DUF761結(jié)構(gòu)域(圖4).上述結(jié)果說明OsDUF761家族成員在基因結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域在進化上較為保守.

圖2 水稻和擬南芥DUF761蛋白系統(tǒng)進化樹

圖3 水稻OsDUF761s基因結(jié)構(gòu)

圖4 OsDUF761s蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

圖5 水稻DUF761s家族啟動子區(qū)域分析

2.5 水稻DUF761家族順式作用元件分析為進一步分析水稻OsDUF761s可能參與的生理過程，我們RGAP database獲取了OsDUF761s基因的啟動子序列，并對其所含的順式作用元件進行預測分析.如圖5所示，除ProOsDUF761.02、ProOsDUF761.07外，其余ProOsDUF761s均含有厭氧誘導響應元件(A)和不同類型的光響應元件，說明這兩類順式作用元件在ProOsDUF761s中保守存在.各個ProOsDUF761均含有多個逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(M、R、L、和K)、防御和逆境響應元件(P)、低溫響應元件(J)或缺氧響應元件(H)；ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04、ProOsDUF761.05和ProOsDUF761.06含有干旱誘導相關(guān)MYB結(jié)合元件(L)；ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04和ProOsDUF761.05含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(I)；ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.04含有逆境脅迫響應元件(P)；ProOsDUF761.01和ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.04含有低溫響應元件(J).與植物激素響應相關(guān)的順式元件有3類，ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.05含有水楊酸響應元件(Q)；ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04、ProOsDUF761.06和ProOsDUF761.07含有茉莉酸甲酯響應元件(G)；ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04和ProOsDUF761.06脫落酸響應元件(A).由此可見，每個ProOsDUF761啟動子含有不同功能的順式作用元件，說明它們可能通過不同的信號通路參與多種環(huán)境脅迫反應.

圖6 OsDUF761基因在10% PEG、4 ℃和NaCl處理下的表達模式分析

圖7 OsDUF761基因在脫水脅迫處理下的表達模式分析

2.6 OsDUF761s基因的非生物逆境表達模式分析為進一步驗證順勢作用元件預測的準確性，同時明確OsDUF761s基因家族在水稻抵御非生物逆境脅迫中應答機制，我們利用qRT-PCR分析7個OsDUF761在PEG、低溫、NaCl以及脫水脅迫下的誘導表達模式(圖6、圖7).OsDUF761.01在水稻苗期本底表達水平非常低，且在4種非生物逆境下都未能檢測到表達水平，因此對其表達模式不進行探討.采用qPrimerDB-qPCR Primer Database設計RT-qPCR引物(表2)，以水稻OsActin(LOC_Os03g50885)為內(nèi)參基因進行RT-qPCR分析.結(jié)果表明，OsDUF761.02在PEG和NaCl處理下表達水平較低，與Mock無明顯差異；但是顯著受到低溫誘導上調(diào)表達，在低溫處理24 h與Mock相比上調(diào)倍數(shù)達195.2倍.

表2 用于RT-qPCR分析的OsDUF761s基因和內(nèi)參基因的引物列表

OsDUF761.03在NaCl和低溫處理下先誘導上調(diào)達到峰值后逐漸下降至本底水平，其中在NaCl處理1 h與Mock相比誘導上調(diào)表達倍數(shù)最為顯著達34.3倍，在低溫處理6 h與Mock相比誘導上調(diào)表達倍數(shù)最為顯著達12.9倍；總體表現(xiàn)受NaCl和低溫處理誘導上調(diào)表達，對PEG處理無明顯響應.OsDUF761.04在PEG和NaCl處理下與Mock相比無明顯差異，僅在個別時間點有明顯的上調(diào)表達，PEG處理下在1 h 和 12 h分別上調(diào)17.6倍和33.3倍，NaCl處理下在1 h上調(diào)18.5倍；在低溫處理下呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(6 h)再下調(diào)(12 h)再上調(diào)(24 h)的表達模式，在6 h 和24 h上調(diào)表達倍數(shù)為14.5和85.8倍；總體表現(xiàn)受PEG、NaCl和低溫處理誘導上調(diào)表達，且對低溫處理響應最顯著.OsDUF761.05在PEG處理下與Mock相比無明顯差異；在NaCl處理下僅在12 h 有明顯的下調(diào)表達，下調(diào)倍數(shù)約為3.5倍；在低溫處理下表現(xiàn)出先上調(diào)(3 h)再下調(diào)(12 h)再上調(diào)(24 h)的表達模式，其中在6 h和24 h上調(diào)表達倍數(shù)較高達48.9倍和62.6倍；總體表現(xiàn)對PEG和NaCl處理不明顯，受低溫處理顯著誘導上調(diào)表達.OsDUF761.06在PEG處理下表達模式較為復雜，先上調(diào)再下調(diào)再上調(diào)表達；但是差異表達倍數(shù)均在2倍左右；在NaCl處理下先上調(diào)表達然后逐漸降低至本底水平，在 1 h表達差異最大，差異倍數(shù)達4.4倍；在低溫處理下明顯下調(diào)表達，在 6 h表達量下調(diào)最為明顯，差異倍數(shù)達9.6倍；總體表現(xiàn)為對PEG和NaCl處理響應不明顯，有略微上調(diào)表達，但受低溫處理顯著誘導下調(diào)表達.OsDUF761.07在PEG處理下表現(xiàn)出先上調(diào)然后降低到本底水平的表達模式，但是對PEG處理響應不顯著，在3 h差異倍數(shù)最大為2.6倍；受 NaCl處理下顯著下調(diào)表達，在12 h下調(diào)倍數(shù)最為顯著達7.6倍；在低溫處理整體表現(xiàn)為下調(diào)表達，僅在24 h 表達量有略微上調(diào)，在12 h下調(diào)倍數(shù)最為顯著達5.8倍，總體表現(xiàn)為受PEG處理誘導略微上調(diào)表達，受NaCl和低溫處理誘導下調(diào)表達.

在脫水脅迫下，OsDUF761.03、OsDUF761.04和OsDUF761.05表現(xiàn)出受脫水脅迫誘導上調(diào)表達的趨勢.其中OsDUF761.03在脫水處理6 h表達水平達到峰值上調(diào)倍數(shù)為17.9倍，OsDUF761.04在脫水處理3 h上調(diào)表達最為顯著，差異倍數(shù)達243倍，OsDUF761.05在脫水處理12 h表達量上調(diào)最為顯著達10.2倍；其余基因如OsDUF761.02、OsDUF761.06和OsDUF761.07均有不同程度受脫水脅迫誘導下調(diào)表達，其中OsDUF761.07下調(diào)表達最為顯著，在12 h下調(diào)倍數(shù)為61.8倍，OsDUF761.02在12 h下調(diào)倍數(shù)為19.1倍，OsDUF761.06在3 h下調(diào)倍數(shù)為2.4倍.

3 討論

水稻是我國重要的糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位.保障水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，對維護社會安定和糧食安全具有重要意義.隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展、全球人口的持續(xù)增長，糧食安全問題日益凸顯.此外，由于全球氣候變化導致極端天氣頻繁發(fā)生以及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的日益惡劣，進一步加劇了糧食安全問題.植物對環(huán)境脅迫的抗性有著復雜的遺傳和分子基礎(chǔ)，形成了精細且嚴密的分子網(wǎng)絡調(diào)控對逆境的感知、信號轉(zhuǎn)導、抗性相關(guān)物質(zhì)積累以及抗性“記憶”等方面，最終在形態(tài)、生理和生化水平上發(fā)生一系列改變以抵御逆境[21].近年來，隨著功能基因組學的迅速發(fā)展，有關(guān)DUF基因的功能報道越來越多，也揭示了其在植物生長發(fā)育和逆境響應中的重要調(diào)控作用[22].DUF761基因家族起源于裸子植物并廣泛存在于維管植物中.在模式植物擬南芥中的研究表明，含有DUF761結(jié)構(gòu)域的DUF761-1基因(At4G16790)可能參與了植物防御反應以及細胞壁形態(tài)建成.超量表達該基因會導致植物葉片形態(tài)、花序以及角果形態(tài)異常，同時對丁香假單胞菌抗性增強[23].

目前，在水稻中尚無DUF761家族成員的功能報道.基于DUF761基因家族在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應中的重要功能，本研究對水稻DUF761基因家族成員及其可能參與的逆境響應進行了初步的研究，為進一步探討OsDUF761基因在水稻響應非生物脅迫中的功能提供了實驗依據(jù).在水稻中鑒定出7個DUF761基因(OsDUF761.01-OsDUF761.02)，分布在水稻3、6、7、8、10和12號染色體上；來源于擬南芥和水稻的DUF761蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹表明， DUF761蛋白在進化上能夠分為3個亞類，并且每一個亞類中都包含單、雙子葉植物的DUF761蛋白，說明DUF761蛋白的基本特征在單、雙子葉植物分化之前已經(jīng)形成.基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，OsDUF761s基因結(jié)構(gòu)類似，均只有1個外顯子，其編碼蛋白包含有1～2個保守的DUF761結(jié)構(gòu)域，進一步說明了DUF761成員間在進化和功能上的保守性.OsDUF761s亞細胞定位預測結(jié)果表明，大多數(shù)OsDUF761蛋白都具有生物膜(細胞膜、線粒體膜、葉綠體膜等)定位特征，暗示其功能可能與生物膜相關(guān)生理生化過程有關(guān).

非生物脅迫誘導基因的表達受其上游啟動子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，對基因啟動子區(qū)段所含有的順式作用元件進行分析，能夠初步預測該基因可能參與的脅迫響應[24].在本研究中，利用PlantCARE對7個OsDUF761基因的啟動子區(qū)段(ProOsDUF761)進行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，OsDUF761啟動子區(qū)段所含有的順式作用元件可以分為3類.一類是與直接與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，包括光響應元件Box4(F)和G-Box(I)、厭氧誘導元件ARE(D)、低溫響應元件LTR(J)和脅迫響應元件TC-rich repeats(P)；第二類是參與脅迫相關(guān)激素響應的順式作用元件，包括脫落酸響應順式作用元件ABRE(A)、茉莉酸甲酯響應順式作用元件TGACG-motif(H)、水楊酸響應順式作用元件TCA-element(Q)；第三類是脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式作用元件，包括干旱誘導MYB結(jié)合位點MBS(K)、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(L)、MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(M)、WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件W box(R).這些非生物逆境相關(guān)順式作用元件在OsDUF761s啟動子區(qū)域的廣泛存在暗示OsDUF761s基因可能在水稻響應非生物脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用.因此，本研究對OsDUF761s基因在PEG、4 ℃、NaCl和脫水脅迫下的時空表達模式進行了分析.結(jié)果表明，6個OsDUF761s基因在PEG、4 ℃、NaCl和脫水脅迫下都有不同程度的差異表達，尤其是.在PEG處理下，只有OsDUF761.04和OsDUF761.07有不同程度的的上調(diào)表達；但是在脫水脅迫下，OsDUF761.04受脫水脅迫顯著誘導上調(diào)表達，OsDUF761.07受脫水脅迫顯著誘導下調(diào)表達，說明OsDUF761.04和OsDUF761.07在水稻響應滲透脅迫和極端干旱中存在明顯的功能分化，且水稻體內(nèi)存在不同的機制去調(diào)控OsDUF761.04在OsDUF761.07的表達以區(qū)分響應這兩種脅迫類型.我們還發(fā)現(xiàn)除OsDUF761.02只對低溫和脫水脅迫有明顯響應外，其余成員對低溫、NaCl和脫水脅迫下均有明顯的差異表達，說明OsDUF761基因家族成員主要參與水稻對低溫、NaCl和脫水脅迫等脅迫的抗逆調(diào)控.其中OsDUF761.03受NaCl處理誘導上調(diào)表達最為顯著，OsDUF761.07受NaCl處理誘導下調(diào)表達最為顯著；OsDUF761.02受低溫處理誘導上調(diào)表達最為顯著，OsDUF761.06受低溫處理誘導下調(diào)表達最為顯著；OsDUF761.04受脫水處理誘導上調(diào)表達最為顯著，OsDUF761.07受脫水處理誘導下調(diào)表達最為顯著.上述基因可以作為后續(xù)研究重點進一步解析其在水稻抵御非生物逆境中的生物學功能，并為利用基因工程改良水稻的抗逆能力提供基因資源和參考依據(jù).

4 結(jié)論

基于DUF761基因家族在植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應中的重要作用，本研究鑒定出水稻中共有7個DUF761s基因，并對水稻DUF761s基因家族的染色體定位、進化樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域進行了分析；對水稻DUF761s基因家族啟動子順式作用元件進行了預測；對水稻DUFs家族基因在多種非生物脅迫下表達模式進行了檢測，為后續(xù)研究水稻DUFs家族響應非生物脅迫的分子機制提供理論基礎(chǔ)，為進一步研究水稻DUF761的功能提供了參考.