茍亞軍，朱薪宇，王海洋，沈榮鑫

(亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

水稻Oryza sativaL.是世界上最重要的糧食作物之一，全球超過(guò)一半的人口以水稻為主食，水稻產(chǎn)量的高低直接影響糧食安全[1]。20世紀(jì)50年代矮化育種和70年代雜交水稻品種的選育與推廣，使我國(guó)水稻產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)了2次重大突破[2]。但目前雜交稻多為秈稻亞種內(nèi)雜交品種，雜交親本遺傳關(guān)系近，產(chǎn)量潛力已趨極限，導(dǎo)致近20年來(lái)我國(guó)水稻產(chǎn)量停滯不前。隨著耕地面積減少和人口日益增長(zhǎng)，不斷提高水稻產(chǎn)量仍然是水稻育種的首要任務(wù)[3]。秈稻Indica和粳稻Japonica是亞洲栽培稻馴化過(guò)程中產(chǎn)生的2個(gè)明顯分化的亞種，亞種間雜交具有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)，預(yù)計(jì)產(chǎn)量可較目前廣泛種植的秈/秈雜交稻進(jìn)一步提高20%左右，是雜交稻育種進(jìn)一步發(fā)展的主要方向[4-5]。充分利用秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)是保障我國(guó)糧食供給安全的重要途徑；但是，秈粳強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的直接利用受到秈粳雜種不育、雜種F1生育期長(zhǎng)、F1株高偏高、粳稻柱頭外露率低以及秈粳花時(shí)不遇等瓶頸因素的嚴(yán)重制約，導(dǎo)致秈粳雜交育種一直停滯不前。因此，解析上述秈粳雜種優(yōu)勢(shì)利用瓶頸因素的遺傳基礎(chǔ)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

花時(shí)是水稻重要的農(nóng)藝性狀，其概念包括2種：一種是指1朵穎花從開(kāi)穎到閉穎的時(shí)間；另一種是指大田群體穎花在1 d中的開(kāi)花時(shí)間或開(kāi)花持續(xù)時(shí)間，可分為始花時(shí)(第1朵花開(kāi)放的時(shí)間)、盛花時(shí)(穎花實(shí)際開(kāi)放數(shù)達(dá)到當(dāng)天應(yīng)開(kāi)花數(shù)的50%)和終花時(shí)(開(kāi)花結(jié)束時(shí)間)，通常指開(kāi)花高峰或盛花時(shí)間[6-7]。大田群體穎花的盛花時(shí)間在水稻生產(chǎn)上具有重要意義，也是花時(shí)研究的主要對(duì)象。在雜交水稻生產(chǎn)過(guò)程中，父母本開(kāi)花高峰錯(cuò)位的現(xiàn)象稱為花時(shí)不遇。尤其是秈粳亞種間雜交制種時(shí)，作為父本的秈稻恢復(fù)系開(kāi)花早，而作為母本的粳稻不育系開(kāi)花晚，父母本花時(shí)不遇導(dǎo)致制種產(chǎn)量低，雜交種子價(jià)格高，嚴(yán)重阻礙了秈粳雜種優(yōu)勢(shì)的利用。此外，水稻穎花開(kāi)放的時(shí)候?qū)囟茸兓顬槊舾?，開(kāi)花時(shí)遭遇高溫會(huì)導(dǎo)致花藥開(kāi)裂不良、花粉活力降低，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低[8]。因此，解析水稻花時(shí)調(diào)控的內(nèi)外因素和遺傳機(jī)理，對(duì)解決水稻雜交制種過(guò)程中花時(shí)不遇，以及開(kāi)花期間因高溫引起的田間水稻穎花不育具有重要意義。

1 水稻穎花結(jié)構(gòu)和開(kāi)花習(xí)性

水稻是單子葉模式植物，具有與雙子葉植物不同的花序結(jié)構(gòu)，小穗是水稻花序結(jié)構(gòu)的基本單位[9](圖1a)。典型的水稻小穗由1對(duì)副護(hù)穎、1對(duì)護(hù)穎、外稃、內(nèi)稃、6枚雄蕊、1枚雌蕊和1對(duì)漿片組成，雄蕊包括花藥和花絲，雌蕊包括子房和柱頭[9-10](圖1a、1b)。

圖1 水稻穎花結(jié)構(gòu)及秈、粳稻花時(shí)對(duì)比Fig. 1 The rice floret structure and the comparison of floret-opening-time between indica and japonica

水稻開(kāi)花是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，包括漿片膨大、外稃張開(kāi)、花絲伸長(zhǎng)、花藥開(kāi)裂、授粉受精和穎花閉合等事件[11-12]。一般而言，水稻抽穗后1～2 d就會(huì)開(kāi)始開(kāi)花，5～7 d全穗開(kāi)完，第3天前后開(kāi)花最盛[13]。大田群體穎花始花后，30～120 min盛花，75～165 min開(kāi)完。有趣的是，不同水稻品種均遵循嚴(yán)格的穎花開(kāi)放順序：開(kāi)穎時(shí)，主軸上的花先開(kāi)，然后從上至下各個(gè)分枝依次開(kāi)放；在一個(gè)枝梗上，頂端第1朵花最先開(kāi)放，然后由基部向上順序開(kāi)放，頂端第2朵小花開(kāi)放最遲，每朵花從開(kāi)放到關(guān)閉約需1～2 h[14]。這種現(xiàn)象對(duì)判斷花時(shí)性狀表型具有重要的指導(dǎo)意義。

在水稻雜交制種過(guò)程中，由于遺傳背景的差異，父母本的花時(shí)往往不一致。一般而言，恢復(fù)系(父本)開(kāi)花較早且花時(shí)集中，晴天在上午10:30左右始花，11:00左右盛花，12:30左右開(kāi)穎結(jié)束；而不育系開(kāi)花較晚且花時(shí)分散，始花大概在11:30左右，12:00以后開(kāi)花數(shù)量增加，17:00—18:00完成開(kāi)穎，有些品種持續(xù)開(kāi)花到晚上，沒(méi)有明顯的開(kāi)穎高峰[6,13]。父母本花時(shí)不遇會(huì)造成異交結(jié)實(shí)率大大降低。花時(shí)不遇問(wèn)題在秈粳亞種間雜交制種時(shí)更為突出，通常秈稻開(kāi)花較早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，粳稻開(kāi)花相對(duì)較遲、開(kāi)花分散且持續(xù)時(shí)間短。秈稻材料的盛花時(shí)間較粳稻早1～3 h[15]，如圖1c、1d所示。秈粳稻花時(shí)不遇限制了秈粳雜交制種的產(chǎn)量，是制約秈粳亞種間雜交稻強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵瓶頸之一[16]。

2 水稻穎花開(kāi)放的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

漿片是控制水稻開(kāi)放和閉合最關(guān)鍵的器官。早在1675年，Malpighi就提出了漿片的概念，到了1881年，H?ckel證實(shí)漿片在開(kāi)花前快速吸水進(jìn)而推開(kāi)內(nèi)外稃使得水稻穎花開(kāi)放[17]；隨后學(xué)者開(kāi)始對(duì)漿片的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。

漿片對(duì)稱分布于內(nèi)、外稃之間的子房基部，由大型薄壁細(xì)胞和分布均勻的小型維管束組成。靠近內(nèi)稃部位的漿片細(xì)胞壁稍厚，壁不曲折，吸水后體積變化較??；而中部及外稃一側(cè)的細(xì)胞壁薄而曲折，吸水后體積變化大。維管束中有一些較小的薄壁細(xì)胞，這些細(xì)胞富含線粒體，并且細(xì)胞間有胞間連絲。維管束與小穗軸相連，漿片可通過(guò)維管束從小穗軸快速吸水膨脹[18-20]。不育系漿片中的維管束數(shù)目少，缺少導(dǎo)管，花絲中無(wú)導(dǎo)管，細(xì)胞自溶慢，這可能是不育系開(kāi)穎遲、閉穎慢，花絲伸長(zhǎng)少及不易萎縮的主要原因[21]。

穎花開(kāi)閉是漿片吸水膨大和失水萎縮的過(guò)程(圖2a)。水稻的內(nèi)外稃通過(guò)相互嵌合的鉤合槽把花內(nèi)器官封閉起來(lái)，漿片吸水膨脹后將外稃向外推開(kāi)，同時(shí)將內(nèi)稃向內(nèi)壓擠，使內(nèi)外稃的鉤合槽松開(kāi)，外稃和內(nèi)稃相互分開(kāi)，這時(shí)雄蕊花絲急速伸長(zhǎng)，使花藥伸出穎殼并裂開(kāi)，花粉散落，進(jìn)行授粉(圖2b、2c)。開(kāi)完花之后，漿片細(xì)胞液泡膜破裂，發(fā)生細(xì)胞自溶，漿片中的水分和解體物經(jīng)導(dǎo)管向小穗軸運(yùn)輸后失水，外稃在小穗軸的彈力下與內(nèi)稃重逢，使得穎花重新閉合[18,20]

圖2 水稻開(kāi)花前后不同時(shí)間點(diǎn)漿片吸水膨脹與失水萎縮過(guò)程Fig. 2 The process of lodicule swelling and shrinking in rice before and after floret-opening

3 水稻穎花開(kāi)放的生理基礎(chǔ)

漿片能否吸水膨脹受到2方面因素的制約：一是漿片細(xì)胞的滲透勢(shì)，只有滲透勢(shì)低時(shí)，細(xì)胞才具有潛在的吸水能力；二是漿片細(xì)胞壁的松弛，只有細(xì)胞壁松弛，才能使細(xì)胞吸水后體積膨大[20]。其中，滲透勢(shì)的變化推測(cè)主要是由于漿片內(nèi)可溶性糖含量的上升引起的。王忠等[18]發(fā)現(xiàn)，開(kāi)穎前漿片細(xì)胞中的淀粉在淀粉酶的作用下水解成可溶性糖，使細(xì)胞的滲透壓增大，水勢(shì)下降，但是開(kāi)穎時(shí)可溶性糖的增加量遠(yuǎn)大于淀粉的減少量，說(shuō)明開(kāi)穎時(shí)可溶性糖的增加還包括其他多糖的水解和從其他器官的輸入。薛欣艷[22]發(fā)現(xiàn)，臨開(kāi)花階段，漿片細(xì)胞中與糖酵解有關(guān)的關(guān)鍵酶表達(dá)豐度顯著上升，液泡酸性轉(zhuǎn)化酶在臨開(kāi)花和開(kāi)花后5～20 min出現(xiàn)，它催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，與糖酵解的各種中間產(chǎn)物一起降低細(xì)胞的滲透勢(shì)。劉娟[23]發(fā)現(xiàn)1個(gè)早開(kāi)花的突變體，測(cè)定漿片中可溶性糖含量，發(fā)現(xiàn)突變體和野生型開(kāi)穎前后漿片中可溶性糖含量均有所增加，但是突變體漿片中的糖含量高于野生型，較多的可溶性糖可以增加細(xì)胞的滲透壓以及提供更多的能力，進(jìn)而使開(kāi)花時(shí)間提前。

王忠等[18]研究測(cè)定了漿片中K+、Na+、Ca2+、Mg2+等離子在開(kāi)穎前后的含量，發(fā)現(xiàn)這些離子在開(kāi)穎前后含量并無(wú)明顯變化，僅在開(kāi)穎后漿片萎縮時(shí)才減少，并且用0.1 mol/L的K+、Na+、Ca2+、Mg2+等鹽溶液浸穗，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的促進(jìn)開(kāi)穎作用，推測(cè)無(wú)機(jī)離子對(duì)漿片水勢(shì)的變化沒(méi)有明顯作用。但是，也有研究支持漿片中K+、Ca2+等無(wú)機(jī)離子可能對(duì)漿片細(xì)胞滲透勢(shì)的調(diào)節(jié)起著重要作用。Heslop-Harrison等[19]認(rèn)為穎花開(kāi)放前，漿片底部薄壁細(xì)胞中K+的積累使得滲透勢(shì)降低，水分從小穗軸流入漿片。鄒春梅等[24]也認(rèn)為在水稻穎花開(kāi)放過(guò)程中，漿片中K+含量上升。有意思的是，穎花開(kāi)閉過(guò)程中漿片中Ca2+的分布和濃度呈現(xiàn)規(guī)律性的動(dòng)態(tài)變化。在開(kāi)花前，Ca2+主要集中在導(dǎo)管和細(xì)胞間隙中，臨近開(kāi)花時(shí)，漿片的薄壁細(xì)胞上富集了大量的Ca2+，而開(kāi)花后Ca2+緩慢地向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，說(shuō)明漿片的膨脹也與Ca2+的流動(dòng)有關(guān)[22]。Qin等[25]發(fā)現(xiàn)水稻穎花臨近開(kāi)放時(shí)，漿片中結(jié)合狀態(tài)的Ca2+轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)，從細(xì)胞壁轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中；開(kāi)花后Ca2+又重新轉(zhuǎn)移到細(xì)胞壁中，并轉(zhuǎn)換成結(jié)合狀態(tài)。利用Ca2+螯合劑EGTA固定Ca2+后，外源施加茉莉酸甲酯并不能促進(jìn)水稻開(kāi)花，表明Ca2+在調(diào)控水稻花時(shí)中可能起了重要的作用。探究K+、Ca2+等無(wú)機(jī)離子在水稻穎花開(kāi)閉過(guò)程中的作用可為深入理解誘發(fā)該過(guò)程的原初反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供新視角。

在穎花開(kāi)穎前1天或開(kāi)穎前數(shù)小時(shí)，漿片細(xì)胞的液泡內(nèi)溶質(zhì)濃度很高，滲透勢(shì)降低，細(xì)胞具有了很大的吸水潛力。然而，此時(shí)漿片并未充分吸水膨大，這是由于細(xì)胞壁還沒(méi)有完全松弛，細(xì)胞的壓力勢(shì)大，限制了漿片細(xì)胞的充分吸水[20]。目前的研究提示CO2和一些細(xì)胞壁重塑相關(guān)酶在漿片細(xì)胞壁松弛過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。在正常情況下，一天中隨著氣溫上升，穎花的呼吸作用增強(qiáng)，穎花內(nèi)CO2濃度升高，漿片細(xì)胞中pH下降，細(xì)胞壁松弛[26]。另外，基因表達(dá)分析結(jié)果表明，穎花開(kāi)閉過(guò)程中，許多編碼葡聚糖酶、木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶等細(xì)胞壁重塑相關(guān)酶的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，這些酶能夠引起細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛，細(xì)胞膨壓下降[27-29]。滲透壓上升和細(xì)胞壁松弛導(dǎo)致漿片細(xì)胞水勢(shì)下降，在水通道蛋白的作用下，漿片細(xì)胞吸收水分迅速擴(kuò)張，推開(kāi)內(nèi)外稃，穎花開(kāi)放[30]。

4 水稻穎花開(kāi)放調(diào)控機(jī)理

水稻花時(shí)是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，受到各種環(huán)境因素、內(nèi)部植物激素以及自身遺傳基礎(chǔ)的共同調(diào)控[12,31-32]。研究者們通過(guò)正向遺傳學(xué)的方法定位到一些調(diào)控花時(shí)的數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci, QTLs)，但目前尚未有調(diào)控花時(shí)性狀的QTL被精細(xì)定位和克隆。近年來(lái)，通過(guò)多組學(xué)分析與反向遺傳學(xué)相結(jié)合手段，相繼克隆了一些控制水稻花時(shí)的重要基因，推動(dòng)了水稻花時(shí)研究領(lǐng)域的發(fā)展。植物激素茉莉酸強(qiáng)烈誘導(dǎo)水稻穎花開(kāi)放效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，為研究水稻花時(shí)性狀的內(nèi)源信號(hào)調(diào)控機(jī)制提供了重要線索[32]。以下將系統(tǒng)總結(jié)調(diào)控水稻花時(shí)的QTLs與相關(guān)基因，重點(diǎn)闡述植物激素特別是茉莉酸調(diào)控水稻穎花開(kāi)放的機(jī)理，并介紹水稻花時(shí)對(duì)外部環(huán)境(如溫度、光照和CO2濃度等)變化的響應(yīng)及其可能的機(jī)制，最后提出水稻穎花開(kāi)放的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4.1 調(diào)控水稻花時(shí)的遺傳基礎(chǔ)

4.1.1 調(diào)控花時(shí)的QTLs 自20世紀(jì)90年代起，中國(guó)科學(xué)家就開(kāi)始了對(duì)水稻花時(shí)遺傳機(jī)制的研究。仲維功等[15]發(fā)現(xiàn)秈稻品種‘NJTQ-2’的花時(shí)特性在江蘇和海南表現(xiàn)相同；李金軍等[33]對(duì)72份秈、粳不同品種在嘉興和海南進(jìn)行開(kāi)花習(xí)性的比較，兩地試驗(yàn)結(jié)果一致。這些觀察表明不同水稻品種的花時(shí)特性受一定遺傳基礎(chǔ)制約且有一定的穩(wěn)定性[15,33]。

為了探究調(diào)控花時(shí)的遺傳機(jī)制，前人利用開(kāi)花時(shí)間不同的水稻品種構(gòu)建遺傳群體，結(jié)合分子標(biāo)記圖譜，定位到一些控制花時(shí)性狀的QTLs，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。馬作斌等[7]用‘七山占’(09:30左右始花、11:00左右盛花)和‘秋光’(11:00左右始花、11:30左右盛花)2個(gè)親本構(gòu)建分離群體，定位到6個(gè)花時(shí)相關(guān)的QTLs。這2個(gè)親本始花時(shí)間相差90 min，而盛花時(shí)間只相差30 min，因此定位到的QTLs效應(yīng)都非常微小，來(lái)源于‘七山占’的qVFT-10僅能使‘秋光’的盛花時(shí)間提前10多分鐘。萬(wàn)國(guó)等[35]采用的早花時(shí)粳稻品種‘WAB368-B-2-H2-HB’開(kāi)花時(shí)間為9:30—10:00，晚花時(shí)粳稻品種‘六千辛’開(kāi)花時(shí)間為11:00—11:30，親本之間花時(shí)差異也不是特別大，因此定位到的QTLs貢獻(xiàn)率也都比較低，這些單個(gè)的QTL都難以應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐。而Pham等[34]利用的亞洲野生稻‘W630’比粳稻‘日本晴’早開(kāi)花2～3 h，定位到的QTLs效應(yīng)相對(duì)較大，野生稻來(lái)源的SOTb和SOTm能夠使‘日本晴’的花時(shí)提前30～60 min左右。藥用稻Oryza officinalis是清晨06:00就開(kāi)花的野生稻材料，O. officinalis來(lái)源的qEMF3能夠使秈稻‘南京11’和‘IR24’的花時(shí)提前1.5～2.0 h[36]。

表1 花時(shí)QTLs的詳細(xì)信息Table 1 The details of floret-opening-time QTLs

由此可見(jiàn)，親本花時(shí)差異越大，定位到的QTLs效應(yīng)也越大。亞洲栽培稻的不同品種之間雖然存在花時(shí)差異，但是大部分材料在08:00—09:00后開(kāi)放，沒(méi)有開(kāi)花特別早的品種，且不同品種之間的花時(shí)差異最多也只有3～4 h；而不同野生稻每日開(kāi)花時(shí)間差異很大，最早的05:00就開(kāi)花，而最晚的22:30才開(kāi)花[37-38]。因此，利用早開(kāi)花的野生稻材料和晚開(kāi)花的亞洲栽培稻材料構(gòu)建群體，結(jié)合GWAS、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等新技術(shù)手段，有望更快、更準(zhǔn)確地定位到效應(yīng)明顯的早花時(shí)QTLs。

4.1.2 調(diào)控水稻穎花開(kāi)放的基因 由于花時(shí)性狀調(diào)查困難，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，且受環(huán)境因素影響較大，目前從正向遺傳學(xué)尚未克隆到影響花時(shí)的基因。漿片是控制水稻穎花開(kāi)閉的關(guān)鍵器官，通過(guò)研究漿片的發(fā)育以及吸水膨脹和失水萎縮過(guò)程的調(diào)控機(jī)制，科學(xué)家們鑒定了一些調(diào)控水稻開(kāi)花的基因，為深入理解水稻花時(shí)調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。漿片為特化的花器官，MADS轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于花器官的發(fā)育起著重要作用。研究表明，基因OsMADS2、OsMADS4、OsMADS16參與調(diào)控水稻雄蕊和漿片的發(fā)育[39]。OsMADS16突變體又被稱作superwoman1(spw1)，spw1在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期與野生型無(wú)明顯差異，但是在花器官發(fā)育過(guò)程中雄蕊和漿片分別轉(zhuǎn)變?yōu)樾钠ず皖愃苾?nèi)稃的器官，最后導(dǎo)致穎花不能開(kāi)放[40]。OsMADS2和OsMADS4在對(duì)漿片的調(diào)控中具有冗余作用，OsMADS2的RNA干擾材料漿片變小，穎花開(kāi)放延遲；OsMADS4的RNA干擾材料漿片無(wú)明顯變化，穎花可以正常開(kāi)放；OsMADS2和OsMADS4的雙RNA干擾材料表型類似于spw1，穎花不能開(kāi)放[41-42]。

針對(duì)穎花開(kāi)放和閉合過(guò)程中的漿片開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合基因編輯技術(shù)，為快速鑒定水稻花時(shí)調(diào)控基因提供了有效的策略。付永琦等[29]以常規(guī)秈稻品種‘中早25’為材料，對(duì)水稻穎花開(kāi)放前12 h和臨開(kāi)放前1 h的漿片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)比較2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因的表達(dá)變化模式及其功能信息，發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控碳水化合物代謝與運(yùn)輸、細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)修飾以及茉莉酸等激素代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程的基因在穎花臨開(kāi)放前被強(qiáng)烈誘導(dǎo)或抑制表達(dá)，表明這些基因與漿片細(xì)胞吸水膨大調(diào)控水稻穎花開(kāi)放密切相關(guān)。Wang等[43]利用開(kāi)花前不同時(shí)間點(diǎn)的漿片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到1個(gè)在水稻漿片中高表達(dá)的基因DFOT1(Diurnal Flower Opening Time 1)。在‘中花11’中敲除DFOT1可以使開(kāi)花時(shí)間提前2個(gè)多小時(shí)。DFOT1定位在細(xì)胞壁中，編碼1個(gè)含DUF642結(jié)構(gòu)域的蛋白，可以直接與果膠甲基酯酶(Pectin methylesterase，PME)基因家族基因PME40等相互作用，通過(guò)促進(jìn)PMEs的活性降低水稻開(kāi)花前漿片細(xì)胞壁中果膠的甲基酯化程度，使細(xì)胞壁變硬進(jìn)而限制漿片細(xì)胞的吸水膨脹。DFOT1或PME40功能缺失則導(dǎo)致漿片細(xì)胞壁中果膠甲基酯酶活性下降，果膠甲基酯化程度升高，細(xì)胞壁軟化，使得漿片細(xì)胞更容易吸水膨脹，促進(jìn)穎花開(kāi)放。Xu等[44]通過(guò)對(duì)‘宜香1B’進(jìn)行EMS誘變，篩選出1個(gè)早花突變體emf1，能夠使每日的開(kāi)花時(shí)間提早約2.5 h，經(jīng)過(guò)精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)EMF1與Wang等[43]克隆的DFOT1為同一基因。EMF1能夠與PMEs和葡聚糖酶(GLN2)互作從而影響漿片細(xì)胞壁中果膠和纖維素的合成。DFOT1/EMF1是首次報(bào)道直接調(diào)控水稻花時(shí)的基因，為水稻花時(shí)改良提供了很好的基因資源。這2個(gè)研究表明細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于漿片吸水膨脹有著重要的作用，為后續(xù)水稻花時(shí)的研究提供重要借鑒。

4.2 植物激素對(duì)水稻穎花開(kāi)放的調(diào)控

4.2.1 茉莉酸 植物激素對(duì)于水稻穎花的開(kāi)閉具有重要作用，而茉莉酸(Jasmonic acid，JA)是目前研究最清楚且效果最為明顯的激素。JA及其衍生物茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)統(tǒng)稱為茉莉酸類物質(zhì)(Jasmonates，JAs)，是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、防御反應(yīng)、開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)及花發(fā)育進(jìn)程等生物學(xué)過(guò)程[45]。關(guān)于JA的生物合成途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)目前已經(jīng)有了較深入的研究(圖3)[46]，DAD1、AOC、AOS、OPR、LOX、ACX、JAR1等是JA生物合成中的重要基因，COI1、JAZs、MYC、MYB等是JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要信號(hào)分子[47]。當(dāng)植物受到外界環(huán)境刺激時(shí)，植物體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成大量JA，在茉莉酸氨基酸合成酶JAR1的作用下形成具有高度生物活性的JA-Ile，JA-Ile特異性結(jié)合茉莉酸受體蛋白JAZ蛋白，JAZ的Jas結(jié)構(gòu)域和ZIM結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)與上游的COI1或下游的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，是JA途徑的抑制因子[48-49]。在沒(méi)有JA-Ile時(shí)，JAZ蛋白與下游轉(zhuǎn)錄因子互作，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子對(duì)JA響應(yīng)基因的激活作用；在JA-Ile含量增加時(shí)，JA-Ile與COI1結(jié)合，促進(jìn)COI1與JAZ形成復(fù)合體，在E3泛素連接酶SCF-COI1復(fù)合物作用下使JAZ蛋白被泛素化標(biāo)記，然后被26S蛋白酶體降解，從而解除JAZ對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，啟動(dòng)JA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[50-52]。

圖3 茉莉酸合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物學(xué)功能[46]Fig. 3 Jasmonic acid synthesis, signal transduction and biological function

前人研究表明，外源施加MeJA/JA對(duì)水稻、小麥、黑麥等禾本科植物穎花開(kāi)放有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用，對(duì)雄性不育水稻的誘導(dǎo)效應(yīng)更為明顯[32,53-54]。鄒春梅等[24]利用MeJA處理開(kāi)花前幾個(gè)小時(shí)的穎花，發(fā)現(xiàn)MeJA對(duì)漿片中淀粉酶活性上升、淀粉含量下降、可溶性糖和K+含量的上升具有明顯的促進(jìn)作用。內(nèi)源JAs在水稻穎花器官中的分布具有組織和發(fā)育時(shí)期特異性，在水稻開(kāi)穎前較平穩(wěn)，開(kāi)穎時(shí)急劇上升至峰值，閉穎后又下降[55]。水稻穎花開(kāi)放前18 h，花器官中小穗梗JAs水平最高，內(nèi)外稃次之，雄蕊、漿片和雌蕊極低；穎花開(kāi)放時(shí)，雄蕊和漿片的JAs水平顯著高于其他花器官，而小穗梗JAs含量最低。伴隨穎花開(kāi)放時(shí)漿片JAs水平的大幅上升，JAs生物合成相關(guān)基因OsDAD1、OsAOS1、OsAOC及OsOPR7以及JAs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因OsJAR1、OsCOI1b和13個(gè)OsJAZs的表達(dá)也明顯上調(diào)[11]。水稻漿片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也顯示JAs合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在水稻開(kāi)花過(guò)程中的漿片中均具有明顯的差異表達(dá)[29]。一些參與JAs合成的基因突變后也會(huì)影響水稻穎花的開(kāi)放及閉合。OsJAR1突變體開(kāi)花散亂，一整天包括晚上都會(huì)零星開(kāi)花，突變體的大部分花藥不能正常開(kāi)裂，并且開(kāi)放后漿片仍然保持吸脹狀態(tài)導(dǎo)致穎花不能正常閉合[56]；OsOPR7基因突變后，突變體開(kāi)花凌亂，開(kāi)花后55.8%的穎花不能正常閉合[57]；OsAOS1突變體穎花開(kāi)放后不能正常閉合[58]。這些結(jié)果均表明JAs對(duì)于漿片的吸水膨大和失水萎縮具有至關(guān)重要的調(diào)控作用。

JAs信號(hào)可能調(diào)控秈粳稻花時(shí)差異。閆志強(qiáng)等[59]發(fā)現(xiàn)秈稻對(duì)MeJA調(diào)控的敏感性強(qiáng)于粳稻，秈稻不僅能夠響應(yīng)高濃度的MeJA(4 mmol·L-1)也能響應(yīng)低濃度的MeJA(0.04 mmol·L-1)，而粳稻只能響應(yīng)較高濃度的MeJA(4、0.4 mmol·L-1)。秈稻對(duì)MeJA調(diào)控響應(yīng)所需的時(shí)間較短，而粳稻對(duì)MeJA調(diào)控響應(yīng)所需的時(shí)間較長(zhǎng)。

JAs信號(hào)還可能參與水稻不育系花時(shí)的調(diào)控。一般而言，不育系材料比恢復(fù)系和保持系材料花時(shí)延遲，開(kāi)花時(shí)間也分散，不利于水稻雜交制種[60]。Liu等[61]對(duì)比了細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘珍汕97A’和其保持系‘珍汕97B’漿片中的JAs含量和含水量，發(fā)現(xiàn)不育系‘珍汕97A’由于JAs缺乏導(dǎo)致漿片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和水分積累延緩，進(jìn)而影響漿片吸水膨脹，穎花開(kāi)放受到抑制，開(kāi)花時(shí)間分散。通過(guò)對(duì)JAs合成途徑中的重要基因進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在‘珍汕97A’的漿片中JAs合成關(guān)鍵基因OsAOC的表達(dá)量明顯低于‘珍汕97B’。至于不育系中JAs合成基因表達(dá)量下調(diào)的原因還有待進(jìn)一步的研究。Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在光溫敏核不育系面臨花期高溫脅迫時(shí)，通過(guò)外源施加JA和MeJA類物質(zhì)進(jìn)而增加漿片中JAs的濃度，可以提高漿片中過(guò)氧化氫酶和α-淀粉酶的活性以及抗壞血酸和可溶性糖的濃度，并顯著降低漿片中的H2O2濃度，進(jìn)而增加小穗的開(kāi)穎率。上述研究進(jìn)一步證明了JAs在水稻雜交育種中的重要作用。

4.2.2 其他激素 除了JAs，其他激素也能在一定程度上影響水稻花時(shí)。赤霉素類物質(zhì)‘920’可以使花時(shí)提前，已經(jīng)廣泛用于生產(chǎn)實(shí)踐[62]，噴施油菜素內(nèi)酯也可以使花時(shí)提前[63]；但噴施乙烯和生長(zhǎng)素(IAA)會(huì)延遲水稻花時(shí)[64-65]。另外，Huang等[66]發(fā)現(xiàn)外施IAA會(huì)抑制穎花閉合而外施脫落酸促進(jìn)穎花閉合。Zhao等[67]發(fā)現(xiàn)IAA氧化酶基因DAO突變后不能將有活性的IAA氧化成無(wú)活性的OxIAA，破壞了體內(nèi)IAA的動(dòng)態(tài)平衡導(dǎo)致穎花不能開(kāi)放且花藥不開(kāi)裂。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在dao突變體漿片中IAA轉(zhuǎn)錄因子OsARF18表達(dá)上調(diào)，而OsARF2表達(dá)下調(diào)。OsARF18的過(guò)表達(dá)或OsARF2敲除材料與dao突變體的表型一樣。OsARF18抑制OsARF2的表達(dá)，而OsARF2促進(jìn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsSUT1的表達(dá)，ARF18-ARF2-SUT1模塊通過(guò)影響漿片中蔗糖的含量調(diào)控穎花開(kāi)放[68]。在dao突變體的花藥中JAs含量顯著降低，暗示IAA和JA在調(diào)控穎花開(kāi)放和花藥開(kāi)裂過(guò)程存在相互作用[67]。水楊酸對(duì)MeJA誘導(dǎo)的穎花開(kāi)放具有顯著的抑制作用，這種抑制可以被MeJA的再處理逆轉(zhuǎn)[14]。這些研究表明JAs信號(hào)可能通過(guò)與其他植物激素信號(hào)通路之間的交叉互作共同調(diào)控水稻花時(shí)，揭示激素間如何互作調(diào)控水稻花時(shí)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)將是未來(lái)水稻花時(shí)性狀的研究重點(diǎn)。

4.3 影響水稻穎花開(kāi)放的外部因素

水稻穎花的開(kāi)放受到多種外部因素的調(diào)控，包括光照、CO2濃度、溫度變化、機(jī)械摩擦、風(fēng)力、濕度等，目前認(rèn)為影響花時(shí)最主要的因素是溫度，其次是光照和CO2[12,69-70]。

4.3.1 溫度 水稻穎花開(kāi)放時(shí)對(duì)外界溫度非常敏感，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)嚴(yán)重影響水稻生殖發(fā)育。在自然條件下，氣溫高時(shí)開(kāi)花多且迅速，氣溫低時(shí)開(kāi)花延遲或者不開(kāi)花。早中稻一般在09:00左右開(kāi)始開(kāi)花，而晚稻要接近中午才開(kāi)始開(kāi)花。陰雨天氣溫度降低時(shí)開(kāi)花明顯延遲，而天氣轉(zhuǎn)晴溫度升高時(shí)會(huì)有大量穎花開(kāi)放[71]。這種快速響應(yīng)溫度變化的開(kāi)花習(xí)性將更好地確保水稻成功繁殖。將稻穗先浸于冷水(0～10 ℃)后置于室溫(25～30 ℃)或用溫水(35～45 ℃)浸穗均能促進(jìn)開(kāi)穎；在42～43 ℃水中浸穗0.5～1.0 min，10 min后開(kāi)穎，裂藥良好，花粉活力正常。不同氣溫處理對(duì)開(kāi)穎的效應(yīng)也類似于水溫的處理，0～20 ℃的低溫抑制開(kāi)穎，高溫處理或低溫處理后置于室溫，只要是增溫就可促進(jìn)開(kāi)穎[71]。Jagadish等[72]發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境溫度從30 ℃增加至38 ℃時(shí)，水稻IR64的盛花時(shí)間約提早30 min。這些結(jié)果一致表明溫度上升能夠明顯促進(jìn)開(kāi)花。溫度同時(shí)也影響穎花關(guān)閉。黃友明等[60]發(fā)現(xiàn)35～40 ℃最適于穎花關(guān)閉，高于45 ℃或低于20 ℃對(duì)穎花關(guān)閉均不利，不同溫度處理對(duì)水稻穎花關(guān)閉影響差異非常明顯。另外，秈粳稻響應(yīng)外界溫度的變化也不一樣，隨著溫度的上升，秈稻花時(shí)提早較粳稻明顯(未發(fā)表結(jié)果)。但是，目前尚未有關(guān)于水稻花時(shí)響應(yīng)溫度變化調(diào)控機(jī)理的研究，秈粳稻不同溫度響應(yīng)特性的遺傳基礎(chǔ)也完全不清楚。

4.3.2 光照 光照強(qiáng)度的變化和光照時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)于水稻花時(shí)也有影響。Kobayasi等[12]發(fā)現(xiàn)在開(kāi)花前太陽(yáng)輻射增強(qiáng)可以使花時(shí)提前。蒯建敏等[70]認(rèn)為增加溫度或者日照時(shí)數(shù)對(duì)秈粳稻都有提早開(kāi)花的作用。Biswas等[73]利用γ射線輻射的方式得到1個(gè)光形態(tài)建成受損的水稻突變體cpm1，cpm1在白光下表現(xiàn)為長(zhǎng)胚芽鞘表型，且突變體抽穗后花時(shí)零散、花絲伸長(zhǎng)，與穎花開(kāi)放不同步。有趣的是，Nishiyama等[74]發(fā)現(xiàn)開(kāi)花前將水稻進(jìn)行1 h的黑暗處理能夠使花時(shí)明顯提前，而對(duì)水稻進(jìn)行持續(xù)的光照處理時(shí)，會(huì)導(dǎo)致花時(shí)紊亂、分散或整日開(kāi)花。同樣，顧蘊(yùn)潔等[75]也發(fā)現(xiàn)黑暗中的稻穗受到光照處理時(shí)不會(huì)開(kāi)花，而將水稻從光照條件下轉(zhuǎn)移至黑暗條件下能夠促進(jìn)開(kāi)花。這些結(jié)果說(shuō)明水稻開(kāi)花習(xí)性受光信號(hào)調(diào)控。植物自身節(jié)律與光照息息相關(guān)，大部分水稻在一天中特定的時(shí)間段開(kāi)花，說(shuō)明開(kāi)花也是植物有節(jié)律性的運(yùn)動(dòng)之一。將開(kāi)花前的水稻進(jìn)行短時(shí)間的遮光處理可以明顯促進(jìn)開(kāi)花，長(zhǎng)時(shí)間的光照又會(huì)使得水稻開(kāi)花紊亂，是否是由于光照與黑暗的變化使得水稻穎花中具有節(jié)律性表達(dá)的基因受到了影響，進(jìn)而引起開(kāi)花時(shí)間的變化，值得進(jìn)一步的研究。

4.3.3 CO2濃度 CO2能有效誘導(dǎo)水稻漿片吸水、加快穎花開(kāi)放，且對(duì)小麥、黑麥、燕麥、玉米等禾本科植物的開(kāi)花都有明顯的促進(jìn)效應(yīng)[76]。王忠等[26]發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)≥5%的CO2氣體、pH≤5.6的CO2水溶液能顯著促進(jìn)開(kāi)穎；而N2、呼吸抑制劑NaN3和KCN等能夠抑制呼吸作用，導(dǎo)致穎花CO2濃度降低，進(jìn)而抑制穎花開(kāi)放。據(jù)此，王忠等[26]認(rèn)為穎花因呼吸增強(qiáng)而積累的CO2是促進(jìn)漿片膨大的主要因素，并推測(cè)CO2可能通過(guò)降低細(xì)胞pH，促使細(xì)胞壁松弛。許祥明等[77]還發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)1%左右的甲酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸溶液也能顯著促進(jìn)水稻開(kāi)穎，與CO2的作用機(jī)制一樣，通過(guò)降低細(xì)胞pH促使細(xì)胞壁松弛。也有研究認(rèn)為CO2可能通過(guò)提高穎花溫度進(jìn)而促進(jìn)穎花開(kāi)放[78]。由于CO2處理對(duì)花絲伸長(zhǎng)、裂藥、花粉活力和柱頭活力均無(wú)影響，因此，CO2調(diào)節(jié)開(kāi)穎的技術(shù)可以應(yīng)用于水稻雜交制種[79]。

基于以上研究結(jié)果，我們推測(cè)在水稻穎花成熟時(shí)，外界環(huán)境因素的改變、其他植物激素合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化以及漿片中的JA合成基因表達(dá)量增加等因素使得漿片中的JAs含量上升，OsJAR1表達(dá)量上調(diào)促進(jìn)JA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步通過(guò)MYCs/MYBs轉(zhuǎn)錄因子激活下游JA響應(yīng)基因的表達(dá)，影響漿片內(nèi)碳水化合物的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)的變化，最終導(dǎo)致漿片滲透勢(shì)降低、細(xì)胞壁松弛，漿片吸水膨脹，穎花開(kāi)放(圖4)。

圖4 水稻穎花開(kāi)放的調(diào)控模型Fig. 4 The regulatory model of floret opening in rice

5 展望

穎花開(kāi)閉是水稻生殖發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵生物學(xué)事件，合適的開(kāi)花時(shí)間對(duì)水稻成功繁育后代至關(guān)重要[43]。為了保證最大的繁殖成功率，水稻進(jìn)化出一套精密的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制以適應(yīng)外部環(huán)境(溫度、光照、濕度、CO2濃度等)的變化。因此，研究水稻花時(shí)性狀的調(diào)控機(jī)理對(duì)于理解植物的適應(yīng)性進(jìn)化具有重要的理論意義。目前關(guān)于水稻花時(shí)性狀的研究進(jìn)展較為緩慢，僅有JA信號(hào)通路和少數(shù)基因被證實(shí)參與調(diào)控，其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還很不清楚。為了全面闡明水稻花時(shí)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，今后應(yīng)該綜合利用遺傳學(xué)手段、多組學(xué)手段以及基因編輯技術(shù)等，規(guī)?；寺』〞r(shí)調(diào)控基因，在此基礎(chǔ)上，重點(diǎn)闡明JA與其他激素間交叉互作調(diào)控水稻花時(shí)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，以及水稻快速響應(yīng)外部環(huán)境變化的開(kāi)花習(xí)性的分子機(jī)理。

水稻花時(shí)對(duì)水稻生產(chǎn)也具有重要意義。開(kāi)花時(shí)的溫度＞35 ℃會(huì)導(dǎo)致水稻小穗不育[36]。早季種植的水稻大多在6—8月份抽穗揚(yáng)花，隨著全球氣候變暖，夏季氣溫越來(lái)越高，一些開(kāi)花時(shí)間晚的品種開(kāi)花時(shí)極易遭受高溫脅迫，導(dǎo)致花粉不育，產(chǎn)量降低。讓水稻提早開(kāi)花能夠規(guī)避高溫引起的育性降低。野生稻不同品種間開(kāi)花時(shí)間差異明顯，是研究花時(shí)的優(yōu)良材料，其中，早開(kāi)花的野生稻也可作為培育早花時(shí)品種的種質(zhì)資源。野生稻O. officinalis在06:00開(kāi)花，Ishimaru等[80]將O.officinalis的早花時(shí)QTL(Early morning flowering，EMF)導(dǎo)入到栽培稻‘越光’中可以使‘越光’的花時(shí)至少提前1 h，并且在溫室里進(jìn)行高溫模擬處理時(shí)，導(dǎo)入EMF的‘越光’在10:00前完成開(kāi)花，不育的小穗僅有14.3%，而野生型‘越光’在處理溫度最高的11:00—13:00開(kāi)花，不育的小穗有49.6%。因此，提早水稻開(kāi)花是應(yīng)對(duì)水稻高溫脅迫、提高育性的有效策略[36]。

利用秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)是提高水稻產(chǎn)量的重要手段，但由于秈粳亞種間開(kāi)花習(xí)性存在較大差異，制種產(chǎn)量低，種子成本大幅上升，影響其推廣速度與面積[81]。雖然通過(guò)一些化學(xué)調(diào)控和農(nóng)藝措施可以在一定程度上促進(jìn)父母本花時(shí)相遇，但是這些手段費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以應(yīng)用于大田制種。通過(guò)研究秈粳稻花時(shí)的遺傳規(guī)律，找到調(diào)控秈粳稻花時(shí)差異的關(guān)鍵基因，培育早花時(shí)的粳稻或者花時(shí)推遲的秈稻品種是解決花時(shí)不遇的根本途徑。但是，目前克隆的調(diào)控花時(shí)的基因極少，對(duì)于花時(shí)遺傳調(diào)控機(jī)理的解析需要研究策略上的創(chuàng)新。漿片是控制水稻開(kāi)花的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，以漿片作為研究對(duì)象可能是挖掘花時(shí)基因的一個(gè)突破口。Wang等[43]在漿片轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上篩選并克隆了第1個(gè)花時(shí)基因DFOT1，在秈稻常規(guī)品種、粳稻常規(guī)品種和不育系中編輯DFOT1都可以提早開(kāi)花，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)主栽品種進(jìn)行單倍型分析，鑒定了秈稻早花的DFOT1單倍型，攜帶早花DFOT1單倍型的品種可以作為特異種質(zhì)或雜交親本應(yīng)用于雜交制種。利用開(kāi)花過(guò)程中秈粳稻不同時(shí)間點(diǎn)漿片的轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析，有望鑒定出調(diào)控秈粳稻花時(shí)差異的關(guān)鍵基因和物質(zhì)，結(jié)合遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)等手段，進(jìn)一步解析調(diào)控秈粳稻花時(shí)差異的分子網(wǎng)絡(luò)，并篩選出早花時(shí)基因的優(yōu)良單倍型應(yīng)用于水稻育種。