江天晴，鄧詣群，文繼開

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510642)

細(xì)胞水平生物進(jìn)化的一個(gè)明顯特征是從相對(duì)均勻的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中發(fā)展出不同的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞器可以隔離生物大分子以提高特定生化過(guò)程的反應(yīng)速率。真核細(xì)胞有2種細(xì)胞器，即膜結(jié)合的細(xì)胞器和無(wú)膜細(xì)胞器。無(wú)膜細(xì)胞器因缺失膜結(jié)構(gòu)而更具靈活性，其蛋白質(zhì)和核酸分子能夠根據(jù)細(xì)胞微環(huán)境的變化動(dòng)態(tài)地進(jìn)行組裝和解聚[1]。在受到外界環(huán)境刺激時(shí)，細(xì)胞通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑、改變基因表達(dá)等來(lái)快速抵抗壓力并維持穩(wěn)態(tài)，這個(gè)細(xì)胞重編程的過(guò)程被稱為細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[2]。而無(wú)膜細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)特性使得其在快速響應(yīng)細(xì)胞變化方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。如圖1所示，本文以4種無(wú)膜細(xì)胞器(應(yīng)激顆粒、P-小體、核仁、卡哈爾體)為代表總結(jié)無(wú)膜細(xì)胞器的特點(diǎn)、在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用、以及其與疾病的關(guān)系。

圖1 無(wú)膜細(xì)胞器和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)系Fig. 1 The relationship between membraneless organelles and cellular stress response

1 無(wú)膜細(xì)胞器簡(jiǎn)介

1.1 無(wú)膜細(xì)胞器的特點(diǎn)

在細(xì)胞水平生物進(jìn)化過(guò)程中，真核細(xì)胞為了更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞組分、代謝過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)的時(shí)空控制，細(xì)胞發(fā)生區(qū)室化形成了許多細(xì)胞器。真核細(xì)胞有2種細(xì)胞器，一種是膜結(jié)合細(xì)胞器(細(xì)胞核、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和突觸小泡等)，另一種是無(wú)膜細(xì)胞器(應(yīng)激顆粒、P-小體、核仁、卡哈爾體等)[3]。膜結(jié)合細(xì)胞器的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)可以將特定的蛋白質(zhì)、核酸和其他分子封閉在有限的空間內(nèi)，這種現(xiàn)象使細(xì)胞器能夠更有效地發(fā)揮功能。這些蛋白質(zhì)或核酸從細(xì)胞器中泄漏可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，例如，細(xì)胞色素 c 釋放到細(xì)胞質(zhì)中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而核酸釋放到細(xì)胞質(zhì)中導(dǎo)致先天免疫途徑的激活[4-5]。相比之下，無(wú)膜細(xì)胞器沒有任何膜結(jié)構(gòu)的限制，可以經(jīng)常與周圍的細(xì)胞質(zhì)交換各種分子物質(zhì)。近幾十年來(lái)，多種新型無(wú)膜細(xì)胞器被發(fā)現(xiàn)，它們的結(jié)構(gòu)與組成也逐漸被解析。然而，關(guān)于這些無(wú)膜結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制以及它們?nèi)绾伟l(fā)揮生物學(xué)功能仍然有待解答，這也是近年來(lái)細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

1.2 無(wú)膜細(xì)胞器的形成驅(qū)動(dòng)力

液-液相分離 (Liquid-liquid phase separation，LLPS) 是聚合物化學(xué)中眾所周知的現(xiàn)象，在結(jié)晶試驗(yàn)中經(jīng)常觀察到此現(xiàn)象，液滴的形成降低了成核的自由能[6]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，相分離可能是無(wú)膜細(xì)胞器形成的潛在機(jī)制[7]。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-RNA 和 RNA-RNA 間的相互作用以及內(nèi)在無(wú)序區(qū)域(Intrinsically disordered regions，IDR)間的弱、瞬時(shí)、多價(jià)相互作用，包括ππ 相互作用、陽(yáng)離子-陰離子相互作用、偶極-偶極相互作用和 π-陽(yáng)離子相互作用，這些多價(jià)相互作用促使某些蛋白質(zhì)和RNA相互聚集轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂胁煌砘再|(zhì)的另一相，從而形成無(wú)膜細(xì)胞器[8-9]。無(wú)膜細(xì)胞器表現(xiàn)出比周圍介質(zhì)更高的蛋白質(zhì)密度和更弱的分子運(yùn)動(dòng)，從而提高了生化反應(yīng)的速率[7]。在大多數(shù)情況下，這些結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出液體特征，因此被描述為小體、顆粒、液滴等。

1.3 無(wú)膜細(xì)胞器的特性與應(yīng)激響應(yīng)的關(guān)系

無(wú)膜細(xì)胞器生理功能的探索一直是備受關(guān)注的研究方向，它在各種細(xì)胞生化過(guò)程中發(fā)揮作用，包括應(yīng)激反應(yīng)、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的控制等[10]。根據(jù)無(wú)膜細(xì)胞器的物理性質(zhì)，推測(cè)其主要從4個(gè)方面發(fā)揮功能，包括調(diào)節(jié)生化反應(yīng)的濃度、隔離有害成分、生物分子的儲(chǔ)存和信號(hào)放大[11]。這些無(wú)膜細(xì)胞器的形成可以幫助細(xì)胞快速響應(yīng)環(huán)境信號(hào)，從而促進(jìn)存活。盡管不同類型細(xì)胞中無(wú)膜細(xì)胞器的數(shù)量有所差異，細(xì)胞在感受到外界環(huán)境變化時(shí)，其轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化，而某些無(wú)膜細(xì)胞器的快速形成可以確保細(xì)胞中可溶性分子的濃度保持恒定，維持穩(wěn)態(tài)平衡。并且，某些細(xì)胞成分如蛋白質(zhì)與mRNA可以暫時(shí)儲(chǔ)存在無(wú)膜細(xì)胞器中，更快地響應(yīng)壓力。近年來(lái)，已有不少研究表明，無(wú)膜細(xì)胞器在細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12]。細(xì)胞質(zhì)中的應(yīng)激顆粒在細(xì)胞受到刺激時(shí)快速形成，而在壓力消失時(shí)解聚，被認(rèn)為可以幫助細(xì)胞抵抗外部環(huán)境變化。而P-小體在一些細(xì)胞類型中是一直存在的，只是在受到壓力時(shí)顆粒的大小和數(shù)量都會(huì)有所增加，但其成分也會(huì)發(fā)生變化，在壓力解除時(shí)也會(huì)同應(yīng)激顆粒一樣消失。核仁和卡哈爾體則是細(xì)胞核中的重要無(wú)膜細(xì)胞器，參與核糖體合成等，其在細(xì)胞受到刺激時(shí)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，并且它們的功能維持也對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要，但其與應(yīng)激響應(yīng)的具體聯(lián)系還需進(jìn)一步探究。

2 應(yīng)激顆粒與P-小體

2.1 壓力響應(yīng)下的組裝機(jī)制

應(yīng)激顆粒 (Stress granule，SG) 是最具特征的細(xì)胞質(zhì)無(wú)膜細(xì)胞器之一，在受到氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激、滲透壓力、病毒感染、蛋白酶體抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、紫外線照射、缺氧、能量消耗等不同的刺激時(shí)形成[13]。刺激早期，細(xì)胞的整體翻譯受到抑制，mRNA 從多聚核糖體中解離并在核糖核蛋白(Ribonucleoprotein，RNP)復(fù)合物中積累。細(xì)胞質(zhì)中RNP 的濃度增加，并且與一些 RNA 結(jié)合蛋白 (RNA-binding proteins，RBPs) 結(jié)合，例如激活 SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白 1 (Ras-GTPase activating SH3 domain-binding protein 1，G3BP1) 和 T 細(xì)胞內(nèi)部抗原-1 (T-cell internal antigen-1，TIA-1) ，觸發(fā)了更多種蛋白質(zhì)的募集，這些蛋白的共同特征在于其結(jié)構(gòu)中存在IDR[14]。IDR介導(dǎo)蛋白質(zhì)和 RNA 成分間的多價(jià)相互作用，其中，G3BP1 作為促進(jìn) RNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和RNA-RNA 相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，最終促進(jìn) LLPS和 SG 形成。SG呈現(xiàn)高度動(dòng)態(tài)的特征，在壓力恢復(fù)后快速解聚，釋放存儲(chǔ)的 mRNAs 使其再次進(jìn)入翻譯過(guò)程[15]。不同條件下的SG組裝通過(guò)不同的相互作用。例如，在氧化應(yīng)激中，G3BP1 和 G3BP2 通過(guò)自身相互作用和與caprin的相互作用誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 SG 形成[16-17]。然而，在滲透壓力期間，G3BP1/2 和 caprin 并不是 SG 形成所必需的[18]。同樣，在葡萄糖饑餓期間，酵母中的 Gtr1、Rps1b 和Hgh1 促進(jìn) SG 的形成，但在熱休克期間卻抑制 SG的形成[19]。這表明顆粒可以根據(jù)特定的細(xì)胞條件進(jìn)行不同的組裝，并且 SG 可能在不同的環(huán)境刺激下具有不同的功能。

壓力會(huì)觸發(fā)翻譯停滯誘導(dǎo)SG形成，其中的作用途徑主要分為2種：一種是真核翻譯起始因子2亞基α(Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit alpha，eIF2α)的激酶響應(yīng)不同刺激而磷酸化eIF2α，抑制翻譯；另一種是一些藥物以不依賴磷酸化eIF2α的方式誘導(dǎo)SG形成。eIF2α的激酶有4種：蛋白質(zhì)激酶R(Double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)，一種由病毒感染、熱和紫外線照射激活的雙鏈RNA依賴性激酶；蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶 (Protein kinase R-like ER kinase,PERK)，一種駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白，當(dāng)未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積聚時(shí)被激活；一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶2(General control nonderepressible 2，GCN2)，一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞中氨基酸水平并對(duì)氨基酸剝奪作出反應(yīng)的蛋白質(zhì)；血紅素調(diào)節(jié)起始因子 2α 激酶(Heme-regulated initiation factor 2α kinase，HRI)，一種紅細(xì)胞成熟過(guò)程中確保珠蛋白鏈和血紅素的平衡并感知亞砷酸鹽產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的蛋白質(zhì)。這些激酶會(huì)磷酸化 eIF2α，誘導(dǎo)SG形成[20-23]。然而，有些情況下SG的形成也與 eIF2α 磷酸化無(wú)關(guān)，例如Pateamine A 破壞 eIF4A 解旋酶和 H2O2破壞eIF4F 復(fù)合物，導(dǎo)致翻譯抑制，從而誘導(dǎo) SG 的形成[24-25]。而在響應(yīng)滲透壓力時(shí)，SG 核心蛋白由于分子擁擠作用而局部濃度升高，從而誘導(dǎo) SG 形成[26]。

P-小體(Processing body，PB)是細(xì)胞質(zhì)RNP顆粒，主要由一些與翻譯抑制和 5'→3' mRNA衰變相關(guān)的蛋白質(zhì)和mRNA 組成[7]。這些 RNP 顆粒在真核生物中是保守的，和 SG 一樣，它們也依賴于蛋白質(zhì)-RNA 相互作用、低復(fù)雜性蛋白質(zhì)序列和LLPS形成。PB在某些細(xì)胞系中組成型存在，在應(yīng)激誘導(dǎo)下，其大小和數(shù)量會(huì)增加。一些蛋白質(zhì)的敲除會(huì)使組成型和應(yīng)激誘導(dǎo)的 PB 減少，主要包括ATP 依賴性 RNA 解旋酶6 (ATP-dependent RNA helicase 6，DDX6)、蛋白質(zhì) LSM14 同源物 A(LSM14A) 和真核翻譯起始因子 4E 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Eukaryotic translation initiation factor 4E transporter，EIF4ENIF1；也稱為 4E-T)[27-28]。SG 和 PB 共享一些蛋白質(zhì)成分，它們可以相互接觸，并且都可以由細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)[29]。而就 mRNAs而言，SG 含有閉環(huán)的多聚腺苷酸化的 mRNAs，而PB 含有去腺苷酸化的線性 mRNAs[30]。PB 是在研究與 5′→3′ mRNA 衰變途徑相關(guān)蛋白質(zhì)的定位過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，最初假設(shè)其是 mRNA 衰變的細(xì)胞位點(diǎn)。然而，mRNA 衰變過(guò)程不需要 PB，并且 mRNA可以從 PB 中釋放出來(lái)重新進(jìn)行翻譯[31-32]。因此，又有專家認(rèn)為PB其實(shí)是翻譯停滯的 mRNA 和無(wú)活性 mRNA 衰變酶的儲(chǔ)存位點(diǎn)，是mRNA 衰變因子在無(wú)多核糖體轉(zhuǎn)錄本積累時(shí)所形成的結(jié)果[33-34]。但是，PB 在 mRNA 衰變中的功能仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。

2.2 在細(xì)胞抵抗壓力中的作用

2.2.1 mRNA分選 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)于發(fā)育、分化、免疫信號(hào)和神經(jīng)元可塑性至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄后，mRNA 還需經(jīng)過(guò)加帽、剪接、多聚腺苷酸化、核輸出、與核糖體的結(jié)合和最終衰變，而這些都需要相應(yīng)的 RNA 結(jié)合蛋白來(lái)協(xié)助完成。熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、缺血或病毒感染，會(huì)引發(fā)翻譯停滯，導(dǎo)致多聚核糖體快速解體[35]。從多聚核糖體中釋放出來(lái)的 mRNA 在許多蛋白質(zhì)的幫助下進(jìn)行分流，該過(guò)程決定了 mRNA 的命運(yùn)。細(xì)胞質(zhì) SG 是這種分選過(guò)程的形態(tài)學(xué)結(jié)果[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，SG和PB還含有RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 (RNA-induced silencing complexes，RISCs) ，表明這些 RNA 顆粒與microRNA (miRNA) 誘導(dǎo)的翻譯沉默途徑整合在一起[37-38]。

關(guān)于哪些特定的 mRNA 包含或不包含在 SG中，我們知之甚少。只有 50% 的細(xì)胞質(zhì) poly(A)RNA 被招募到 SG 中，這表明 SG 的 mRNA 具有一定選擇性[35]。編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、c-MYC、胰島素樣生長(zhǎng)因子 II (Insulin-like growth factor II，IGF-II) 和H19 被募集到 SG 中，而編碼熱休克蛋白 70(HSP70) 和熱休克蛋白 90 (HSP90) 的 mRNA 基本被排除在外[39]。HSP90 和 HSP70的 mRNAs 在熱激時(shí)轉(zhuǎn)錄激活，與 SG 組裝同時(shí)進(jìn)行，并且在這種刺激條件下都被優(yōu)先翻譯，而其他 mRNAs 則不然。MLN51 是參與剪接的重要蛋白，它位于 SG 中，而HSP70 的 mRNA 缺乏內(nèi)含子，避免了剪接過(guò)程，也就不會(huì)因?yàn)榕c MLN51 結(jié)合而被招募到 SG 中[40]。同時(shí)，HSP70 的 mRNA 擁有一個(gè)長(zhǎng)且結(jié)構(gòu)化的 5'非翻譯區(qū) (UTR)，不需要 eIF4F 依賴的 mRNA 掃描，因此eIF4F 失活促進(jìn) SG 組裝的過(guò)程并不影響HSP70 mRNA 的翻譯[41-42]。而且有研究采用綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 標(biāo)記mRNA，發(fā)現(xiàn)其可以定位于 SG 和 PB中[43]。以上這些發(fā)現(xiàn)提示 SG 募集 mRNA 不是依靠序列特異性，而更可能是依據(jù)與該 mRNA 有關(guān)的蛋白組分。

PB的特征在于其含有參與 mRNA 衰變或沉默的蛋白質(zhì)。典型的 mRNA 衰變開始于蛋白質(zhì)脫帽復(fù)合物從 mRNA 的 5' 端去除帽，該復(fù)合物包含幾種定位于PB的蛋白質(zhì)，即 mRNA 脫帽酶亞基 1A或 2(分別為 DCP1A 或 DCP2)、增強(qiáng)子mRNA 脫殼蛋白(EDC4，也稱為 Hedls)和DDX6。最近的研究認(rèn)為，mRNAs 被招募到PB中取決于其翻譯程度，在PB中的mRNA 可以響應(yīng)細(xì)胞環(huán)境變化重新進(jìn)入翻譯階段[32,44]。而且，檢測(cè) mRNA 衰變中間體的單分子研究表明，衰變發(fā)生在整個(gè)細(xì)胞，而不只是在PB中[45-46]。其次，對(duì)酵母脫帽突變體的研究表明，mRNA 衰變甚至可能在PB內(nèi)受到抑制[47]。最后，在體外重建 LLPS 系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫帽酶 DCP2的活性顯著降低，一般認(rèn)為在凝聚的液滴環(huán)境中酶的活性會(huì)受到抑制，但是這種現(xiàn)象的具體機(jī)制還不清楚[48]。以上這些結(jié)果說(shuō)明 PB 形成是mRNA衰變的結(jié)果，而不是 mRNA 衰變的介質(zhì)[31]。 因此，在細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境刺激時(shí)，PB可以儲(chǔ)存翻譯停滯的 mRNA，來(lái)幫助細(xì)胞優(yōu)先考慮某些蛋白的翻譯或衰減。

2.2.2 信號(hào)傳導(dǎo) 除了作為 mRNA 分選中心外，SG還構(gòu)成了以 RNA 為中心的信號(hào)樞紐[49]。許多信號(hào)蛋白被招募到 SG，但這個(gè)過(guò)程是短暫的，只持續(xù)到細(xì)胞適應(yīng)壓力而存活或不適應(yīng)壓力而死亡。作為信號(hào)中心，SG傳達(dá)一種“緊急狀態(tài)”，它們短暫存在，通過(guò)攔截和隔離信號(hào)成分來(lái)改變多個(gè)信號(hào)通路。在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中，多價(jià)信號(hào)蛋白的濃度依賴性聚集促進(jìn)了它們從可溶性到不混溶液態(tài)的分層相變[9]。因此，液相 RNA 顆粒中信號(hào)蛋白的隔離可以整合多個(gè)應(yīng)激信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)協(xié)調(diào)細(xì)胞對(duì)壓力的反應(yīng)。

被招募到 SG 的信號(hào)蛋白和酶種類繁多，包括接頭/支架蛋白、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)激酶、磷酸酶、核糖核酸酶、解旋酶、核糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、GTP 酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和泛素修飾酶等[49]。SG 通過(guò)隔離促凋亡因子如活化蛋白 C 激酶 1的受體(Receptor of activated protein C kinase 1，RACK1) 來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[50]。同樣，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SG通過(guò)招募 RNA 解旋酶 DDX3X 來(lái)抑制細(xì)胞焦亡，這是一種與炎癥相關(guān)的細(xì)胞死亡形式[51]。真核細(xì)胞中高度保守的 TORC1 蛋白激酶復(fù)合物，控制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝[52]。在最佳生長(zhǎng)條件下，來(lái)自生長(zhǎng)因子受體和環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的信號(hào)使 TORC1 在液泡或溶酶體膜上發(fā)揮活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并抑制自噬。氨基酸剝奪使 TORC1 失活后從溶酶體膜中釋放出來(lái)[53]。失活的 TORC1 在應(yīng)激誘導(dǎo)下聚集在 SG 中，酵母和人類細(xì)胞中的 SG 通過(guò)隔離 TORC1 和下游激酶來(lái)改變 TORC1 信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響應(yīng)激過(guò)程[54-55]。在從壓力中恢復(fù)期間，TORC1 隨著分解的SG 被釋放出來(lái)，又重新被激活。

許多信號(hào)分子也被發(fā)現(xiàn)與 PB 相關(guān)，包括對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)很重要的幾種蛋白激酶和磷酸酶[56]。除了可能跟 SG 類似，將一些信號(hào)通路上的關(guān)鍵分子隔離，從而抑制信號(hào)傳導(dǎo)外，還可以通過(guò)保護(hù)信號(hào)分子免受蛋白降解的途徑來(lái)穩(wěn)定信號(hào)分子。PB 通常是由對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響的外界刺激引起的。因此，未能與 PB 結(jié)合可能導(dǎo)致相關(guān)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和/或更新。釀酒酵母 Hrr25，是哺乳動(dòng)物 CK1 的 δ/ε 同種型的酵母直系同源物[57]。這種蛋白激酶在核糖體成熟、囊泡運(yùn)輸、DNA 修復(fù)、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和減數(shù)分裂中具有保守作用[58-62]。 Hrr25 的激酶活性是其定位到 PB 所必需的，未能定位到 PB 會(huì)導(dǎo)致 Hrr25 以蛋白酶體依賴的方式降解[63]。在減數(shù)分裂早期，Hrr25與 PB 的結(jié)合能夠確保在隨后的2次減數(shù)分裂中使細(xì)胞存在臨界水平的 Hrr25[64]。與 PB 的結(jié)合不僅可以保護(hù)Hrr25 免受降解，還可能影響 Hrr25 底物的磷酸化，從而對(duì)細(xì)胞生理學(xué)產(chǎn)生重大影響。

2.2.3 抗病毒應(yīng)激反應(yīng) SG 的形成在抗病毒防御和恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。SG 在功能層面上具有潛在的抗病毒作用，因?yàn)?SG 隔離和結(jié)合對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要的細(xì)胞成分。例如，SG 通過(guò)結(jié)合與負(fù)鏈 RNA 互補(bǔ)的 3' 莖環(huán)來(lái)隔離 TIA-1 和 TIAR，這是病毒 RNA 復(fù)制所必需的[65]。任何病毒的有效復(fù)制都需要翻譯起始因子，因此 40S 亞基、 eIF4G、eIF4A、eIF4B 和 eIF3 的隔離會(huì)對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，刺激小RNA病毒翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome entry site，IRES)的反式激活因子(如PTB、PCBP2和UNR)也被發(fā)現(xiàn)隔離在 SG 中[66]。PKR 在病毒誘導(dǎo)的 SG 形成中至關(guān)重要，其通過(guò) eIF2α 磷酸化抑制病毒復(fù)制，并促進(jìn)I型干擾素 (Interferon，IFN) 產(chǎn)生[67-68]。IFN 的誘導(dǎo)代表了抵御病原體的第1道防線，并且多個(gè) IFN 信號(hào)分子也被招募到 SG 中，來(lái)調(diào)節(jié)它們的活性。因此，SG 的形成也是對(duì)病毒感染的先天免疫反應(yīng)。

一些病毒在感染早期誘導(dǎo)SG 的形成，但在后期通過(guò)阻斷 eIF2α 的磷酸化或切割 SG 支架蛋白如G3BP1 來(lái)抑制 SG 的形成；而另一些病毒則通過(guò)將SG 蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫皖w粒以促進(jìn)病毒復(fù)制，例如HCV、RSV、輪狀病毒、哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(Mammalian orthoreovirus，MRV) 和小鼠肝炎冠狀病毒 (Mouse hepatitis virus，MHV)[67,69-76]。SG 的形成在病毒復(fù)制周期的不同階段或通過(guò)不同的信號(hào)通路被誘導(dǎo)或抑制，表明感染期間SG 與病毒在互相博弈。

P B組分還包括RISCs、miRNA相關(guān)的Argonaute (Ago) 蛋白、以及為 RISCs 發(fā)揮功能提供支架活性的 GW182 蛋白[77]。而且，在病毒感染期間，人們發(fā)現(xiàn)干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISG)也可以定位于 PB[78]。HIV-1 mRNA 與RISC 蛋白相互作用使病毒 mRNA 在 PB 上積聚，并且在破壞 PB 結(jié)構(gòu)的情況下，可觀察到病毒的產(chǎn)量增多、感染性增強(qiáng)，這表明 PB 具有抗病毒感染的能力[79]。而某些研究發(fā)現(xiàn)，病毒也會(huì)反過(guò)來(lái)抑制 PB的形成。脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)是一種正鏈 RNA 病毒，病毒蛋白酶3C會(huì)降解 PB 的幾種成分，包括 Xrn1 和 DCP1A，但不影響其他成分，如GW182、Edc3 和 Edc4，在感染4h后細(xì)胞中的 PB被破壞[80]。輪狀病毒則是通過(guò)使用病毒 RNA 作為RNA 結(jié)合蛋白的海綿來(lái)分解 PB， 使 PB 中的Ago2、GW182 和 DCP1重新定位[81]。不僅如此，輪狀病毒的 NSP1 蛋白可以降解 PB的成分 Pan3，同時(shí)重新定位其他2種成分(Xrn1 和 DCP1A)[82]。還有研究指出輪狀病毒會(huì)干擾正常的 SG 和 PB 組裝，但會(huì)選擇性排除一些成分來(lái)促進(jìn)非典型 SG-PB結(jié)構(gòu)的形成，并似乎與病毒質(zhì)(Viroplasm，VM)共同構(gòu)成更復(fù)雜的超分子結(jié)構(gòu)以促進(jìn)病毒生長(zhǎng)[83]。

3 核仁與卡哈爾體

3.1 功能特點(diǎn)

核仁的主要功能是快速產(chǎn)生大、小核糖體亞基，這個(gè)過(guò)程受到嚴(yán)格的調(diào)控以維持正常的細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)。 核仁內(nèi)發(fā)生的3個(gè)主要事件，包括prerRNA 轉(zhuǎn)錄、加工和核糖體 RNP 組裝[84]。RNA 聚合酶 I負(fù)責(zé)rDNA 基因轉(zhuǎn)錄生成的47S 前核糖體RNA 轉(zhuǎn)錄物 (pre-rRNA) 的合成。pre-rRNA 由小核仁核糖核蛋白(snoRNP)加工和修飾，以生成 28S、18S 和 5.8S rRNA，它們與核糖體蛋白 (Ribosomal protein，RP) 組裝形成大、小核糖體亞基的前體，再分別輸出到細(xì)胞質(zhì)并經(jīng)過(guò)最后的加工步驟生成成熟的 40S 和 60S 核糖體亞基。上述核糖體生成過(guò)程中所涉及的分子，都集中在3個(gè)不同的亞核仁區(qū)室中，稱為原纖維中心 (Fibrillar center，F(xiàn)C)、致密原纖維成分 (Dense fibrillar component，DFC) 和顆粒成分 (Granular component，GC)。人們普遍認(rèn)為，prerRNA 是在 FC 或 FC 和 DFC 之間的邊界從 rDNA轉(zhuǎn)錄的。 FC 富含 RNA Pol I 機(jī)制的成分，如 UBF，而 DFC 含有 pre-rRNA 加工因子，如 snoRNA、snoRNP 蛋白、原纖維蛋白和 Nop58。 FC 和 DFC被 GC 包圍進(jìn)行前核糖體亞基組裝。核仁是通過(guò)LLPS形成的，具有液滴狀的移動(dòng)特征[85]。由于沒有脂質(zhì)膜的限制，核仁成分在核仁和核質(zhì)間以及核仁內(nèi)高速移動(dòng)。

卡哈爾體(Cajal body，CB)是 Cajal 在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的核結(jié)構(gòu)[86]，集中了許多分子成分，包括前 mRNA、前 rRNA 加工所需的線圈蛋白、存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 (Survival motor neuron，SMN) 蛋白、核仁蛋白原纖維蛋白、小核 (snRNPs) 和核仁核糖核蛋白 (snoRNPs)[87]。CB的主要結(jié)構(gòu)成分是p80-coilin 蛋白，通常用作特征標(biāo)記。CB 在物理和功能水平上都與核仁密切相關(guān)。CB 最初被稱為“核仁附屬體”，因其與神經(jīng)元中的核仁密切相關(guān)。此外，CB 參與 snoRNPs 的成熟過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)，核仁和CB都參與了與細(xì)胞生長(zhǎng)緊密相連的非多聚 (A) 尾 RNA 的產(chǎn)生，包括組蛋白 mRNA、CB中的 snRNA 和 snoRNA、以及核仁中的 rRNA?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)都表明 CB 和核仁存在密切聯(lián)系。

3.2 壓力影響下的結(jié)構(gòu)功能變化

各種刺激會(huì)破壞或重塑核仁組織，導(dǎo)致核仁功能受損，包括pre-rRNA 轉(zhuǎn)錄和加工。DNA 損傷會(huì)引起核仁分離[88]。病毒感染還可引起核仁形態(tài)大小的特定變化[89-90]?？焖僭鲋车膭?dòng)物細(xì)胞需要 rDNA基因的高轉(zhuǎn)錄率和3種 RNA 聚合酶的活性，以滿足細(xì)胞對(duì)核糖體的需求。在影響細(xì)胞周期進(jìn)程/細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的刺激條件下，核糖體亞基生物合成的改變是一種可以保持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的策略。調(diào)節(jié)核糖體合成以響應(yīng)細(xì)胞外條件的關(guān)鍵參與者是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)，它通過(guò)調(diào)節(jié) TIF-1A、SL1 和UBF 的定位和活性來(lái)促進(jìn)pre-rRNA 合成，以及RPs 的翻譯[91]。而1 型單純皰疹病毒 (HSV-1)感染則會(huì)影響 rRNA 加工，與pre-rRNA 合成無(wú)關(guān)[92]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，核仁可以作為壓力感應(yīng)細(xì)胞器來(lái)選擇性地激活轉(zhuǎn)錄因子 p53。核仁改變會(huì)導(dǎo)致核仁成分從核仁快速重新分布到核質(zhì)，反之亦然。這種重新分布的蛋白質(zhì)對(duì)抑制 MDM2(也稱為HDM2，E3 泛素連接酶，用于在穩(wěn)態(tài)下降解 p53) 起著至關(guān)重要的作用，而這一個(gè)過(guò)程有助于p53 的穩(wěn)定。NPM1(也稱為核磷蛋白或 B23)從核仁到核質(zhì)的易位是核仁應(yīng)激的標(biāo)志之一，NPM1 通過(guò)與MDM2互作直接抑制 MDM2。研究表明，核仁中的氧化是各種應(yīng)激條件下的常見現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致 NPM1的 S-谷胱甘肽化，而這是 NPM1 易位所必需的[93]。此外，有報(bào)道稱由核仁的重要組分RPL5 (uL18)、RPL11 (uL5) 和 5S rRNA 組成的 5S RNP 復(fù)合物直接與 MDM2 結(jié)合以在壓力下穩(wěn)定 p53[94-96]。

在一些刺激情況下(熱應(yīng)激、DNA 損傷、生理性酸中毒和蛋白酶體抑制)，核質(zhì)和細(xì)胞溶質(zhì)蛋白會(huì)被隔離到核仁中[97]。這些被限制在核仁的蛋白質(zhì)包括參與應(yīng)激反應(yīng)、DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程和蛋白質(zhì)折疊的酶。例如，E3 泛素連接酶的隔離可防止其底物降解。許多核仁靶向蛋白含有攜帶正電荷的核仁定位信號(hào)，這對(duì)攜帶負(fù)電荷的核仁 RNA 或幾種核仁中樞蛋白的相互作用很重要[98-99]。 未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和 HSP(例如 HSP70) 在某些刺激條件下進(jìn)入核仁[100-101]。未折疊蛋白質(zhì)被限制在核仁中，流動(dòng)性減慢，便于在恢復(fù)期間被HSP 伴侶重新折疊或降解。然而長(zhǎng)時(shí)間的壓力會(huì)導(dǎo)致核仁區(qū)室的液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?，引發(fā)不可逆的淀粉樣蛋白生成和核蛋白穩(wěn)態(tài)的失調(diào)。

卡哈爾體的結(jié)構(gòu)也會(huì)因不同類型的刺激而改變，例如UV照射、熱應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄抑制、滲透壓力、饑餓和病毒感染。營(yíng)養(yǎng)剝奪導(dǎo)致卡哈爾體數(shù)量減少[102]，而 UV照射可逆地破壞卡哈爾體，線圈蛋白會(huì)重新分布[103]。在 HSV-1 感染的細(xì)胞中，ICP0(病毒蛋白感染的細(xì)胞蛋白 0)的表達(dá)誘導(dǎo)著絲粒的不穩(wěn)定以及隨后線圈蛋白、SMN 和原纖維蛋白向受損著絲粒的重新分布[104]。而腺病毒誘導(dǎo)線圈蛋白和其他卡哈爾體成分向病毒復(fù)制中心外圍募集，參與晚期病毒轉(zhuǎn)錄物的加工[105]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)的功能障礙導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體的積累，從而引起毒性反應(yīng)。在用硼替佐米(蛋白酶體抑制劑)處理后，作為對(duì)蛋白毒性應(yīng)激的補(bǔ)償反應(yīng)，神經(jīng)元中核仁的數(shù)量和大小，以及CB的數(shù)量都有所增加，這2種細(xì)胞器產(chǎn)生 snRNA、snoRNA 和 rRNA的協(xié)調(diào)活性可能有助于蛋白酶體抑制后的神經(jīng)元存活[106]。

4 無(wú)膜細(xì)胞器與疾病的關(guān)系

因高流動(dòng)性的物理特性，無(wú)膜細(xì)胞器具有快速適應(yīng)細(xì)胞外部環(huán)境變化的能力，其中 SG 和 PB 在壓力期間參與翻譯調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)，抗病毒感染等過(guò)程。因此，這些顆粒的功能異常似乎會(huì)影響細(xì)胞正常生理活動(dòng)從而導(dǎo)致疾病。目前，SG與疾病的關(guān)系已有不少研究報(bào)道，通常認(rèn)為SG會(huì)促進(jìn)疾病進(jìn)展，或者它們的異常形成與疾病有關(guān)。

4.1 SG與腫瘤的關(guān)系

在面對(duì)缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、活性氧和高滲透壓等諸多不利條件時(shí)，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)促進(jìn)SG的生成，選擇性地進(jìn)行 mRNA 翻譯，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑、代謝和應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)自身存活[107]。例如，在肝癌細(xì)胞中，PI3K 和 MAPK/p38信號(hào)通路被激活后，mTOR活化導(dǎo)致下游效應(yīng)激酶S6K1磷酸化eIF2α從而促進(jìn)SG的形成，并且另一亞型S6K2參與SG的維持，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)展[108-109]。癌癥治療中常用的化療藥物，如硼替佐米、順鉑或依托泊苷，可能會(huì)刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生依賴于 eIF2α 磷酸化的 SG，從而抵抗藥物的作用[110-111]?？勾x藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)廣泛用于治療實(shí)體瘤，但腫瘤通常在治療后期對(duì) 5-Fu 產(chǎn)生耐藥性。有研究指出在5-Fu 誘導(dǎo)癌細(xì)胞 SG產(chǎn)生的過(guò)程中，RACK1被限制在SG中，抑制 MTK1-SAPK 及下游腫瘤凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致 5-Fu 的作用減弱[112]。對(duì)人肉瘤細(xì)胞SG的研究表明，G3BP1與Y-box結(jié)合蛋白(YB-1)相互作用，共同促進(jìn)SG的產(chǎn)生；同時(shí)，G3BP1 和YB-1 的表達(dá)增強(qiáng)提示腫瘤患者的預(yù)后較差[113]。因此，SG或許有希望成為一種新型的癌癥治療靶點(diǎn)，可能通過(guò)抑制SG的形成來(lái)降低腫瘤的發(fā)生率、提高抗腫瘤藥物的療效、降低癌癥患者的死亡率。

4.2 SG與心血管疾病的關(guān)系

一項(xiàng)臨床研究表明，在先天性擴(kuò)張型心肌病患者的重編程心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了人類 RNA 結(jié)合基序蛋白 20 (RNA-binding motif protein 20，RBM20) 致病性的R636S等位基因突變，并且含有RBM20 變體的 mRNP 顆粒在患者心肌細(xì)胞的肌漿中異常積聚，表現(xiàn)出液體狀特性，促進(jìn)心臟生物大分子相分離并與SG融合[114]。這種慢性病可能引起細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯異常、RBP失調(diào)和SG的持續(xù)存在，從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展。

4.3 SG與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系

伴隨著腦老化、缺血、腦外傷等繼發(fā)性神經(jīng)炎癥等因素引起的慢性腦病，老年人的神經(jīng)系統(tǒng)易發(fā)生慢性應(yīng)激，而慢性應(yīng)激的發(fā)生又與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。腦衰老、腦缺血、腦損傷和神經(jīng)炎癥，可能會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元中 SG 的產(chǎn)生。體外研究結(jié)果表明，在病理?xiàng)l件下，SG從液體轉(zhuǎn)變?yōu)轲ば?固體淀粉樣蛋白并引起 tau 沉積，從而促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病[115]。當(dāng)危機(jī)消除時(shí)，SG 也通過(guò)自噬被消除并恢復(fù)正常的翻譯過(guò)程。然而，在持續(xù)的刺激下，C9orf72突變導(dǎo)致 SG 自噬途徑被阻斷，并促進(jìn)TDP-43 在細(xì)胞質(zhì)的積累，導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和額顳葉癡呆(Frontotemporal dementia，F(xiàn)TD)[116-117]。此外，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 5 在 R218 處對(duì) FUS 精氨酸的甲基化是維持 SG 清除機(jī)制的先決條件。在急性應(yīng)激期間，DJ-1(蛋白質(zhì)/核酸脫糖酶) 能夠與 SG 結(jié)合，共同調(diào)節(jié) RNA 代謝和分流，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[118]。然而，在慢性應(yīng)激條件下，DJ-1 突變促進(jìn)了SG 轉(zhuǎn)化為病理性 SG，促進(jìn)了帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)生。

5 總結(jié)與展望

細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜細(xì)胞器可能會(huì)誘導(dǎo)一些適應(yīng)性和可逆反應(yīng)，這些反應(yīng)對(duì)細(xì)胞外環(huán)境的變化非常敏感，包括轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程的改變。此外，無(wú)膜細(xì)胞器通過(guò)隔離分子和提高生物分子局部濃度來(lái)控制內(nèi)源性細(xì)胞活動(dòng)，從而影響多種生物過(guò)程，例如酶促反應(yīng)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞面臨外界刺激時(shí)，適應(yīng)環(huán)境維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要。壓力會(huì)導(dǎo)致翻譯的全局抑制，從而觸發(fā) SG和 PB 的形成，它們是 RNA和蛋白質(zhì)的瞬時(shí)細(xì)胞質(zhì)無(wú)膜區(qū)室，沒有膜結(jié)構(gòu)限制和相分離的形成特點(diǎn)賦予了其快速響應(yīng)環(huán)境壓力而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的能力。值得關(guān)注的是，最近有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的2個(gè)新應(yīng)激顆粒蛋白質(zhì)組分，RBGD2(RNA-binding glycine-rich group D2)和RBGD4通過(guò)酪氨酸陣列(Tyr residue array,TRA)形式誘導(dǎo)蛋白液-液相分離，進(jìn)而增強(qiáng)了擬南芥的耐熱性[119]。由此可見，應(yīng)激顆粒是真核細(xì)胞響應(yīng)各種刺激的一種保守機(jī)制。而核仁和卡哈爾體是細(xì)胞核中重要的無(wú)膜細(xì)胞器，參與協(xié)調(diào)增殖細(xì)胞中的主要 RNA 蛋白組裝和修飾過(guò)程。核仁和卡哈爾體似乎都是由細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)激活的信號(hào)通路的主要目標(biāo)，這2個(gè)細(xì)胞器的組織、大小和蛋白質(zhì)含量在刺激下發(fā)生一系列復(fù)雜的變化。但關(guān)于無(wú)膜細(xì)胞器在應(yīng)激反應(yīng)中的功能和作用仍然存在許多懸而未決的問(wèn)題。破譯無(wú)膜細(xì)胞器的存在如何改變細(xì)胞乃至個(gè)體的生物學(xué)過(guò)程，可能會(huì)進(jìn)一步闡明這些RNA 顆粒的特性，以及它們?cè)诩?xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用。因此，揭示蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)和刺激下關(guān)鍵成核蛋白的翻譯后修飾變化可能是未來(lái)研究方向的重點(diǎn)。而針對(duì)這些無(wú)膜細(xì)胞器的生理功能研究有可能為相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和防治提供新的見解。