洪 梅，王旭陽(yáng)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝 (生物轉(zhuǎn)化) 和排泄 (Adsorption, distribution, metabolism, excretion,ADME) 過(guò)程，除了與傳統(tǒng)的I相和II相代謝酶相關(guān)外，也取決于被看作是0相和III相的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[1]。近年來(lái)，藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)運(yùn)體(蛋白)對(duì)各類藥物，尤其是口服藥物的影響越來(lái)越受到人們的重視。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是決定細(xì)胞內(nèi)藥物積累的關(guān)鍵因素，其活性往往與藥物的治療效果、毒性及藥物-藥物相互作用 (Drug-drug interaction) 直接相關(guān)。在新藥設(shè)計(jì)和對(duì)個(gè)體間不同藥物反應(yīng)的分析預(yù)測(cè)中，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體往往也被認(rèn)為是一個(gè)新的靶標(biāo)[2]。轉(zhuǎn)運(yùn)體在藥物ADME過(guò)程中具有重要作用，其轉(zhuǎn)運(yùn)功能必然受到多個(gè)層次的調(diào)控。轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控主要分為長(zhǎng)時(shí) (Long-term) 和短時(shí) (Short-term) 調(diào)控。長(zhǎng)時(shí)調(diào)控主要為轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的調(diào)控，通過(guò)改變基因表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)，由于涉及到基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程，往往需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)的時(shí)間；短時(shí)調(diào)控則主要指翻譯后調(diào)控過(guò)程，由于是對(duì)已有的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，所以只需要較短的時(shí)間，幾分鐘到一兩個(gè)小時(shí)就能實(shí)現(xiàn)。在對(duì)藥物、食物的攝取過(guò)程中，人體往往通過(guò)短時(shí)調(diào)控以實(shí)現(xiàn)對(duì)這些變化的快速應(yīng)對(duì)[3]。

近年來(lái)冷凍電鏡等物理技術(shù)快速發(fā)展，已有一些膜蛋白的高分辨晶體結(jié)構(gòu)獲得了解析，但膜蛋白表面結(jié)構(gòu)的兩親性、在組織中的低濃度以及它們固有的構(gòu)象靈活性使得難以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)運(yùn)體晶體[4]，因此相對(duì)于可溶性蛋白，膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的解析仍進(jìn)展較為緩慢。且蛋白序列中所具有的影響其空間構(gòu)象折疊、在不同細(xì)胞器中的處理修飾及調(diào)控蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的特殊基序，往往無(wú)法通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的分析，因此目前仍有大量研究利用傳統(tǒng)的生化手段揭示這類膜蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)包括翻譯后處置的識(shí)別基序、翻譯后修飾位點(diǎn)、用于組裝和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域以及跨膜結(jié)構(gòu)域等。這些重要位點(diǎn)的變化可能會(huì)改變轉(zhuǎn)運(yùn)體的穩(wěn)定性、與底物的相互作用以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。

本文總結(jié)了目前與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后加工和修飾相關(guān)的研究成果，其中對(duì)在這些調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)運(yùn)體基序和位點(diǎn)進(jìn)行了重點(diǎn)闡述，為系統(tǒng)深入地解析轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制、闡明遺傳多態(tài)性造成的個(gè)體藥物響應(yīng)差異提供一定的參考。

1 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體及基本結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制的不同，人體中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體分為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體，前者主要為ATP結(jié)合盒 (ATP-binding cassette，ABC) 超家族成員，后者則屬于溶質(zhì)載體 (Solute carrier, SLC) 超家族。

1.1 ABC超家族

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類ATP驅(qū)動(dòng)泵, 廣泛分布于細(xì)菌到人類的各種生物體中，在人體肝臟、小腸和腎等器官的質(zhì)膜中分布豐富，能將天然毒物和代謝廢物排出體外。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物包括內(nèi)源性的脂質(zhì)、膽汁酸以及異源性的物質(zhì)如毒素和多種藥物[5]。典型的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體序列中包含3個(gè)基序：Walker A、Walker B序列以及ABC特征序列 (即C基序，“LSGGQ”)[6]。1個(gè)完整的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體由2個(gè)核苷酸結(jié)合域 (Nucleotide binding domain,NBD) 和2個(gè)跨膜域 (Transmembrane domain,T M D) 組成。每個(gè)T M D包含6個(gè)跨膜螺旋(Transmembrane helix, TM)，主要參與底物識(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)；而NBD則負(fù)責(zé)ATP的結(jié)合和水解，從而促進(jìn)底物的運(yùn)輸[7]。不同ABC 蛋白間的整體序列相似性低，尤其是在TMD中，這與跨膜螺旋參與轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)不同物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的概念相符合；另一方面，NBD在結(jié)構(gòu)上則比較保守[8]。藥物通過(guò)TMD的轉(zhuǎn)運(yùn)和在NBD上發(fā)生的ATP水解必須協(xié)同工作才能實(shí)現(xiàn)底物的外排，因此域間通信對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)體正常功能的發(fā)揮至關(guān)重要[9]。

外排藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括ABCB亞家族的ABCB1，也稱為P-糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp)；ABCC亞家族的ABCC1，也稱為多藥耐藥相關(guān)蛋白1(Multidrug resistance protein 1，MRP1)；ABCG亞家族的ABCG2, 也稱為乳腺癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein，BCRP)。它們?cè)诙喾N器官組織中都有表達(dá)，如P-gp在血腦屏障(Blood-brain barrier) 中表達(dá)，是阻止藥物穿越血腦屏障的重要因素。此外，許多腫瘤細(xì)胞在藥物壓力下會(huì)過(guò)表達(dá)這些外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，是造成抗腫瘤藥物多藥耐藥的關(guān)鍵原因[5]。

1.1.1 P-糖蛋白 (P-gp/ABCB1) P-糖蛋白最顯著的特征之一是它可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)百種結(jié)構(gòu)和功能多樣的底物[10]，其底物主要是具有不同相對(duì)分子質(zhì)量的疏水性和兩親性化合物，含有不同的化學(xué)基團(tuán) (如芳香環(huán)、甲氧基、酰胺鍵等)，以及具有不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) (如有機(jī)分子、線性和環(huán)狀肽、共軛結(jié)構(gòu)等)的化合物。近年的晶體結(jié)構(gòu)解析獲得了小鼠Pgp的精細(xì)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)顯示該蛋白具有2個(gè)向膜內(nèi)葉開(kāi)放的入口，由一側(cè)的TM3和4以及另一側(cè)的TM9和10所構(gòu)成[11-12]。P-gp 的顯著特征之一是藥物的結(jié)合口袋中沒(méi)有攜帶正電荷或負(fù)電荷的氨基酸殘基。因此，底物和蛋白質(zhì)殘基之間的相互作用主要是氫鍵、范德華力和疏水相互作用[10]。在所有P-gp的跨膜螺旋中都具有影響其功能的關(guān)鍵氨基酸殘基，其中大部分是疏水或極性的[13]。

1.1.2 多藥耐藥相關(guān)蛋白1 (MRP1/ABCC1) MRP1被認(rèn)為是造成多藥耐藥 (Multidrug resistance,MDR) 的第2個(gè)主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7]。 除了抗癌藥物阿霉素、長(zhǎng)春新堿和甲氨蝶呤，MRP1還轉(zhuǎn)運(yùn)多種谷胱甘肽、葡糖苷酸和硫酸鹽共軛有機(jī)陰離子，如白三烯 C4 (Leukotriene C4, LTC4)、17-β-(D-葡糖苷酸) (Estradiol-17-β-glucuronide, E217βG) 和硫酸雌酮 (Estrone sulfate)等。除了2個(gè)NBD和2個(gè)TMD組成的典型核心結(jié)構(gòu)外，MRP1還包含由5個(gè)跨膜螺旋所組成的TMD0區(qū)域，該區(qū)域前面是1個(gè)位于胞外的氨基末端，其羧基端則通過(guò)1個(gè)L0 接頭序列與TMD1連接[7]，因此MRP1具有17個(gè)跨膜螺旋。

定點(diǎn)突變后進(jìn)行的轉(zhuǎn)運(yùn)能力檢測(cè)揭示，MRP1的所有跨膜螺旋中均含有行使正常功能所必需的氨基酸殘基，特別是在TM4、6、7、8、10、11、14、16和17中[13]。與P-gp不同的是，許多影響MRP1底物結(jié)合、底物特異性和選擇性的關(guān)鍵殘基是攜帶電荷的氨基酸。因?yàn)镸RP1主要是1個(gè)陰離子泵，因此攜帶正電荷的氨基酸如精氨酸、組氨酸和賴氨酸都可能在底物結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用[7]。

1.1.3 乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2) BCRP是先天性和獲得性多藥耐藥的一個(gè)重要分子，對(duì)于調(diào)節(jié)藥物生物利用度、造血和實(shí)體惡性腫瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)以及癌癥干細(xì)胞的保護(hù)均有作用[14]。BCRP分子中只有1個(gè)NBD和1個(gè)含有6個(gè)跨膜螺旋的TMD，因此被認(rèn)為是1個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，往往需要形成二聚體或更高階的寡聚體才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能[14]。與P-gp和MRP1類似，BCRP的所有6個(gè)跨膜螺旋中都含有影響其正常功能的關(guān)鍵氨基酸殘基。ABCG2基因編碼區(qū)中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)自然變異的單核苷酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphism, SNP)，如跨膜螺旋中的關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生了突變，就有可能造成BCRP功能的改變，造成生理和藥理學(xué)后果[13]。

1.2 SLC超家族

溶質(zhì)載體 (Solute carrier, SLC) 超家族是人類細(xì)胞膜上最重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體家族之一，它參與了細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸、能量傳遞、營(yíng)養(yǎng)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理活動(dòng)。SLC超家族包括52個(gè)亞家族，共有400多名成員。研究表明，人類基因突變所致的SLC蛋白表達(dá)異?；蚬δ苋毕菖c糖尿病、高血壓、抑郁癥等多種重大疾病密切相關(guān)[15]。SLC 超家族成員廣泛存在于原核和真核生物中，其成員的功能多樣，轉(zhuǎn)運(yùn)底物包括糖類、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽離子、維生素、神經(jīng)遞質(zhì)、多肽及多肽類藥物等眾多離子和小分子物質(zhì)[13]。

攝取型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(SLCO) (也稱為Organic anion transporting polypeptide, OATP)亞家族中的OATP1A2、1B1、1B3以及2B1，SLC22 (也稱為Organic anion transporter/Organic cation transporter, OAT/OCT) 亞家族中的OAT1、3、4以及OCT1和2，SLC15 (也稱為Peptide transporter, PepT) 亞家族中的PepT1和2等。此外，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，SLC47(Multidrug and toxin extrusion, MATE) 家族的成員在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，但SLC47家族成員主要發(fā)揮外排功能。

1.2.1 SLCO (OATP) 以Na+和ATP非依賴性的方式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)各類結(jié)構(gòu)多樣的內(nèi)源和外源物質(zhì)，其底物包括膽酸鹽、類固醇以及類固醇結(jié)合物、甲狀腺激素等內(nèi)源性物質(zhì)，微囊藻毒素等毒素和異源性物質(zhì)，其中的家族成員OATP1A2、1B1、1B3和2B1對(duì)多種重要的臨床藥物如他汀類降脂藥物、治療高血壓病和充血性心衰的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、強(qiáng)心苷類藥物、抗腫瘤藥物、抗生素藥物等具有轉(zhuǎn)運(yùn)能力，因此被認(rèn)為是重要的藥物攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體[16]。OATP功能的缺失，會(huì)造成人體藥物排除或解毒障礙，從而造成藥物誘導(dǎo)的肝或腎衰竭。OATP家族成員在多種上皮屏障中表達(dá)，包括腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小管細(xì)胞和血腦屏障[17]。計(jì)算機(jī)親水分析模型預(yù)測(cè)OATP家族成員 (含有643～722個(gè)氨基酸) 具有非常相似的跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)造，OATP都含有12個(gè)跨膜螺旋和1個(gè)帶有大量保守半胱氨酸殘基的大胞外環(huán)5。有1個(gè)OATP的家族特征序列 D-X-RW-(I,V)-GAWWX-G-(F,L)-L位于胞外環(huán)3和TM6的邊界處[18]。

對(duì)OATP家族成員OATP1B3和2B1的同源建模指出，這些轉(zhuǎn)運(yùn)體靠近氨基端的TM1、2、4、5和靠近羧基端的TM7、8、10、11構(gòu)成與底物相互作用的通路，而TM3、6、9和12則主要嵌入在膜雙層中[19]。與該模型相一致，生化研究在TM1、2以及TM7、8、10和11中都鑒定到與底物轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基，對(duì)OATP功能的發(fā)揮或底物的選擇起重要作用[13]。

1.2.2 SLC22 (OAT/OCT/OCTN) 由SLC22基因家族編碼的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是另一個(gè)多特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，可介導(dǎo)各種更小、更親水底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，如類固醇激素綴合物、生物胺、各種藥物和毒素[20]。OAT在全身不同組織的細(xì)胞膜上表達(dá)，腎臟的OAT1和OAT3是藥物排泄過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)反膜電位交換β-酮戊二酸對(duì)有機(jī)陰離子進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而該濃度梯度由次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鈉-二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體維持。除了OAT，SLC22家族的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還包含主要轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陽(yáng)離子的有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OCT1和OCT2，以及有機(jī)兩性離子/陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1和OCTN2。OCT的底物包括范圍廣泛的、結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的小分子有機(jī)陽(yáng)離子，例如類固醇、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、多種藥物和其他外源性物質(zhì)。OCT介導(dǎo)有機(jī)陽(yáng)離子沿其電化學(xué)梯度被動(dòng)擴(kuò)散，因此轉(zhuǎn)運(yùn)可能發(fā)生在任一個(gè)方向上[21]。

與OATP家族相似，計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)SLC22家族成員具有12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，其氨基和羧基末端位于細(xì)胞內(nèi)[22]。TM1和2之間有1個(gè)大的細(xì)胞外環(huán)，TM6和7之間有1個(gè)大的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。以大腸埃希菌甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 (GlpT) 的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行人體OAT1同源建模，結(jié)果顯示，TM5、7、8、10和11圍繞在該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的負(fù)電性活性位點(diǎn)的周?chē)?，該活性位點(diǎn)在胞質(zhì)方向開(kāi)放，被TM5的Tyr230和TM10的Lys431、Phe438包圍[23]。生物化學(xué)研究也在TM1、2、5、7、10和12上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與OAT1功能相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基[13]。另一方面，基于大腸埃希菌乳糖滲透酶LacY的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源性建模預(yù)測(cè)，OCT1與底物的相互作用可能是發(fā)生在一個(gè)區(qū)域內(nèi)而非單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中TM4、10和11都存在可能參與底物結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵氨基酸[24]。關(guān)于OCTN的研究則發(fā)現(xiàn)，其中的TM3、4、7、9、10和11可能與其轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)[13]。但OCTN2以Na＋依賴性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿而以Na＋非依賴性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陽(yáng)離子，研究發(fā)現(xiàn)參與這2種轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程所涉及的關(guān)鍵氨基酸殘基有重疊但并非完全相同[25]。

1.2.3 SLC15 (POT/PTR) 質(zhì)子偶聯(lián)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Proton oligopeptide transporter/Peptide transporter,POT/PTR家族或SLC15家族) 負(fù)責(zé)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)8000多種不同的二肽和三肽配體[26]，除了攝取和滯留膳食蛋白質(zhì)的二肽和三肽以促進(jìn)細(xì)胞代謝外，POT/PTR還在識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素、抗病毒藥物和抗腫瘤藥物中扮演著關(guān)鍵角色[27]。POT/PTR家族轉(zhuǎn)運(yùn)體是質(zhì)子驅(qū)動(dòng)的同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，使用內(nèi)向的質(zhì)子電化學(xué)梯度來(lái)驅(qū)動(dòng)肽在細(xì)胞膜上的攝取[28]。

PTR可能包含一個(gè)可容納不同方向的肽的結(jié)合位點(diǎn)，因此具有廣泛的底物轉(zhuǎn)運(yùn)能力。人體中有2個(gè)POT/PTR家族成員：PepT1 (SLC15A1) 和PepT2 (SLC15A2)，表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)特性。PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽的Km值在較低的mmol水平[29]；而 PepT2對(duì)其底物具有更高的親和力，Km值在μmol范圍內(nèi)。通過(guò)定點(diǎn)突變對(duì)PepT1和PepT2 跨膜螺旋進(jìn)行分析，鑒定出TM2、3、4、5、7、8和10均含有與其攝取功能相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基[13]。

1.2.4 SLC47 (MATE) 外源性有毒化合物的排出對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)必不可少。多藥和有毒化合物排出蛋白(Multidrug and toxin extrusion, MATE) 為次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與各種化合物跨細(xì)胞和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)。人體MATE在肝臟和腎臟均有高表達(dá)，主要分布于肝細(xì)胞的頂端及腎近端小管的刷狀緣膜上，參與體內(nèi)陽(yáng)離子藥物清除，其轉(zhuǎn)運(yùn)譜與OCT和OCTN所轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物多有重合[30]。MATE是一種電中性、不依賴Na＋的pH依賴型質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，預(yù)測(cè)含有13個(gè)跨膜螺旋，其羧基端位于胞外。但研究發(fā)現(xiàn)，MATE的功能核心是由12個(gè)跨膜螺旋而非13個(gè)跨膜螺旋組成[31]。對(duì)MATE的TM7螺旋上的氨基酸殘基進(jìn)行突變后進(jìn)行生化分析發(fā)現(xiàn)，突變體與底物結(jié)合能力降低，轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，說(shuō)明該跨膜螺旋是MATE功能發(fā)揮的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[32]。

圖1總結(jié)了上述藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在人體中的分布，這些跨膜蛋白在藥物吸收、代謝和排泄的主要組織器官中表達(dá)，協(xié)同作用影響各類藥物的生物利用度。

圖1 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在人體各組織器官中的分布Fig. 1 Distribution of drug transporters in human tissue and organs

1.3 轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞中的處置過(guò)程

在正常的細(xì)胞生理過(guò)程中，新合成的轉(zhuǎn)運(yùn)體往往需要經(jīng)歷一系列的翻譯后處置過(guò)程才可以正確靶向到其行使功能的質(zhì)膜上。翻譯后修飾在協(xié)調(diào)新合成轉(zhuǎn)運(yùn)體的折疊和靶向上發(fā)揮著重要的作用。發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (Endoplasmic reticulum)和高爾基體中的過(guò)程通常被稱為“中央質(zhì)量控制”，而發(fā)生在質(zhì)膜附近的調(diào)節(jié)機(jī)制則被稱為“外圍質(zhì)量控制”，通過(guò)調(diào)節(jié)質(zhì)膜附近的內(nèi)體循環(huán)和溶酶體降解控制轉(zhuǎn)運(yùn)體的動(dòng)態(tài)平衡。中央和外圍質(zhì)量控制途徑相互關(guān)聯(lián)并協(xié)同工作，在胞內(nèi)傳輸轉(zhuǎn)運(yùn)體-將其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體靶定到質(zhì)膜，或?qū)⑵鋫魉偷礁鞣N細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制 (如內(nèi)體、溶酶體、蛋白酶體、聚集體降解等)。由于受到如此復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控，在轉(zhuǎn)運(yùn)體序列中任何一個(gè)關(guān)鍵序列或位點(diǎn)的錯(cuò)誤都可能導(dǎo)致其錯(cuò)誤的折疊、靶定，滯留在錯(cuò)誤的位點(diǎn)或無(wú)法行使正常的功能。例如，由ABCC7編碼的囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 的錯(cuò)誤折疊和降解是導(dǎo)致囊性纖維化的主因，但由于對(duì)其機(jī)制的了解，目前可采用輔助其折疊及增加其穩(wěn)定性的藥物，如復(fù)方魯馬卡托和依伐卡托，作為相關(guān)患者的治療選擇[33]。

2 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后修飾及相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)

近年來(lái)，研究者們提出了一個(gè)“Proteoforms”的概念，即對(duì)于同一個(gè)蛋白，由于其翻譯后修飾(Post-translational modification) 的不同而產(chǎn)生一系列在功能、構(gòu)象、表達(dá)位點(diǎn)等方面略有不同的蛋白種類，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞中不同微環(huán)境變化的需求[34]。由于翻譯后修飾是對(duì)已有的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，所以只需要較短的時(shí)間就能實(shí)現(xiàn)。在對(duì)藥物的攝取過(guò)程中，人體往往通過(guò)這種短時(shí)調(diào)控的方式快速應(yīng)對(duì)這些變化[3]。

2.1 蛋白激酶調(diào)控及相關(guān)位點(diǎn)

2.1.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體 哺乳動(dòng)物的蛋白磷酸化主要發(fā)生在肽鏈中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基上，這些殘基上具有游離的羥基，且本身不帶電荷，當(dāng)磷酸化作用后，蛋白質(zhì)便具有了電荷，從而使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)活性的變化[34]。研究發(fā)現(xiàn)，P-gp受蛋白激酶C(Protein kinase, PKC)和蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA) 的調(diào)控。其中Ser661、671、667、675、683中的1個(gè)或多個(gè)可能為PKC的磷酸化位點(diǎn)。進(jìn)一步的研究揭示，PKC可直接磷酸化Ser661、667和671，PKA則磷酸化Ser683。但應(yīng)該指出的是，PKC和PKA磷酸化是否顯著影響P-gp的易位和功能仍存在爭(zhēng)議-因?yàn)橥瑫r(shí)突變P-gp的5個(gè)絲氨酸殘基 (Ser661、667、671、675 和 683) 并不影響該蛋白靶向質(zhì)膜或改變轉(zhuǎn)運(yùn)體的多藥耐藥性[35]。MRP1受酪氨酸激酶2(Casein kinase 2, CK2) 調(diào)節(jié)，該激酶是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認(rèn)為是細(xì)胞的“主要調(diào)節(jié)劑”之一，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、死亡和存活的相關(guān)過(guò)程。位于第249位的蘇氨酸是MRP1受CK2調(diào)節(jié)所必需的殘基。用丙氨酸取代Thr249使MRP1無(wú)法發(fā)生磷酸化會(huì)導(dǎo)致該轉(zhuǎn)運(yùn)體功能顯著降低，而將Thr249進(jìn)行磷酸化模擬突變?yōu)楣劝彼釀t導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能增加。Thr249的突變消除了MRP1對(duì)CK2的反應(yīng)，表明CK2是通過(guò)該殘基磷酸化調(diào)控MRP1的[36]。BCRP的功能可能與Pim-1/Pim-1L相關(guān)，當(dāng)位于ATP結(jié)合口袋和跨膜結(jié)構(gòu)域間接頭區(qū)域的Thr362被突變?yōu)楸彼釙r(shí)，會(huì)影響質(zhì)膜上BCRP的表達(dá)和蛋白質(zhì)的二聚化或寡聚化[37]。

2.1.2 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體 研究發(fā)現(xiàn)，OAT家族成員OAT1受到PKC的調(diào)控，PKC的激活可加速OAT1的內(nèi)化，降低其在質(zhì)膜上的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降[38]。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶2(Serum and glucocorticoid inducible kinase 2, SGK2)則被發(fā)現(xiàn)對(duì)OAT1在細(xì)胞膜上的表達(dá)有促進(jìn)作用，過(guò)表達(dá)SGK2可增加OAT1的最大轉(zhuǎn)運(yùn)速度(vmax)而對(duì)其與底物的親和力無(wú)影響[39]。但無(wú)論是PKC還是SGK2似乎都不是通過(guò)直接磷酸化OAT1發(fā)揮作用的。非受體酪氨酸激酶家族Src的成員Yes1可以直接磷酸化OCT2，顯著影響其功能。OCT2轉(zhuǎn)運(yùn)奧沙利鉑會(huì)造成急性感覺(jué)神經(jīng)病變，因此在使用奧沙利鉑時(shí)，聯(lián)合臨床用于腫瘤治療的Yes1抑制劑達(dá)沙替尼，可有效降低奧沙利鉑的副作用。Yes1對(duì)OCT2的作用是直接的，酪氨酸激酶抑制劑可抑制OCT2的磷酸化水平。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)OCT2序列中的Tyr241、362、377均被磷酸化，且對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的苯丙氨酸突變體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析表明，3個(gè)突變體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能均下降，其中Y362F造成的影響最大[40]。OATP家族成員的功能則被發(fā)現(xiàn)受絲氨酸/蘇氨酸激酶的影響，如PKC[41-43]和CK2[44]。雖然有多個(gè)研究嘗試確定PKC在這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列上的直接磷酸化位點(diǎn)，迄今獲得的結(jié)果仍均為陰性[41,43]。2021年的一項(xiàng)關(guān)于臨床酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor, TKI)造成的藥物-藥物相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，多種TKI藥物包括尼洛替尼可顯著抑制OATP1B1的功能，該抑制作用可能與OATP1B1的Tyr645磷酸化有關(guān)，該調(diào)控過(guò)程所涉及的激酶為Src家族的Lyn[45]。PepT1和PepT2分別包含著2個(gè)和1個(gè)與血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶 1 (Serum and glucocorticoid inducible kinase 1,SGK1) 相關(guān)的潛在磷酸化位點(diǎn) (R-X-R-XX-S/T)。當(dāng)PepT2中的Ser185磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，SGK1對(duì)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)被大大抑制[46]。MATE家族成員MATE1上有2個(gè)預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn) (Thr17、299)，而MATE2則可能包含4個(gè)磷酸化位點(diǎn) (Ser544、586, Thr588、594)，但其所涉及的具體機(jī)制并不清楚[47]。最近有研究認(rèn)為CK2可能對(duì)人體MATE1有調(diào)控作用，因?yàn)橐种艭K2可造成MATE1外排功能的下降[48]。

2.2 糖基化及相關(guān)位點(diǎn)

糖基化是新合成蛋白質(zhì)最常見(jiàn)和最多樣化的翻譯后修飾方式。在大多數(shù)情況下，1個(gè)以上的碳水化合物單元被添加到蛋白質(zhì)中，并通過(guò)N型或O型糖苷鍵連接在不同的位置。N-連接和O-連接寡糖鏈的末端糖具有不同的結(jié)構(gòu)。整合膜蛋白和分泌蛋白合成后往往會(huì)進(jìn)行糖基化修飾，N-糖基化在蛋白靶向、折疊、功能修飾，維持蛋白穩(wěn)定性以及為配體提供識(shí)別結(jié)構(gòu)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[49]。

P-gp是高度糖基化的蛋白，在其預(yù)測(cè)的第1個(gè)胞外環(huán)中存在3個(gè)可能發(fā)生N-糖基化的共有氨基酸序列Asn-X-Thr/Ser (Asn91、94和99)，對(duì)這些位點(diǎn)的定點(diǎn)突變使耐藥性克隆的形成效率顯著降低，表明這些位點(diǎn)的糖基化有助于P-gp的正確靶向或穩(wěn)定性的維持[50]。2009年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，如破壞BCRP的N-糖基化，可加快轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降解，但該降解過(guò)程可通過(guò)蛋白酶體抑制劑MG132來(lái)挽救；此外，N596Q的泛素化水平顯著提高，表明如Asn596糖基化受影響，則蛋白的泛素水平增加，進(jìn)而加速蛋白通過(guò)蛋白酶體的降解，同時(shí)也可能影響B(tài)CRP同二聚體的形成[51]。該結(jié)果與之前認(rèn)為BCRP的糖基化不影響其蛋白水平和功能的報(bào)道不一致，有可能是因?yàn)槭褂玫氖遣煌谋磉_(dá)體系。

在OATP1B1細(xì)胞外環(huán)2和5上有3個(gè)糖基化位點(diǎn) (Asn134、503和516)，每個(gè)位點(diǎn)的單獨(dú)突變均對(duì)蛋白的表達(dá)和功能沒(méi)有影響，但當(dāng)3個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，蛋白水平和轉(zhuǎn)運(yùn)功能顯著下降。未糖基化的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，降解速率可能增加[52]。OAT家族所有成員的第1個(gè)胞外環(huán)都含有潛在的N-糖基化位點(diǎn)。將OAT1 (Asn39、56、92和97)[53]和OAT4 (Asn39、56、63和99)[54]中所有的糖基化位點(diǎn)突變后，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白滯留在胞質(zhì)區(qū)室中，進(jìn)而降低它們的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。對(duì)OCTN2中糖基化位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)的3個(gè)糖基化位點(diǎn)(Asn57、64和91) 中任何一個(gè)的突變都會(huì)降低肉堿的轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)所有天冬酰胺殘基同時(shí)被谷氨酰胺取代時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)功能會(huì)完全喪失。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變的蛋白質(zhì)滯留胞質(zhì)；然而，如果僅利用糖基化抑制劑衣霉素處理OCTN2，則不影響該蛋白的成熟和質(zhì)膜的靶向，表明OCTN2的糖基化位點(diǎn)除了與糖基化過(guò)程相關(guān)外，還在底物轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用[55]。

2.3 泛素化及相關(guān)位點(diǎn)

近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明泛素化在控制質(zhì)膜蛋白的傳送和靶向方面發(fā)揮著重要作用。泛素是一種由76個(gè)氨基酸殘基組成的球狀蛋白，在真核生物中高度保守，是泛素化過(guò)程的基本單元，可修飾底物蛋白的賴氨酸殘基發(fā)生單泛素化(Monoubiquitinaion)、多重單泛素化 (Multiple monoubiquitination) 或多泛素化 (Polyubiquitination)。泛素化由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2以及泛素-蛋白質(zhì)連接酶E3這3種酶協(xié)調(diào)介導(dǎo)[56]。通過(guò)泛素修飾受體和通道蛋白，可以影響蛋白的降解、形成質(zhì)膜內(nèi)化和內(nèi)體分選機(jī)制的識(shí)別信號(hào)，從而調(diào)節(jié)膜蛋白的穩(wěn)定性、內(nèi)化、細(xì)胞內(nèi)分選和周轉(zhuǎn)[3]。

糖基化抑制劑衣霉素處理會(huì)顯著降低BCRP的蛋白水平，從而降低其介導(dǎo)的對(duì)抗癌藥物SN-38的耐藥性。當(dāng)用谷氨酰胺代替BCRP位于第596位的糖基化位點(diǎn)Asn596后，非糖基化的N596Q蛋白水平僅為野生型的1/3，該突變體泛素化水平顯著增加，且蛋白酶體抑制劑MG132可顯著增加其蛋白水平，說(shuō)明在BCRP中，糖基化與泛素化可能具有交互作用，糖基化喪失會(huì)導(dǎo)致蛋白不穩(wěn)定，增加泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解[51]。

PKC加快了OAT1從細(xì)胞膜上內(nèi)化的速度但不改變OAT1的重循環(huán)速度，因此造成細(xì)胞膜上OAT1水平的下降以及轉(zhuǎn)運(yùn)功能的降低[38]。OAT1內(nèi)化之前的一個(gè)關(guān)鍵步驟是轉(zhuǎn)運(yùn)體的泛素化。在OAT1 TM6和7之間的大胞內(nèi)環(huán)中鑒定出3個(gè)重要的泛素化位點(diǎn)，分別為L(zhǎng)ys297、303和 315。這些賴氨酸殘基在PKC調(diào)節(jié)的OAT1泛素化中發(fā)揮協(xié)同作用，突變其中任何1個(gè)賴氨酸殘基都會(huì)阻止泛素與其他2個(gè)賴氨酸的結(jié)合[57]。

2.4 寡聚化及相關(guān)位點(diǎn)

從蛋白結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，跨膜的通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體在膜二維空間中的位置及取向使其易于形成多聚體復(fù)合物。大量研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)體，尤其是次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體，往往以寡聚體的形式存在。跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的幾個(gè)保守基序，如GXXXG和七重亮氨酸序列對(duì)于寡聚化是非常關(guān)鍵的。寡聚化在蛋白質(zhì)量控制中發(fā)揮作用，多個(gè)單體的適當(dāng)結(jié)合可能有利于屏蔽內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保留信號(hào)或?qū)⒍鄠€(gè)不同輸出信號(hào)拉近到一起，從而使相應(yīng)的蛋白質(zhì)復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放并靶向細(xì)胞表面[49]。

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白寡聚化的一個(gè)典型例子是BCRP。如前所述，該ABC家族成員是一個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，需要形成同二聚體或更高階的寡聚體 (四聚體、八聚體或十二聚體)來(lái)發(fā)揮其功能。Xu等[58]鑒定了一個(gè)參與BCRP寡聚化的重要結(jié)構(gòu)域TM5-ECL3-TM6，該結(jié)構(gòu)域在HEK293細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，會(huì)像完整蛋白一樣形成寡聚體；此外，該結(jié)構(gòu)域?qū)CRP的轉(zhuǎn)運(yùn)活性表現(xiàn)顯性負(fù)性效應(yīng)，可能因?yàn)槠渑cBCRP形成寡聚體從而影響完整蛋白之間形成功能性的同源寡聚體。對(duì)該區(qū)域的進(jìn)一步研究表明，TM5- ECL3-TM6的每個(gè)片段在BCRP寡聚化和轉(zhuǎn)運(yùn)功能中發(fā)揮著不同的作用；3個(gè)片段都參與寡聚化，但只有TM5對(duì)BCRP的功能是必不可少的[59]。MRP1可形成同源二聚體，其氨基端的281個(gè)氨基酸殘基 (包括MSD0和L0結(jié)構(gòu)域) 被證明參與二聚化并對(duì)MRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能產(chǎn)生顯性負(fù)性影響[60]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)亞基中的TM5和ECL3可以與另一個(gè)亞基中的TM5和ECL3以序列非依賴的方式相互作用，TM5的位置和疏水性以及ECL3的長(zhǎng)度對(duì)MRP1二聚體的形成可能非常關(guān)鍵[61]。

SLC家族成員也能形成同源寡聚體。OAT1在細(xì)胞膜中以寡聚復(fù)合物的形式存在[62]，其TM6參與不同單體的接觸使寡聚化發(fā)生。當(dāng)多聚體狀態(tài)被破壞時(shí)，質(zhì)膜上的OAT1表達(dá)減少[63]。將TM2上可能與寡聚化相關(guān)的GXXXG基序中的G144和G148突變?yōu)楸彼釙?huì)導(dǎo)致突變體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積，無(wú)法靶向質(zhì)膜，并隨后被蛋白酶體降解。蛋白酶體抑制劑MG132雖然可以增加突變體總蛋白水平，但無(wú)法使其正確靶定到細(xì)胞表面[64]。OCT2單體間則通過(guò)共價(jià)二硫鍵以二聚體或更高級(jí)的寡聚形式存在。在TM1和TM2之間大胞外環(huán)上的6個(gè)半胱氨酸殘基對(duì)OCT2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能很重要，而位于質(zhì)膜附近的Cys51和Cys143是影響OCT2寡聚化的重要氨基酸殘基[65]。OATP1B1可形成寡聚體，且該寡聚體的形成可能影響其轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在OATP1B1的TM8螺旋上有一個(gè)保守的GXXXG基序，將其中的G393殘基突變會(huì)使寡聚體的蛋白間結(jié)合能力顯著下降[66]。對(duì)OATP1B1寡聚化的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在其TM3上有一個(gè)非典型的亮氨酸七重復(fù)序列與該轉(zhuǎn)運(yùn)體的寡聚化相關(guān)，將含有該亮氨酸七重復(fù)序列的TM3與完整的OATP1B1蛋白共表達(dá)，會(huì)顯著降低OATP1B1的蛋白表達(dá)水平和功能。該七重復(fù)序列在OATP1家族中高度保守，因此可能也參與了OATP1B1和1B3間寡聚體的形成[67]。

除了轉(zhuǎn)運(yùn)體間形成寡聚體外，這些跨膜蛋白也可能與其他蛋白，如細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生蛋白-蛋白相互作用，調(diào)控它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。許多膜蛋白含有PDZ (Postsynaptic density 95/disclarge/zona occludens) 結(jié)合基序，用于與支架蛋白發(fā)生相互作用。PDZ基序通常由3～8個(gè)氨基酸殘基組成，位于膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)域或羧基末端。支架蛋白可調(diào)節(jié)膜蛋白的亞細(xì)胞靶向、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性以及招募其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合體[68]。MRP2位于極化細(xì)胞的頂端膜，其在肝細(xì)胞中的頂端定位對(duì)于內(nèi)源和外源性化合物的膽汁排泄非常重要。MRP2的羧基端含有共有序列X(S/T)Xφ (其中X可以是任何氨基酸，φ是疏水氨基酸), 是I型PDZ-containing kidney protein 1 (PDZK1) 的結(jié)合位點(diǎn)。將這個(gè)羧基端序列 (第1541—1545位，NSTKF) 均以丙氨酸替換后，所獲得的丙氨酸五突變體喪失了與PDZK1的相互作用，且其在極化細(xì)胞頂端膜的表達(dá)顯著降低[69]。早期的分析發(fā)現(xiàn)，OATP家族成員OATP1A2、OATP2B1、OATP3A1、OATP4A1以及OATP1C1的羧基端均含有I型的PDZ結(jié)合基序。其中OATP1A2與PDZK1、IKEPP (Intestinal and kidney-enriched PDZ protein)、NHERF1 (Na+/H+exchanger regulatory factor 1) 以及NHERF2可能都有相互作用[70]。2018年的一項(xiàng)研究將OATP2B1的羧基端PDZ結(jié)合基序刪除后，也同樣觀察到OATP2B1和PDZK1相互作用減弱、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能降低的現(xiàn)象[71]。SLC22家族的成員 OAT4也與PDZ蛋白有相互作用。將其羧基端最后的3個(gè)氨基酸殘基刪除、或?qū)⑵漪然┒?2位置的Thr548或最后位置上Leu550以丙氨酸替換后，這些突變體都失去了與PDZK1和NHERF1相互作用的能力，并對(duì)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生了影響[72]。OCTN1和OCTN4的末端4個(gè)氨基酸殘基刪除后，也喪失了與PDZK蛋白相互作用的能力[73]。PepT2與PDZK1的互作增加了轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞表面的表達(dá)以及對(duì)Gly-Sar的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。該轉(zhuǎn)運(yùn)體氨基末端的4個(gè)氨基酸殘基同樣與PDZK1的相互作用有關(guān)，將其刪除后，PepT2幾乎完全喪失了與PDZK1的互作能力[46]。此外，這些氨基酸殘基也與PepT2和NHERF2的互作相關(guān)[74]。

3 蛋白穩(wěn)定性和翻譯后處置相關(guān)的關(guān)鍵基序

3.1 氨基端序列

蛋白質(zhì)的氨基端往往是輔助蛋白進(jìn)行正確靶定、維持蛋白正確折疊和穩(wěn)定性的重要區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏氨基端67個(gè)氨基酸的截短MRP1 (第67—1531位) 無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)LTC4，表明含有胞外氨基端和第1個(gè)跨膜螺旋的區(qū)域可能對(duì)MRP1的功能是關(guān)鍵的。對(duì)該區(qū)域內(nèi)的半胱氨酸殘基作進(jìn)一步的研究表明，以絲氨酸取代Cys43 (TM1) 和Cys265 (CL3) 的突變體對(duì)亞砷酸鹽的抗性分別降低了71%和增加了3倍。此外，C43S對(duì)長(zhǎng)春新堿的抗性也降低了[75]。對(duì)OATP1B3的研究發(fā)現(xiàn)，其氨基端 (特別是位于第12—28位的氨基酸殘基)對(duì)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膜靶向是必不可少的，缺失了該序列的蛋白分散地分布于胞漿中，無(wú)法有效靶定到細(xì)胞膜上[76]。

3.2 帶酪氨酸的基序

NPXY (其中X可以是任何氨基酸) 是參與基底外側(cè)膜蛋白分選最常見(jiàn)類型的信號(hào)之一。 它通常位于分選蛋白質(zhì)的“胞漿面結(jié)構(gòu)域”中。除了作為基底外側(cè)分選信號(hào)外，NPXY還可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的內(nèi)吞過(guò)程中發(fā)揮作用[77]。雖然大部分NPXY分選信號(hào)位于蛋白質(zhì)的羧基端，OATP1B1序列中的胞內(nèi)環(huán)3中卻發(fā)現(xiàn)了1個(gè)高度保守的NPXY基序。其中的N335/P336共同作用于該轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后處置，用丙氨酸共同取代這2個(gè)氨基酸殘基會(huì)導(dǎo)致突變體滯留在高爾基體中，無(wú)法進(jìn)行有效的糖基替換進(jìn)而靶定到細(xì)胞表面；而Y338則可能與蛋白穩(wěn)定性有關(guān)，Y338A突變體降解速率加快，而低溫則可以部分恢復(fù)蛋白的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)運(yùn)功能[78]。OATP1B1序列中還含有1個(gè)非典型的YXXφ (φ為疏水性氨基酸殘基)，位于其氨基端，該序列與OATP1B1的蛋白表達(dá)以及轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，缺失了該序列 (YCNGL) 轉(zhuǎn)運(yùn)體的Km和vmax值都發(fā)生了顯著的改變[79]。

3.3 雙亮氨酸基序

蛋白中的雙亮氨酸基序常常以[DE]XXXL[LI]和DXXLL的形式出現(xiàn)，但已有多項(xiàng)研究表明非典型雙亮氨酸基序的存在。該基序與蛋白質(zhì)的內(nèi)體分選或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出相關(guān)，決定著許多跨膜蛋白的亞細(xì)胞定位[80]。例如，MRP1的羧基端含有1個(gè)高度保守的雙亮氨酸基序，雖然丙氨酸替換不改變轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸，但會(huì)顯著影響蛋白功能，而且如果同時(shí)突變雙亮氨酸基序和刪除MSD0，突變體會(huì)滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[81]。OAT1的TM12中含有1個(gè)雙亮氨酸基序 (Leu503Leu504)，其對(duì)該轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能是關(guān)鍵的，L503A/L504A雙突變體被滯留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，喪失了轉(zhuǎn)運(yùn)能力[82]。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基端也含有1個(gè)關(guān)鍵的雙亮氨酸基序 (Leu6Leu7)，將這2個(gè)亮氨酸殘基同時(shí)突變?yōu)楸彼釙?huì)造成轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞表面的表達(dá)水平顯著降低，從而失去轉(zhuǎn)運(yùn)能力。該突變體滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并通過(guò)蛋白酶體降解，說(shuō)明該氨基端雙亮氨酸序列與OAT1的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出與蛋白穩(wěn)定性相關(guān)[83]。

4 跨膜區(qū)域

跨膜螺旋是膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的重要結(jié)構(gòu)特征。在膜脂質(zhì)雙層中，水基本上被排除在外，多肽通常會(huì)采用α-螺旋結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)部氫鍵最大化?？缒ぢ菪话愫?8～21個(gè)非極性疏水的氨基酸殘基，其形成的α-螺旋長(zhǎng)度足以跨越通常的脂雙層寬度，跨膜蛋白具有一個(gè)到多個(gè)的這種跨膜區(qū)域，對(duì)于輔助物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的各種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)說(shuō)，這些跨膜區(qū)域?qū)Φ孜镒R(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)往往起著重要作用。SNP的研究發(fā)現(xiàn)，位于跨膜螺旋內(nèi)的突變體通常會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的變化[18]。關(guān)于跨膜區(qū)域?qū)λ幬镛D(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響，在之前的綜述論文[13]中已有詳細(xì)總結(jié)，在此不作贅述。

5 轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)研究的臨床意義

翻譯后的處置會(huì)影響轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白穩(wěn)定性、正確位點(diǎn)的靶定，直接或間接地影響這類蛋白對(duì)藥物底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響藥物的生物利用度，可能造成不良反應(yīng)，影響藥效。但在一些病理和藥理情況下，翻譯后修飾相關(guān)機(jī)制往往會(huì)受到影響。例如，酪氨酸激酶 (Tyrosine kinases) 參與了惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵信號(hào)事件/通路的調(diào)節(jié)，許多類型的癌癥被發(fā)現(xiàn)與酪氨酸激酶失調(diào)有關(guān)，因此近年來(lái)，越來(lái)越多的TKI被開(kāi)發(fā)用于抑制特定類型的癌癥。如索拉非尼可顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生命，是治療肝癌的一線藥物，它通過(guò)靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 (Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 1～3和血小板衍生因子受體β (Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-β) 等受體酪氨酸激酶以阻斷VEGF和PDGF依賴性血管生成[84]。舒尼替尼靶向VEGFR1～3、PDGFR-α、PDGFR-β、EGFR等酪氨酸激酶，可抑制多種惡性腫瘤的增殖和血管生成[85]。絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase, MAPK) 途徑 (也稱RAS/RAF/MEK/ERK途徑) 是癌癥生物學(xué)中最明確的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，有40%以上的人類癌癥病例與其過(guò)度激活有關(guān)。該通路激活增殖基因、促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)抑制腺苷活化蛋白激酶 (5'AMP-activated protein kinase, AMPK) 信號(hào)使細(xì)胞克服代謝應(yīng)激。有多個(gè)抗腫瘤藥物靶定MAPK途徑不同成員，例如抑制BRAF的維莫非尼、康奈非尼，抑制ERK的比美替尼、司美替尼、曲美替尼等[86]。由于激酶抑制劑在治療中應(yīng)用的廣泛性，因此可能通過(guò)不同的途徑直接或間接影響轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。

此外，功能性的SNP在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體中也很常見(jiàn)，這些遺傳多態(tài)性的存在，會(huì)使帶有突變體的種群對(duì)藥物有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，也可能產(chǎn)生不同的藥物-藥物相互作用。鑒于其重要的臨床意義，美國(guó)食品和藥物管理局 (FDA) 在2013年發(fā)布了臨床藥物基因組學(xué)指南《Guidance for industry clinical pharmacogenomics: Premarket evaluation in earlyphase clinical studies and recommendations for labeling》，以輔助更高效安全的藥物研發(fā)[87]。許多與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體都具有非同義的SNP，對(duì)于外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BCRP，研究得最廣泛的是一個(gè)非同義的SNP rs22331142 (c.421C＞A )，對(duì)應(yīng)于第141位的谷氨酰胺突變?yōu)橘嚢彼?。該多態(tài)性在亞洲人中占比約10%，相應(yīng)蛋白表達(dá)水平比野生型下降30%～40%，從而造成轉(zhuǎn)運(yùn)功能的下降。c.421C＞A突變體的泛素化水平增加，使其更容易被蛋白酶體降解且其靶向質(zhì)膜的能力也受到抑制。帶有該突變體的病人在多種藥物如他汀類藥物、抗腫瘤藥物的處置中表現(xiàn)出中度到高度的突變-藥物關(guān)聯(lián)性[88]。攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B1的編碼基因SLCO1B1也是一個(gè)高度變異基因，不同人種中的突變等位基因發(fā)生頻率較高。其中，rs4149056 (c.521T＞C) 突變是目前最具有臨床意義的基因多態(tài)性，在歐洲人中占比約8%～20%，在東亞人中占比可達(dá)到10%～15%。該突變體在質(zhì)膜上的蛋白表達(dá)水平下降，從而導(dǎo)致其功能減弱。帶有該突變的患者如服食他汀類藥物，會(huì)大大增加該藥物的系統(tǒng)暴露量，導(dǎo)致這類患者發(fā)生肌病，甚至橫紋肌溶解癥[89]。臨床藥物遺傳學(xué)實(shí)施聯(lián)盟 (CPIC) 據(jù)此在2014年的指南更新中建議根據(jù)SLCO1B1基因型調(diào)整相關(guān)他汀類藥物的用藥劑量[90]。如能明確影響轉(zhuǎn)運(yùn)體功能發(fā)揮的關(guān)鍵位點(diǎn)及其作用機(jī)制，系統(tǒng)地闡明其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，將可以有效地預(yù)測(cè)功能性SNP的存在，對(duì)不同個(gè)體更有針對(duì)性地用藥。

6 總結(jié)與展望

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是多種臨床藥物吸收、分布和排泄的關(guān)鍵決定因素，它們?cè)谒幬锏奈蘸团判惯^(guò)程中所發(fā)揮的重要作用毋容置疑，但我們對(duì)它們的調(diào)控機(jī)制以及相關(guān)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解仍然非常有限。翻譯后修飾對(duì)蛋白功能快速而直接的調(diào)控作用使其成為重要的藥物設(shè)計(jì)靶標(biāo)，SNP造成的藥物代謝和藥效的改變也日益引起重視。傳統(tǒng)的藥物-藥物相互作用主要關(guān)注直接在轉(zhuǎn)運(yùn)體上發(fā)生的相互作用-一個(gè)藥物是否會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制或促進(jìn)另一個(gè)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，但對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后處置過(guò)程特別是翻譯后修飾過(guò)程的研究表明，新生成的膜蛋白需要經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程才能到達(dá)細(xì)胞表面其發(fā)揮作用的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)運(yùn)藥物進(jìn)出細(xì)胞期間的任何一個(gè)步驟受到干擾，都有可能改變這些跨膜蛋白的功能，對(duì)其底物藥物的效應(yīng)或代謝產(chǎn)生與預(yù)期不同的影響，從而可能使患者產(chǎn)生不良反應(yīng)。而一些重要的臨床藥物，如主要用于治療腫瘤的TKI對(duì)蛋白的翻譯后修飾會(huì)有影響，且其多為長(zhǎng)期口服的藥物，往往需要每天服用，因而增加了其吸收方式和吸收效率的不可預(yù)測(cè)性，易造成藥代動(dòng)力學(xué)的個(gè)體差異以及多重用藥所導(dǎo)致的藥物-藥物相互作用[91]。2019年的一項(xiàng)研究表明，接受TKI治療的患者中有97.1%同時(shí)服用至少1種其他藥物，中位數(shù)為同時(shí)服用4種藥物，而47.4%的患者經(jīng)歷了至少1種可能由TKI介導(dǎo)的藥物-藥物相互作用[92]，說(shuō)明激酶抑制劑通過(guò)改變蛋白翻譯后修飾，直接或間接影響轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能是臨床上一個(gè)高概率發(fā)生的事件。明確各類轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控機(jī)制，可以更好地預(yù)測(cè)藥物-藥物相互作用，提高藥效和防止不良反應(yīng)的發(fā)生。此外，對(duì)患者間藥物反應(yīng)差異的因素進(jìn)行有效地預(yù)測(cè)是藥物開(kāi)發(fā)的重要步驟和目標(biāo)，如能闡明不同藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體序列中與轉(zhuǎn)運(yùn)功能調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)及明確其所涉及的分子與細(xì)胞學(xué)機(jī)制，可更有效地預(yù)測(cè)突變等位基因?qū)λ幮Ш退幬?藥物相互作用的影響，從而進(jìn)一步建立相應(yīng)的預(yù)防措施，更好地為個(gè)性化用藥提供信息。對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后處置過(guò)程及結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究仍處于起步階段，對(duì)其深入系統(tǒng)的研究將有助于更有效地預(yù)測(cè)藥物-藥物相互作用以及優(yōu)化藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)、更有針對(duì)性和前瞻性地了解轉(zhuǎn)運(yùn)體遺傳多態(tài)性對(duì)不同個(gè)體的影響、為藥物設(shè)計(jì)提供更合理的方案，提高藥物使用的安全性和效率。