■唐文浩 張養(yǎng)東* 黃國欣 楊繼勇 劉凱珍 鄭 楠 王加啟

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京100193）

苜蓿作為一種富含豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和微量元素的優(yōu)質(zhì)牧草，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)養(yǎng)殖中[1]。并且隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)集約化水平和養(yǎng)殖水平的不斷提高，人們對優(yōu)質(zhì)苜蓿的需求日益增加[2]。目前，我國苜蓿來源主要依賴進(jìn)口，2020年我國全年干草進(jìn)口量為169.4萬噸，其中全年累積進(jìn)口苜蓿干草135.81萬噸，占比80.17%，根據(jù)中國海關(guān)最新數(shù)據(jù)，2021年，我國累積進(jìn)口干草199.24 萬噸，其中苜蓿干草178.03 萬噸，占比89.35%，苜蓿干草占比進(jìn)一步加大。發(fā)展我國苜蓿產(chǎn)業(yè)的任務(wù)迫在眉睫，因此準(zhǔn)確評價我國苜蓿消化營養(yǎng)價值成為第一限制性因素。

體外產(chǎn)氣法是由德國Menke等[3]等建立的一種通過測定飼料樣品在體外與瘤胃液混合消化后所產(chǎn)生的氣體的多少及其他發(fā)酵指標(biāo)來評估飼料品質(zhì)的快速方法。該方法選擇的發(fā)酵底物一般是先烘干處理然后進(jìn)行粉碎并過40 目篩，但與奶牛真實采食飼料狀態(tài)差異很大，且有研究表明，飼料長度會影響反芻動物的干物質(zhì)采食量[4]、咀嚼時間[5]、瘤胃pH[6]等。因此，在體外產(chǎn)氣試驗上選擇過于細(xì)碎的發(fā)酵底物可能不能與其真實飼喂價值相一致，從而影響體外產(chǎn)氣法對飼料樣品消化營養(yǎng)價值的評價準(zhǔn)確性，故針對現(xiàn)狀本文擬采用瘤胃體外產(chǎn)氣法評價傳統(tǒng)方法處理飼料狀態(tài)（粉碎至0.425 mm）和動物采食飼料真實狀態(tài)（切短至20 mm），將0.425 mm 苜蓿干草和20 mm 苜蓿干草作為發(fā)酵底物，對其產(chǎn)氣量和瘤胃發(fā)酵特性進(jìn)行比較研究，以期初步探尋不同物理狀態(tài)苜蓿干草對體外產(chǎn)氣法評價其消化價值的影響，旨在為我國苜蓿的合理高效應(yīng)用提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2021 年11 月1 日至2021 年12 月31 日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院昌平試驗基地進(jìn)行。

1.2 試驗材料

試驗所用的苜蓿干草飼料由赤峰澳亞現(xiàn)代牧場有限公司通希牧場提供。參照張麗英[7]的方法對采集到的苜蓿干草樣品的干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和粗脂肪（EE）等常規(guī)營養(yǎng)成分進(jìn)行測定。苜蓿干草的營養(yǎng)成分詳見表1。

表1 苜蓿干草常規(guī)營養(yǎng)成分（%）

1.3 試驗動物與試驗設(shè)計

選擇3 頭年齡、體重、產(chǎn)奶量和胎次都相近的裝有瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，供體牛每天8：00 和20：00 飼喂兩次，期間自由飲水。將苜蓿干草樣品用四分法分為兩份，每份取500 g，將其中一份粉碎并過40 目（0.425 mm）篩網(wǎng)，另一份苜蓿干草用鍘刀切短至20 mm，作為發(fā)酵底物備用。試驗采用單因素設(shè)計，每組設(shè)計5個重復(fù)，共發(fā)酵72 h。

1.4 體外發(fā)酵試驗

1.4.1 發(fā)酵底物

用四分法將采集到的苜蓿干草樣品分為兩份，每份500 g，將其中一份放于65 ℃烘箱烘干24 h，而后粉碎并過40 目（0.425 mm）篩網(wǎng)，另一份用鍘刀鍘短至20 mm，備用。將兩處理組分別準(zhǔn)確稱取200 mg樣品，置于干燥且密封良好的120 mL 透明玻璃發(fā)酵注射管（最小刻度為1 mL）底部，活塞涂抹凡士林。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)液

按照Menke 等[8]的方法配制試驗所需人工唾液，并按照比例依次加入1 200 mL 純化水、0.3 mL 微量元素溶液、600 mL緩沖溶液、600 mL常量元素溶液和3 mL刃天青指示劑溶液，配制同時持續(xù)通入CO2保持厭氧，放于水浴鍋中預(yù)熱至39 ℃，約30 min后，向其中再加入120 mL還原劑溶液，用前新鮮配制上述溶液，此時混合溶液應(yīng)由紅色褪至完全無色（無氧狀態(tài)）即可使用。于晨飼前2 h采集3頭供體牛瘤胃液各1 L，4層紗布過濾混合，置于39 ℃預(yù)熱后的保溫壺中迅速帶回實驗室。按照1∶2的比例將瘤胃液與人工唾液進(jìn)行混合，配成人工瘤胃培養(yǎng)液，其間持續(xù)39 ℃水浴，持續(xù)通入CO2保持厭氧。轉(zhuǎn)移30 mL 人工瘤胃培養(yǎng)液于提前預(yù)熱39 ℃的裝有發(fā)酵底物的發(fā)酵管中，并用夾子夾住前端乳膠管后，置于39 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中，分別記錄發(fā)酵2、4、8、16、24、48 h和72 h的產(chǎn)氣量，同時將相對應(yīng)的發(fā)酵管迅速取出，置于冰上停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液，進(jìn)行分裝，立即測定發(fā)酵液pH，其余-20 ℃保存，備測。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 累積產(chǎn)氣量（gas production, GP）及產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)的測定

按照Mauricio 等[9]的方法計算體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量，參照?rskov 等[10]的方法計算體外產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)，計算公式如下。

GP=B×[1-e-c（t-Lag）]

式中：GP——200 mg樣品的累積產(chǎn)氣量（mL）；

B——200 mg樣品的理論最大產(chǎn)氣量（mL）；

C——200 mg樣品的產(chǎn)氣速率（h-1）；

t——產(chǎn)氣時間點（h）；

Lag——產(chǎn)氣延滯時間（h）。

1.5.2 pH的測定

采用PHS-100 便攜式酸度計（天奇MDT 信息技術(shù)有限公司，上海，中國）測定發(fā)酵液pH。

1.5.3 氨態(tài)氮（NH3-N）和微生物蛋白（MCP）的測定

采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N的含量[11]。利用差速離心法測定MCP含量[12]。

1.5.4 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定

瘤胃液VFA 的測定參照Scortichini 等[13]的方法，采用氣相色譜法（Agilent 7890A GC System，美國）測定，氣相色譜儀內(nèi)配置氫火焰離子化檢測器（FID），載氣為高純氮氣。色譜柱選擇DB-FFAP，規(guī)格為15 m×320 μm×0.25 μm，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。升溫程序：初始溫度70 ℃，以3 ℃/min升溫至125 ℃，隨后以80 ℃/min 升溫至180 ℃，保持5 min。檢測器參數(shù)：氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min，氫火焰離子化檢測器溫度為300 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行初步統(tǒng)計，并利用SAS 9.4 的ANOVA 程序?qū)俎８刹莅l(fā)酵參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，當(dāng)P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著，試驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物理狀態(tài)苜蓿干草對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)的影響（見表2）

表2 不同物理狀態(tài)發(fā)酵底物對產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由表2 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，各組產(chǎn)氣量都呈現(xiàn)上升趨勢，在48 h 以后上升趨勢逐漸平緩，達(dá)到了產(chǎn)氣平臺期。0.425 mm 組在2 h 至24 h 的累積產(chǎn)氣量都高于20 mm 組，組間差異極顯著（P＜0.01），在發(fā)酵48 h 至72 h 時，48 h 兩組間產(chǎn)氣量差異顯著（P＜0.05），72 h 兩組產(chǎn)氣量達(dá)到相當(dāng)水平，產(chǎn)氣量沒有顯著差異（P＞0.05）。在兩組理論最大產(chǎn)氣量上，沒有顯著性差異（P＞0.05），但在產(chǎn)氣速率上20 mm組極顯著低于0.425 mm組17.91%（P＜0.01）。

2.2 不同物理狀態(tài)苜蓿干草對體外發(fā)酵參數(shù)的影響（見表3）

表3 不同物理狀態(tài)發(fā)酵底物對pH、NH3-N、MCP的影響

由表3可知，各組pH呈現(xiàn)不斷波動變化趨勢，但基本穩(wěn)定，各個發(fā)酵時間發(fā)酵液pH 均處于正常變化范圍。發(fā)酵8 h前兩組pH變化差異顯著（P＜0.05），但在8 h后兩組pH變化差異不顯著（P＞0.05）。0.425 mm組和20 mm 組發(fā)酵液NH3-N 含量都呈現(xiàn)上升趨勢。20 mm組發(fā)酵24、48 h和72 h的NH3-N含量極顯著高于0.425 mm 組（P＜0.01）。MCP 指標(biāo)兩組間在發(fā)酵過程中沒有顯著性差異（P＞0.05），都呈現(xiàn)上升趨勢，72 h達(dá)到最大。

2.3 不同物理狀態(tài)苜蓿干草對體外發(fā)酵VFA濃度的影響（見表4）

由表4 數(shù)據(jù)可知，發(fā)酵24 h 以前，0.425 mm 組和20 mm 組乙酸濃度兩組間出現(xiàn)極顯著性差異，20 mm組極顯著高于0.425 mm 組（P＜0.01）。兩組48 h 和72 h 發(fā)酵液中乙酸濃度差異不顯著（P＞0.05）。兩組間丙酸濃度呈上升趨勢，發(fā)酵24 h前各時間點丙酸濃度在組間出現(xiàn)極顯著性差異（P＜0.01）。兩組丙酸含量都在發(fā)酵72 h 時達(dá)到最高，但兩組48 h 和72 h 發(fā)酵液丙酸濃度組間差異不顯著（P＞0.05）。丁酸含量隨著發(fā)酵時間的延長，兩組各時間點發(fā)酵液中丁酸含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，20 mm組16 h前發(fā)酵液丁酸含量極顯著高于0.425 mm 組（P＜0.01）。在24 h 和72 h 發(fā)酵液中20 mm 組發(fā)酵液中丁酸濃度也是高于0.425 mm 組，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵2、4、8 h 和16 h 時，20 mm 組發(fā)酵液中戊酸濃度極顯著高于0.425 mm組（P＜0.01）。發(fā)酵24 h時，20 mm組顯著高于0.425 mm 組（P＜0.05）。發(fā)酵48 h 和72 h時，兩組戊酸濃度沒有顯著性差異（P＞0.05）?？倱]發(fā)性脂肪酸濃度兩組間都呈現(xiàn)隨發(fā)酵時間的增加而逐漸上升的趨勢，在發(fā)酵前24 h，20 mm 組總揮發(fā)性脂肪酸濃度極顯著高于0.425 mm 組（P＜0.01），在發(fā)酵48 h 和72 h 時發(fā)酵液中總揮發(fā)性脂肪酸濃度兩組間沒有顯著的差異（P＞0.05）。

表4 不同物理狀態(tài)發(fā)酵底物對體外發(fā)酵VFA濃度的影響(mmol/L)

3 討論

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率是反映降解率和瘤胃微生物活性的重要體現(xiàn)，產(chǎn)氣量越多，產(chǎn)氣速率越快，表示底物降解和微生物活性越高[14]，另外總產(chǎn)氣量也是反映底物可發(fā)酵程度的體現(xiàn)[8]。本試驗結(jié)果表明，48 h前累積產(chǎn)氣量和總產(chǎn)氣速率，0.425 mm組皆高于20 mm組，說明飼料經(jīng)過粉碎，其底物降解率變快。其原因可能是飼料經(jīng)過粉碎，增加了飼料的表面積，使其與細(xì)菌和酶類接觸增多，使其更容易被消化[15]。但72 h累積產(chǎn)氣量和理論最大產(chǎn)氣量，兩組沒有顯著性差異，這一結(jié)果產(chǎn)生的原因可能因為兩組發(fā)酵底物的基本營養(yǎng)物質(zhì)相同，只有物理狀態(tài)的區(qū)別，隨著發(fā)酵時間的延長，都能到達(dá)發(fā)酵的平臺期，從而產(chǎn)生最大產(chǎn)氣量基本相同。喬富強(qiáng)[16]通過對比蒸汽壓片玉米處理前后對其產(chǎn)氣量的影響，得出了相同的結(jié)果，研究表明玉米經(jīng)過蒸汽壓片處理后并未改變其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)量，發(fā)酵底物中總營養(yǎng)物質(zhì)含量并未發(fā)生波動，因此試驗結(jié)果兩組體外總產(chǎn)氣量上無顯著性差異。

瘤胃液pH 可以反映瘤胃內(nèi)環(huán)境變化、瘤胃微生物和機(jī)體代謝狀態(tài)，以及判斷瘤胃功能狀態(tài)是否穩(wěn)定，是瘤胃生理功能是否健康的最直接體現(xiàn)[6]。反芻動物正常的瘤胃液pH變化范圍一般是6.0～7.0[17]。本試驗中，各組pH 均在6.73～6.88 內(nèi)變化，處在正常的波動范圍，發(fā)酵16 h后組間無顯著性差異。

NH3-N 濃度反映了飼料在瘤胃發(fā)酵過程中利用蛋白質(zhì)的情況[18]，是瘤胃微生物的主要能量來源。NH3-N被瘤胃微生物合成為MCP，作為反芻動物主要的氮來源供機(jī)體利用[19]。本試驗中兩組不同物理狀態(tài)苜蓿干草產(chǎn)生的NH3-N濃度在發(fā)酵2、4 h和16 h時并沒有顯著差異，在發(fā)酵4 h之后，20 mm組NH3-N濃度略高于0.425 mm組，在發(fā)酵72 h時，20 mm組產(chǎn)生的NH3-N濃度極顯著高于0.425 mm組。從MCP產(chǎn)量上看，兩組均是由少變多的過程，在發(fā)酵16 h 到48 h，MCP 產(chǎn) 量0.425 mm 組 高 于20 mm 組。0.425 mm 組NH3-N濃度低于20 mm組的合理解釋可能是粉碎狀態(tài)的飼料更容易被微生物附著，使其飼料中的蛋白質(zhì)快速分解，迅速被瘤胃微生物合成為MCP，導(dǎo)致0.425 mm組MCP濃度較高而NH3-N濃度較低；而未經(jīng)粉碎處理的飼料，其蛋白質(zhì)分解利用較粉碎組慢，導(dǎo)致瘤胃微生物合成MCP速度慢，導(dǎo)致20 mm組MCP濃度較低而NH3-N濃度較高，說明飼料物理狀態(tài)會影響瘤胃氮利用。

瘤胃VFA 濃度是反芻動物瘤胃代謝最重要的體現(xiàn)，VFA 作為反芻動物重要的能量來源，約占80%以上[20-21]。其中乙酸、丙酸和丁酸占總TVFA 的95%以上[22]。本試驗中，兩處理組其瘤胃VFA濃度都呈現(xiàn)上升的趨勢，并且兩處理組的VFA中乙酸濃度均高于丙酸濃度，這與Copani等[23]的研究結(jié)果相同。在48 h以后兩組的TVFA 濃度沒有顯著性差異，說明兩組底物存在的潛在碳水化合物含量不受物理狀態(tài)的改變而改變，但在發(fā)酵24 h以前，TVFA濃度除丁酸外20 mm組都顯著高于0.425 mm 組，說明對飼料進(jìn)行粉碎加工，會對瘤胃VFA 產(chǎn)生速度也造成改變，從而影響對飼料的評價。

4 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，不同物理狀態(tài)會影響苜蓿干草的發(fā)酵特性，20 mm 苜蓿干草的產(chǎn)氣速率極顯著低于0.425 mm 苜蓿干草，但對發(fā)酵液pH 的波動影響較小，發(fā)酵前24 h，TVFA 濃度除丁酸外，20 mm 苜蓿干草均顯著高于0.425 mm 苜蓿干草。因此，建議選擇20 mm苜蓿干草作為發(fā)酵底物進(jìn)行營養(yǎng)價值評價，更能體現(xiàn)其真實營養(yǎng)價值，并為飼料營養(yǎng)價值準(zhǔn)確評價和日糧配方設(shè)計提供數(shù)據(jù)支撐。