王雨童， 趙彩鴻， 王曉東， 楊 玲(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

花楸(Sorbuspohuashanensis)是薔薇科蘋(píng)果亞科花楸屬落葉喬木，是集觀賞、藥用和食用價(jià)值為一體的高效益珍貴樹(shù)種[1]。野生花楸主要分布于中國(guó)的東北、華北等地，朝鮮北部和俄羅斯西伯利亞?wèn)|部也有少量分布[2]。由于花楸的園林觀賞價(jià)值逐漸被人們重視，過(guò)度的濫采亂挖對(duì)中國(guó)東北東部林區(qū)花楸的野生資源造成了極大的破壞，部分地區(qū)的種群瀕臨消失，因此，采取有效的保護(hù)措施保存花楸種質(zhì)資源并加快花楸的開(kāi)發(fā)利用研究具有重要意義。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花楸樹(shù)種子具有深度或絕對(duì)的休眠狀態(tài)，屬于嚴(yán)格休眠種子[3]。在花楸種子播種前期對(duì)其進(jìn)行一定的層積處理能夠有效地提高種子發(fā)芽率[4-7]。用花楸種子的水浸液對(duì)白菜種子進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，白菜種子萌發(fā)受到了明顯的抑制，說(shuō)明引起花楸種子休眠的主要原因是花楸的果肉、果汁、種皮和種胚中均含有明顯抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)脫落酸(ABA)[8]。ABA是導(dǎo)致花楸種子休眠的另一重要因素[9]。因此，可以將花楸種子休眠歸類(lèi)為生理休眠。最新研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯能提高花楸胚胎的萌發(fā)率，在胚胎破裂過(guò)程中乙烯生物合成的增加使NO代謝途徑中H2O2含量增加，從而調(diào)控胚胎的休眠和萌發(fā)[10]。

近年來(lái)，我國(guó)多數(shù)地區(qū)土地鹽堿化越發(fā)嚴(yán)重，限制了作物的生長(zhǎng)和發(fā)育[11]。研究表明，土壤中的鹽堿成分作為影響植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量最常見(jiàn)的脅迫因素之一，從種子萌發(fā)到開(kāi)花結(jié)實(shí)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中造成植物發(fā)芽率低、發(fā)芽延遲、幼苗死亡率高、葉綠素含量減少和光合性能降低等影響[12]。鹽堿脅迫會(huì)導(dǎo)致種子吸水不足，子葉中儲(chǔ)藏的蛋白水解酶活性受到抑制，使呼吸作用受到抑制，種子難以萌發(fā)[13]。鹽脅迫降低了種子發(fā)芽率，從而損害了許多物種幼苗的建立[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯可以有效地改善鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用[15]，但對(duì)其調(diào)控機(jī)制尚不明確。于建等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在植物種子萌發(fā)的過(guò)程中，乙烯作為植物體重要的激素和信號(hào)物質(zhì)，也參與到植物體眾多生理生化及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括參與植物響應(yīng)生物和非生物脅迫。鹽堿脅迫對(duì)花楸胚胎萌發(fā)的影響尚不清楚，乙烯是否可以提高鹽堿脅迫下花楸胚胎萌發(fā)率尚待研究確定。

本試驗(yàn)用乙烯處理花楸胚胎，并對(duì)外源乙烯影響鹽堿脅迫下花楸胚胎萌發(fā)的作用進(jìn)行觀察，對(duì)胚胎的萌發(fā)率、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄與處理。研究結(jié)果為明確外源乙烯促進(jìn)花楸胚胎休眠解除的作用機(jī)制，闡明乙烯緩解鹽堿脅迫下花楸胚胎的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，并為花楸在鹽堿地區(qū)推廣栽培提供參考依據(jù)，為人工促進(jìn)花楸種子萌發(fā)、有效保護(hù)和擴(kuò)展花楸自然資源提供技術(shù)和參考。

1 材料與方法

1.1 萌發(fā)試驗(yàn)

1.1.1試驗(yàn)材料

2020年10月上旬自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)成年花楸母樹(shù)采集成熟漿果后用水選法調(diào)制種子[17]。將處于安全含水量(9%～10%)的飽滿、純凈成熟種子放入塑封袋，于4 ℃ 貯藏于冰箱中備用。

1.1.2萌發(fā)試驗(yàn)方法

1) 種子前處理

試驗(yàn)前測(cè)定種子千粒重、含水量和生活力，然后在蒸餾水中(20±5)℃下吸脹48 h。將吸脹后種子用0.2%(v/v)NaClO溶液攪拌浸泡15 min，用無(wú)菌水沖洗至少3次，在冰上剝除種皮(花楸為無(wú)胚乳種子)擠出裸胚用于試驗(yàn)，裸胚獲得方法同楊玲等[18]的研究方法。

2) 萌發(fā)試驗(yàn)

乙烯(ETH)處理試驗(yàn)。將胚胎放在3 mL (ETH濃度為138 μmol/L)浸濕的濾紙上吸脹，對(duì)照為直接在蒸餾水浸濕的濾紙上吸脹。所有試驗(yàn)胚胎均在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中(每皿30個(gè)胚)25 ℃，光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2·s)(每天16 h光照)下萌發(fā)。對(duì)照和處理均設(shè)3個(gè)以上重復(fù)。

碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)處理試驗(yàn)。將胚胎分別放在3 mL(Na2CO3濃度為8.92 mmol/L )、(NaHCO3濃度為14.15 mmol/L )浸濕的濾紙上吸脹，對(duì)照和萌發(fā)條件均同上。

Na2CO3、NaHCO3分別與乙烯的組合處理試驗(yàn)。將胚胎放在3 mL Na2CO3與ETH混合液、NaHCO3與ETH混合液浸濕的濾紙上吸脹，對(duì)照和萌發(fā)條件均同上。

1.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行繪圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)方差分析、Duncan多重比較和相關(guān)性分析。方差分析在p=0.05水平上進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。平均數(shù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異用鄧肯多重比較法在p=0.05顯著性水平上檢驗(yàn)。各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

萌發(fā)率(%)=(胚胎萌發(fā)數(shù)/供試胚胎總數(shù))×100%;

平均發(fā)芽速度(d)=∑(D×n)/∑n

式中：D為從種子置床起算的天數(shù)，有的規(guī)定置床之日為0,有的規(guī)定為1。n為相應(yīng)各天的發(fā)芽數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt

式中：Gt為發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)，∑為總和。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(日發(fā)芽數(shù)/供試胚胎總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯對(duì)鹽堿脅迫下花楸胚胎萌發(fā)的影響

不同處理對(duì)花楸胚胎萌發(fā)的影響如圖1所示。用Na2CO3、NaHCO3處理后的花楸胚胎的萌發(fā)率顯著低于對(duì)照，外源添加乙烯處理后萌發(fā)率雖沒(méi)有達(dá)到對(duì)照水平，但也顯著提高。由圖2可知，在萌發(fā)過(guò)程中(1～8 d)最先萌發(fā)的是乙烯處理，第3天即可萌發(fā)，最晚萌發(fā)的是NaHCO3處理(第6天)，第8天時(shí)各處理的萌發(fā)率由高至低依次為ETH(60%)、H2O(43%)、Na2CO3與ETH組合(28.89%)、NaHCO3與ETH組合(18.89%)、Na2CO3(13.33%)、NaHCO3(6.67%)，且各處理間差異顯著(p<0.05)。

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 各處理對(duì)花楸胚胎萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of each process on the germination percentage of Sorbus pohuashanensis embryo

圖2 各處理下花楸胚胎1～8 d的萌發(fā)率Fig.2 Germination percentage of 1 to 8 days under various treatments of Sorbus pohuashanensis

2.2 ETH對(duì)鹽堿脅迫下花楸胚胎平均發(fā)芽速度的影響

平均發(fā)芽速度是指供試種子全部發(fā)芽所需要的時(shí)間，此指標(biāo)可以反映種子的活力。由圖3可知，ETH處理后花楸胚胎的平均發(fā)芽速度最低(4.98 d)，顯著低于其他處理。與對(duì)照相比，經(jīng)Na2CO3、NaHCO3處理后花楸胚胎的平均發(fā)芽速度顯著提高，Na2CO3為6.77 d、NaHCO3為7.17 d，說(shuō)明胚胎萌發(fā)受到抑制。向Na2CO3、NaHCO3中添加外源ETH后，平均發(fā)芽速度降低，達(dá)到對(duì)照(6.25 d)水平，說(shuō)明Na2CO3、NaHCO3對(duì)胚胎萌發(fā)的抑制作用減弱，胚胎萌發(fā)能力增強(qiáng)。

圖3 各處理對(duì)花楸胚胎平均發(fā)芽速度的影響Fig.3 Effects of each process on the mean germination speed of Sorbus pohuashanensis embryo

2.3 ETH對(duì)鹽堿脅迫下花楸胚胎發(fā)芽指數(shù)的影響

各處理中，ETH處理后的花楸胚胎發(fā)芽指數(shù)最高(圖4)，且各處理的發(fā)芽指數(shù)間均存在顯著差異(p<0.05)。發(fā)芽指數(shù)最高的處理(ETH)是最低的處理(NaHCO3)的13倍多。由此可見(jiàn)，ETH不僅可以促進(jìn)正常情況下的花楸胚胎萌發(fā)，還可以緩解鹽堿脅迫對(duì)花楸胚胎的抑制作用。各處理下花楸胚胎1～8 d的發(fā)芽指數(shù)見(jiàn)圖5。胚胎發(fā)芽指數(shù)在萌發(fā)過(guò)程中的變化是先增后降最后趨于穩(wěn)定，說(shuō)明胚胎在發(fā)芽中期活力最高。

圖4 各處理對(duì)花楸胚胎發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.4 Effects of each process on the germination index of Sorbus pohuashanensis embryo

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。圖5 各處理下花楸胚胎1～10 d的發(fā)芽指數(shù)Fig.5 Germination index of 1 to 8 days under various processes of Sorbus pohuashanensis embryo

2.4 ETH對(duì)鹽堿脅迫下花楸胚胎發(fā)芽勢(shì)的影響

ETH處理對(duì)鹽堿脅迫下花楸胚胎發(fā)芽勢(shì)的影響見(jiàn)圖6。ETH處理后胚胎的發(fā)芽勢(shì)為24.44%，顯著高于對(duì)照，Na2CO3、NaHCO3處理后胚胎發(fā)芽勢(shì)顯著低于對(duì)照。說(shuō)明ETH可以促進(jìn)花楸胚胎萌發(fā)，Na2CO3、NaHCO3抑制了花楸胚胎萌發(fā)。向Na2CO3、NaHCO3中加入ETH后花楸胚胎的發(fā)芽勢(shì)分別提高40%和100%，但不顯著，說(shuō)明加入外源ETH可以緩解鹽堿脅迫對(duì)花楸胚胎萌發(fā)的部分抑制作用。

圖6 各處理對(duì)花楸胚胎發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.6 Effects of various processes on the germination potential of Sorbus pohuashanensis embryo

3 結(jié)論與討論

3.1 Na2CO3、NaHCO3處理抑制花楸胚胎萌發(fā)

Na2CO3、NaHCO3是東北地區(qū)鹽堿土中的主要成分，具有較強(qiáng)堿性，且pH值很高。鹽脅迫會(huì)抑制鹽生植物[19]和甜土植物[20]種子的萌發(fā)，堿脅迫除了直接抑制種子萌發(fā)外，還可以通過(guò)光合作用對(duì)植物生長(zhǎng)進(jìn)行影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，用Na2CO3、NaHCO3處理后花楸胚胎的萌發(fā)率分別降低了70%和85%，發(fā)芽指數(shù)分別降低了72%和87%，發(fā)芽勢(shì)分別降低了62%和77%，平均發(fā)芽速度分別提高了8%和14%，均與對(duì)照差異顯著，說(shuō)明鹽堿脅迫條件下花楸胚胎萌發(fā)會(huì)受到抑制。

3.2 外源ETH處理促進(jìn)花楸胚胎休眠解除

ETH是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，ETH具有打破種子休眠的作用，已經(jīng)逐漸得到證實(shí)，如蘋(píng)果(MaluspumilaMill.)[22]。此外，趙秋榮和楊湘虹[23]通過(guò)研究ETH的生物合成、代謝以及信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，ETH會(huì)參與到種子的休眠與萌發(fā)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ETH處理后胚胎的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)等均高于對(duì)照。ETH處理后花楸胚胎第3天即可萌發(fā)，早于其他處理，且在第8天時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最高。結(jié)果表明，ETH對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用。

此外，向Na2CO3、NaHCO3中加入ETH后，花楸胚胎的萌發(fā)率又顯著提升，說(shuō)明ETH可以緩解Na2CO3、NaHCO3對(duì)花楸胚胎萌發(fā)的抑制，但具體的作用機(jī)理還尚不明確，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3.3 外源ETH對(duì)鹽堿脅迫下的花楸胚胎萌發(fā)有調(diào)控作用

有研究發(fā)現(xiàn)，外源添加ETH、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等化學(xué)物質(zhì)會(huì)緩解鹽堿脅迫對(duì)植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制作用[24]。外源噴施ETH對(duì)鹽脅迫下萌發(fā)受到抑制的種子是有效的[25]。綜合ETH處理對(duì)正常情況下以及Na2CO3、NaHCO3脅迫條件下花楸樹(shù)胚胎的萌發(fā)率、發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢(shì)的結(jié)果可知，外源ETH不僅可使正常休眠的花楸胚胎萌發(fā)得更整齊、更快、萌發(fā)率更高，還對(duì)鹽堿脅迫下的花楸胚胎休眠有一定的解除作用。說(shuō)明在花楸樹(shù)胚胎休眠解除和鹽堿脅迫解除中ETH具有重要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)外源ETH可以促進(jìn)花楸胚胎萌發(fā)，鹽堿脅迫會(huì)抑制花楸胚胎萌發(fā)，外源添加ETH可以有效地改善鹽堿脅迫對(duì)花楸胚胎萌發(fā)的抑制作用。本研究結(jié)果為建立外源ETH促進(jìn)花楸胚胎萌發(fā)技術(shù)提供了科學(xué)依據(jù)，并可為花楸在鹽堿地區(qū)推廣栽培提供參考。