湯舒越，湯曉艷,，張宇慧，劉素可，黃欣媛，段勝男

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

脂肪是畜禽肉中重要營養(yǎng)指標(biāo)之一，脂肪含量的多少不僅反映了畜禽肉營養(yǎng)品質(zhì)狀態(tài)，還關(guān)系到肌肉的嫩度、多汁性以及風(fēng)味等食用品質(zhì)，此外脂肪的氧化問題還影響貯藏期間畜禽肉品質(zhì)劣變程度，從而影響產(chǎn)品貨架期。目前脂肪含量的檢測主要采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法，該方法耗時(shí)長，操作繁瑣，尤其是檢測中使用乙醚或石油醚等有機(jī)試劑，會對人體和環(huán)境造成極大危害和污染。因此，探索高效率、低污染的新型脂肪含量測定方法成為重要課題。目前國內(nèi)外有不少研究人員探索用近紅外光譜技術(shù)、超聲波技術(shù)、計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)等檢測畜禽肉中脂肪含量，其中近紅外技術(shù)在肉品快速無損檢測方面的操作規(guī)范還制定了相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但上述方法均基于模型建立的思路，需要收集至少100 個(gè)具有代表性的樣品，其中同一品種的樣品要包含不同性別、不同月齡、不同部位，使脂肪含量范圍能夠覆蓋未來分析的樣品特性，由此創(chuàng)建脂肪含量的預(yù)測模型，不能直接準(zhǔn)確定量。

低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)是在恒定磁場強(qiáng)度為0.5 T以下，研究具有固定磁矩的氫原子核與交變磁場發(fā)生能量交換的現(xiàn)象，即弛豫過程。根據(jù)物體內(nèi)部原子核的弛豫特性，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)組分的定量和鑒別分析，利用這一原理可以檢測糧油種子含油含水率、牛奶摻假、肉類注水注膠鑒別等多個(gè)方面。其中，在油脂含量測定方面，有研究發(fā)現(xiàn)，食用油的弛豫峰頂點(diǎn)時(shí)間在100 ms左右，但在同一弛豫時(shí)間段內(nèi)，除油脂信號外還存在水分信號。Miklos等研究發(fā)現(xiàn)，香腸在弛豫時(shí)間為60～160 ms時(shí)出現(xiàn)的峰包含了脂肪和水分共同的信號。因此，消除水分對脂肪信號的影響是準(zhǔn)確定量脂肪含量的關(guān)鍵因素。有學(xué)者采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，通過水油共同信號直接建立預(yù)測模型實(shí)現(xiàn)對脂肪含量的測定，但化學(xué)計(jì)量統(tǒng)計(jì)需要一定的樣本量，方法具有局限性。S?rland等也利用梯度場抑制水分信號對脂肪含量進(jìn)行測定，但該方法對設(shè)備要求高，極大地增加了檢測成本。

本實(shí)驗(yàn)針對生豬育種養(yǎng)殖以及豬肉營養(yǎng)評價(jià)中脂肪含量測定的迫切需求，擬利用烘干方法去除水分，分離低場核磁脂肪信號和水分信號，優(yōu)化樣品質(zhì)量、烘干時(shí)間、回波時(shí)間等技術(shù)參數(shù)，建立LF-NMR技術(shù)檢測豬肉中脂肪含量的方法，以期改進(jìn)國標(biāo)索氏抽提法有機(jī)試劑污染危害、抽提耗時(shí)長等問題，提供一種綠色環(huán)保的畜禽肉中脂肪含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬背最長肌、豬油購于北京超市發(fā)賣場。將豬背最長肌剔除肉眼可見筋膜，絞成肉糜，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

NMI20-040V-I型核磁共振成像分析儀（氫譜，共振頻率20 MHz，探頭線圈直徑25 mm） 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；Soxtec2050索氏提取儀 丹麥福斯集團(tuán)公司；OLB-DH100-2型干式恒溫器 山東歐萊博儀器有限公司；GZX-9023 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱烘箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AL104型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基準(zhǔn)脂肪含量的測定

參照GB 5009.6—2016，用索氏抽提法測定豬肉樣品中脂肪含量，作為基準(zhǔn)脂肪含量。

1.2.2 低場核磁信號采集

首先在FID序列下通過儀器自檢進(jìn)行校準(zhǔn)，再用CPMG序列采集樣品的橫向弛豫時(shí)間（），經(jīng)SIRT多組分反演后得到譜圖。

CPMG序列檢測參數(shù)設(shè)置為：接收機(jī)帶寬200 kHz，等待時(shí)間2 000 ms，模擬增益20，數(shù)字增益3，前置放大增益2，回波個(gè)數(shù)4 000～9 000。

1.2.3 信號采集參數(shù)優(yōu)化

1.2.3.1 回波時(shí)間

經(jīng)射頻脈沖作用后，從橫向磁化強(qiáng)度最初產(chǎn)生到接收信號間的時(shí)間間隔被稱為回波時(shí)間。一般要求半回波時(shí)間大于6 倍90°脈沖寬度設(shè)定值。本研究分別設(shè)置回波時(shí)間為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 ms，以末尾10 個(gè)信號幅值的平均值為最終衰減信號幅值，比較不同回波時(shí)間下的衰減程度及弛豫信息。

1.2.3.2 重復(fù)掃描次數(shù)

重復(fù)掃描次數(shù)為儀器進(jìn)行自動重復(fù)采樣的次數(shù)，重復(fù)掃描次數(shù)會影響樣品的信號強(qiáng)度和采樣時(shí)間，因此需要根據(jù)樣品的實(shí)際信號強(qiáng)弱進(jìn)行優(yōu)化選擇。本研究設(shè)置儀器重復(fù)掃描次數(shù)為8、16、32、64、128 次，分別比較分析譜圖的弛豫特性及信噪比（）。

1.2.4 樣品參數(shù)優(yōu)化

1.2.4.1 樣品質(zhì)量

分別稱取豬肉糜1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g（精確至0.001 g），105 ℃烘干6 h，恒溫50 ℃后采集低場核磁信號，設(shè)置回波時(shí)間為0.3 ms，重復(fù)掃描次數(shù)64 次，分析不同樣品質(zhì)量對弛豫特性的影響。

1.2.4.2 烘干時(shí)間

取4.0 g（精確至0.001 g）肉糜在105 ℃烘干不同時(shí)間（0、2、4、6、8、9、10、11、12 h），恒溫至50 ℃后，采集低場核磁信號，分析烘干時(shí)間對樣品脂肪信號的影響。

1.2.4.3 樣品檢測溫度

取4.0 g（精確至0.001 g）肉糜在105 ℃烘干6 h，將烘干后樣品溫度分別恒溫至32、40、50、60、70 ℃，采集樣品低場核磁信號，考察樣品溫度對弛豫特性的影響。

1.2.5 方法驗(yàn)證

1.2.5.1 重復(fù)性

取3 塊豬背最長肌，每個(gè)樣品取6 個(gè)平行，根據(jù)優(yōu)化后檢測條件進(jìn)行測定，計(jì)算低場核磁脂肪信號峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.5.2 精密度

分別在同一天內(nèi)不同時(shí)間段及不同天內(nèi)對同一樣品進(jìn)行測定（=6），計(jì)算樣品脂肪信號峰面積的RSD，考察其日內(nèi)精密度及日間精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 信號采集參數(shù)優(yōu)化

儀器檢測參數(shù)主要由2 部分組成，即系統(tǒng)參數(shù)和信號采集參數(shù)。其中系統(tǒng)參數(shù)包括儀器特性和環(huán)境因素，檢測初始利用FID序列對儀器系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行自動校準(zhǔn)，包括中心頻率、90°脈沖和180°脈沖。信號采集參數(shù)包括重復(fù)掃描次數(shù)、等待時(shí)間、回波時(shí)間及回波個(gè)數(shù)。其中等待時(shí)間無顯著影響，回波個(gè)數(shù)根據(jù)實(shí)際樣品保證信號量完全衰減即可，因此主要對回波時(shí)間及重復(fù)掃描次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 回波時(shí)間

回波時(shí)間的變化會影響CPMG回波曲線的衰減程度和弛豫區(qū)間。一般來講，為減小分子擴(kuò)散作用的影響，回波時(shí)間應(yīng)盡量短，但對于干燥樣品，回波時(shí)間的變化主要影響分布的短弛豫組分。圖1A中和分別為肉中強(qiáng)結(jié)合水、部分烘干未去除的弱結(jié)合水，峰為脂肪峰。峰隨著回波時(shí)間的延長逐漸減小且向右移動，峰占比較小，隨回波時(shí)間延長逐漸消失。這是因?yàn)榛夭〞r(shí)間的改變會影響分子自擴(kuò)散以及分子交換對弛豫特性的影響，回波時(shí)間越長，分子自擴(kuò)散作用越強(qiáng)，從而導(dǎo)致橫向弛豫時(shí)間的延長。油脂的自擴(kuò)散作用比水分弱，因此在0.35 ms內(nèi)，回波時(shí)間的變化并不會對脂肪弛豫時(shí)間和峰面積產(chǎn)生顯著影響。如圖1B所示，隨著回波時(shí)間的延長，弛豫區(qū)間逐漸增大，同時(shí)衰減曲線的最終信號幅值減小，王志永等的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究中回波時(shí)間為0.1 ms時(shí)，樣品的信號幅值衰減至177.76，回波時(shí)間為0.35 ms時(shí)，樣品的信號幅值衰減至57.44?；夭〞r(shí)間為0.3 ms之后最終信號衰減幅值不再發(fā)生顯著變化，并且峰面積穩(wěn)定性較好，RSD為1.14%，因此選擇回波時(shí)間為0.3 ms。

圖1 回波時(shí)間對T2（A）和CPMG回波衰減曲線（B）的影響Fig.1 Effect of echo time on T2 (A) and CPMG echo decay curves (B)

2.1.2 重復(fù)掃描次數(shù)

重復(fù)掃描次數(shù)對樣品的有直接的影響，重復(fù)掃描次數(shù)越多，越高。如圖2A所示，弛豫時(shí)間在20 ms后開始出現(xiàn)脂肪峰，重復(fù)掃描次數(shù)與脂肪峰面積之間存在良好的線性關(guān)系（=153.42+0.469 4），為1.000。隨重復(fù)掃描次數(shù)增加，由最初的49.91增加至180.97（圖2B）。本研究中，雖然重復(fù)掃描128 次會顯著提高，但掃描次數(shù)過多會導(dǎo)致磁體發(fā)熱，引起樣品溫度升高，從而改變弛豫特性，并且花費(fèi)更長的檢測時(shí)間。因此，本研究選擇重復(fù)掃描次數(shù)64 次，此時(shí)穩(wěn)定的弛豫特性能夠滿足測定樣品的需求，脂肪峰面積RSD僅為0.28%。

圖2 重復(fù)掃描次數(shù)對T2（A）和RSN（B）的影響Fig.2 Effect of number of scanning cycles on T2 (A) and signal-to-noise ratio (RSN) (B)

2.2 樣品參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 樣品質(zhì)量

不同質(zhì)量樣品對脂肪弛豫特性有顯著影響，結(jié)果見表1，其中為脂肪峰面積，是樣品中脂肪的弛豫時(shí)間。隨樣品質(zhì)量的增大呈線性增加，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999 2。隨著樣品質(zhì)量增加也會發(fā)生后移，并且樣品質(zhì)量越大，的穩(wěn)定性越好（RSD越小）。當(dāng)樣品質(zhì)量為4.055～5.017 g時(shí)，各項(xiàng)弛豫特性均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，同時(shí)也顯著高于低質(zhì)量樣品，此結(jié)果與Keeton等研究結(jié)論一致，因此，本研究脂肪含量測定選擇豬肉樣品質(zhì)量為4 g。

表1 樣品質(zhì)量對RSN及脂肪弛豫特性的影響Table 1 Effect of sample mass on RSN and relaxation characteristics of fat

2.2.2 烘干時(shí)間

為消除水分信號的干擾，本研究對豬肉樣品進(jìn)行烘干處理。烘干時(shí)間長短直接影響脂肪測定時(shí)間效率，同時(shí)烘干時(shí)間也顯著影響樣品弛豫特性。從圖3可以看出，鮮肉樣品（烘干0 h）中存在3 個(gè)弛豫峰，其中為結(jié)合水，為不易流動水和脂肪，為自由水。烘干2 h后，由開始的3 個(gè)弛豫峰減少為2 個(gè)，這可能是因?yàn)闇囟壬呤辜≡w維蛋白變性，破壞了水與蛋白質(zhì)間的氫鍵及蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合水的流動性變強(qiáng)，而具有較高自由度的不易流動水從凝膠體系中脫離出來形成自由水，導(dǎo)致水分蒸發(fā)，即自由水消失，此時(shí)的2 個(gè)峰分別表示未烘干的水分（′）和脂肪（′）。姜秀麗等研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)烘干一定時(shí)間后，不易流動水峰面積顯著降低，同時(shí)分裂出一個(gè)與水分變化關(guān)系并不明顯的峰，即為脂肪峰。當(dāng)樣品烘干4 h后脂肪峰（′）面積不再發(fā)生顯著變化。繼續(xù)烘干到6 h，′峰面積占比達(dá)52.18%，此時(shí)峰面積穩(wěn)定性良好，RSD為3.07%。隨著烘干時(shí)間繼續(xù)延長，′峰又向左移動且峰面積逐漸減小，樣品中的弱結(jié)合水不斷減少，但脂肪峰（′）基本不變，弛豫區(qū)間在31.178～691.588 ms內(nèi)。為了保證樣品中脂肪和水分的充分分離，獲得穩(wěn)定的脂肪峰面積，本研究選擇烘干6 h。

圖3 烘干時(shí)間對T2譜圖的影響Fig.3 Effect of drying time on T2 relaxation spectra

2.2.3 樣品檢測溫度

從圖4可以看出，隨著溫度的升高，脂肪弛豫時(shí)間逐漸后移，峰面積呈先上升后下降的趨勢，在40 ℃時(shí)峰面積顯著高于其他溫度。脂肪弛豫時(shí)間延后主要是由于溫度的升高使樣品內(nèi)部油脂的熱運(yùn)動性加強(qiáng)導(dǎo)致，脂肪峰面積先上升后下降主要是樣品溫度對分子結(jié)構(gòu)和相態(tài)產(chǎn)生影響。陳芳宇等在巧克力熔化過程弛豫特性變化研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，液體油脂峰逐漸后移，且峰面積逐漸增大，達(dá)到一定溫度后開始下降。由于豬脂肪熔點(diǎn)為27.5～48.4 ℃，為保證樣品油脂內(nèi)部狀態(tài)一致，樣品檢測溫度確定為50 ℃。

圖4 樣品檢測溫度對弛豫特性的影響Fig.4 Effect of detection temperature on relaxation characteristics

2.3 方法驗(yàn)證

在上述研究獲得的檢測參數(shù)下，即樣品質(zhì)量4 g、烘干時(shí)間6 h、樣品檢測溫度50 ℃、回波時(shí)間0.3 ms、重復(fù)掃描次數(shù)64 次，對方法的重復(fù)性和精密度進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3.1 重復(fù)性

針對不同脂肪含量的豬肉進(jìn)行低場核磁信號采集，其脂肪峰基本重合（圖5），并且能夠獲得穩(wěn)定的脂肪峰面積（，表2），多次檢測結(jié)果的RSD分別為2.72%、2.44%、1.69%，說明在該檢測條件下能夠保證檢測結(jié)果的良好重復(fù)性。

表2 樣品脂肪峰面積的重復(fù)性Table 2 Repeatability RSD of peak area (Afat)

圖5 重復(fù)性驗(yàn)證樣品的弛豫譜圖Fig.5 Relaxation spectra showing good repeatability of the LF-NMR method

2.3.2 精密度

如表3、4所示，日內(nèi)精密度分別在一天中的早、中、晚進(jìn)行驗(yàn)證，日間精密度分別在第1、3、5天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，脂肪峰面積的日內(nèi)、日間精密度RSD分別為3.07%和2.57%，說明該方法具有良好的精密度。

表3 樣品脂肪峰面積的日內(nèi)精密度Table 3 Intra-day precision of Afat

表4 樣品脂肪峰面積的日間精密度Table 4 Inter-day precision of Afat

2.4 豬肉中脂肪含量測定

不同物種油脂中氫質(zhì)子密度不同，因此不同物種油脂含量測定時(shí)，應(yīng)采用相應(yīng)物種純油脂標(biāo)準(zhǔn)樣品。Li Yuntong等在對燕麥中脂肪含量定量時(shí)也以燕麥中提取的脂肪作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。本方法中脂肪含量測定用純豬油作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。如圖6所示，弛豫時(shí)間1 ms出現(xiàn)的峰，可能是由大分子結(jié)構(gòu)和與其緊密結(jié)合的質(zhì)子產(chǎn)生，長弛豫的脂肪峰（）隨著豬油質(zhì)量的增加而不斷增大。以豬油質(zhì)量為自變量，脂肪峰面積為因變量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為=66 292-70.693（=0.999 9），結(jié)果顯示，在0.011 1～0.977 2 g的范圍內(nèi)，豬油質(zhì)量與脂肪峰面積具有很好的線性關(guān)系。

圖6 不同質(zhì)量豬油T2弛豫譜圖Fig.6 T2 relaxation spectra for different masses of lard

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測豬肉樣品中脂肪質(zhì)量，從而計(jì)算出脂肪含量。如表5所示，低場核磁法測得的脂肪含量結(jié)果具有更好的重復(fù)性。S?rland等研究發(fā)現(xiàn)，索氏抽提法和梯度場低場核磁法測定脂肪含量結(jié)果相關(guān)性為0.975，本研究中索氏抽提法和低場核磁法測得的結(jié)果也顯著相關(guān)（＜0.05），達(dá)到0.999 5（=0.962 1+0.416 6），絕對誤差在0.15%～0.39%內(nèi)。本研究結(jié)果表明，低場核磁法能夠?qū)崿F(xiàn)豬肉中脂肪含量的準(zhǔn)確測定。

表5 低場核磁法和索氏抽提法檢測脂肪含量Table 5 Measured fat contents in pork by LF-NMR and Soxhlet extraction method

3 結(jié)論

使用烘干法分離豬肉中水分和脂肪的低場核磁信號，并對回波時(shí)間、重復(fù)掃描次數(shù)等信號采集參數(shù)，樣品質(zhì)量、烘干時(shí)間、檢測溫度等樣品參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定基于LF-NMR技術(shù)的豬肉中脂肪含量測定方法，并對方法的重復(fù)性及精密度進(jìn)行考察。結(jié)果表明，4 g肉糜烘干6 h后，在檢測溫度50 ℃、回波時(shí)間0.3 ms、重復(fù)掃描次數(shù)64 次的條件下，以純豬油為標(biāo)準(zhǔn)樣品，能夠?qū)崿F(xiàn)豬肉中脂肪含量的準(zhǔn)確定量。該方法綠色、安全，并顯著提高檢測效率，在畜禽肉脂肪含量快速準(zhǔn)確定量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。