李恩靜，王 丹，薛晨玉，楊紅蓮，耿健強，穆同娜，吳燕濤，呂 瑩

（1.北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100094；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

嬰幼兒配方乳粉是以乳類及乳蛋白制品為主要蛋白來源，加入適量的維生素、礦物質(zhì)和（或）其他輔料，僅用物理方法生產(chǎn)加工制成的產(chǎn)品，其能量和營養(yǎng)成分能夠部分滿足初生至3 周歲嬰幼兒的成長需要，根據(jù)不同月齡嬰幼兒營養(yǎng)的需求，主要分為嬰兒配方乳粉和較大嬰兒及幼兒配方乳粉。隨著益生菌與嬰幼兒健康關(guān)系研究的不斷深入，嬰幼兒配方乳粉中添加活性益生菌成為一種趨勢。段文鋒等調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市場常見的添加益生菌的嬰幼兒配方乳粉中，50%以上的產(chǎn)品使用了雙歧桿菌，添加最多的是動物雙歧桿菌Bb-12，其次還有動物雙歧桿菌乳亞種HN019、Bi-07和嗜酸乳桿菌NCFM。雙歧桿菌作為一種重要的益生菌，是一種專性厭氧的革蘭氏陽性菌，至今已有大量研究表明雙歧桿菌能夠調(diào)節(jié)嬰幼兒腸道的菌群平衡，改善嬰幼兒的免疫系統(tǒng)，有效促進嬰幼兒正常生長發(fā)育。由于嬰幼兒是特殊的敏感群體，為了規(guī)范菌株使用，2011年原衛(wèi)生部發(fā)布了《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》，明確列出嬰幼兒食品中可使用的菌種名稱及菌株號，截至目前，經(jīng)國家衛(wèi)健委批準可應(yīng)用于嬰幼兒食品的益生菌共13 株11 個菌種，主要以雙歧桿菌和乳桿菌為主。

嬰幼兒配方乳粉中添加益生菌種類的規(guī)定保證了其安全性，而益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)是保證其功能特性的關(guān)鍵因素，嬰幼兒配方乳粉系列食品安全國家標準均對保質(zhì)期內(nèi)產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)目進行了規(guī)定，規(guī)定產(chǎn)品中活菌數(shù)應(yīng)不小于10CFU/g（mL）。針對雙歧桿菌定量檢測的現(xiàn)行有效國家標準采用的是平板計數(shù)法，該方法在實際應(yīng)用中存在耗時長（一般為72 h）、工作量大和操作較繁瑣等缺陷。近年來，以實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）為代表的分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸被廣泛應(yīng)用到益生菌的定量檢測工作中。相比較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，real-time PCR快速、靈敏、特異，但該方法屬于相對定量，結(jié)果的準確性和重復(fù)性在很大程度上依賴于所繪制的標準曲線質(zhì)量及擴增效率，并且需要具備已知濃度的核酸標準品。新興的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）被認為是第3代核酸擴增技術(shù)，通過把稀釋到一定濃度的DNA分子分布到10 000～20 000 個微滴中，使大部分微滴中DNA分子的數(shù)量為1或0，然后通過PCR擴增和陽性信號的累積讀取陽性反應(yīng)單元數(shù)，采集陽性信號與陰性信號的比例，再根據(jù)泊松分布計算出樣本中的DNA分子數(shù)，從而實現(xiàn)對DNA分子的絕對定量。目前該技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多，主要應(yīng)用于食源性致病菌檢測、轉(zhuǎn)基因植物檢測、動物源性成分檢測等方面。國內(nèi)鮮見ddPCR技術(shù)應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中雙歧桿菌檢測的文獻報道，針對現(xiàn)有檢測方法的不足，本研究擬采用ddPCR檢測技術(shù)建立針對嬰幼兒配方食品中常見益生菌的快速準確定量方法，旨在為嬰幼兒配方食品中益生菌的定量檢測提供新的思路，為監(jiān)管部門對益生菌嬰幼兒配方乳粉實現(xiàn)有效監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩歧雙歧桿菌（）CICC6071、嬰兒雙歧桿菌（）CICC6069、青春雙歧桿菌（）CICC6070、發(fā)酵乳桿菌（）CICC21800、德氏乳桿菌保加利亞種（subsp.）CICC6047、副干酪乳桿菌（）CICC20262、唾液乳桿菌（）CICC23174、約氏乳桿菌（）CICC6084、嗜酸乳桿菌（）CICC6081、德氏乳桿菌乳亞種（subsp.）CICC20708、瑞士乳桿菌（）CICC6032、嗜熱鏈球菌（）CICC21728中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；長雙歧桿菌（）CGMCC1.2186、短雙歧桿菌（）CGMCC1.2213 中國普通微生物菌種保藏管理中心；動物雙歧桿菌乳亞種（subsp）Bb-12、動物雙歧桿菌乳亞種（subsp）HN019、鼠李糖乳酪桿菌（）GG為所在實驗室分離菌株。所有冷凍干燥菌株按照各自的指示培養(yǎng)基進行活化，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接傳代3 次后備用。

MRS培養(yǎng)基 美國BD公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS） 美國賽默飛公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）美國Sigma公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K（20 mg/mL）、溶菌酶（50 mg/mL） 北京Tiangen公司；ddPCR反應(yīng)體系有關(guān)試劑 美國伯樂公司；引物、探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Q×200 ddPCR儀 美國伯樂公司；PCR儀 美國ABI公司；高速離心機（轉(zhuǎn)速≥12 000 r/min）、加熱混勻儀 德國Eppendorf公司；BILON-08無菌勻質(zhì)器上海比朗儀器有限公司；Incucell型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國MMM公司；1300 Series A2型生物安全柜 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

1.3.1.1 標準菌株核酸提取

采用改良后的細菌基因組DNA提取試劑盒，將活化后第3代的菌株培養(yǎng)物原液1 mL放置離心機內(nèi)12 000 r/min離心5 min；倒掉上清液，加入溶菌酶200 μL，37 ℃消化1.5 h；加入蛋白酶K 50 μL，細菌基因組DNA提取試劑盒中提供的緩沖液GA 150 μL，56 ℃消化1.5 h。后續(xù)用細菌基因組DNA提取試劑盒進行核酸提取。

1.3.1.2 嬰幼兒配方乳粉樣品核酸提取

參考文獻[21-22]，對嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌基因組DNA的提取方法進行優(yōu)化：將嬰幼兒配方乳粉以質(zhì)量比1∶10溶于0.85%生理鹽水中，取1 mL乳液樣品12 000 r/min離心10 min；去掉上清液及脂肪，加入1 mL PBS溶液12 000 r/min離心5 min；-20 ℃冰箱放置1.5 min，100 ℃加熱混勻儀放置1.5 min，反復(fù)處置樣品6 次；加入200 μL PBS溶液，100 μL蛋白酶K以及1 μL Triton X-100，56 ℃消化1.5 h；12 000 r/min離心5 min去掉上清液，加入200 μL溶菌酶37 ℃消化1.5 h；加入蛋白酶K 50 μL，細菌基因組DNA提取試劑盒中提供的緩沖液GA 150 μL，56 ℃消化1.5 h。后續(xù)用細菌基因組DNA提取試劑盒進行核酸提取。

1.3.2 ddPCR體系及檢測

配制ddPCR體系，體系為2×探針法ddPCR預(yù)混液10 μL，將引物稀釋到10 μmol/L，取2.25 μL上下游引物和1.0 μL探針加入體系，加入2 μL的模板，最后用滅菌雙蒸水補足20 μL。

將充分混勻的ddPCR體系轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中，并向微滴發(fā)生卡中加入70 μL微滴發(fā)生專用油，將微滴發(fā)生卡放到微滴發(fā)生器中進行反應(yīng)。隨后將生成的40 μL微滴液轉(zhuǎn)移到ddPCR的96 孔板中，用封膜儀對96 孔板封膜，準備進行ddPCR。

ddPCR程序：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行43 個循環(huán)；98 ℃固化微滴10 min。

ddPCR結(jié)束后將96 孔板放入QX200 Droplet Reader儀器中，依次錄入樣品信息，根據(jù)Quantasoft軟件計算出最終結(jié)果（copies/20 μL）。

1.3.3 引物探針設(shè)計及特異性實驗

查閱文獻[23]篩選出的雙歧桿菌單拷貝特異基因，在基因上設(shè)計引物探針序列，利用Primer Premier 6.0設(shè)計引物探針，并通過Oligo 7.37進行驗證，再進行BLAST在線比對后，設(shè)計出一對引物探針，如表1所示，探針5′端標記FAM，3′端標記BHQ。對7 株雙歧桿菌及10 株近源乳酸菌按照1.3.1.1節(jié)方法進行DNA提取，并對引物探針應(yīng)用ddPCR檢測方法對雙歧桿菌同源及近源菌種進行檢測，驗證引物探針的特異性。

表1 ddPCR引物和探針序列Table 1 Primers and probe sequences used in ddPCR

1.3.4 ddPCR條件優(yōu)化

1.3.4.1 引物及探針濃度優(yōu)化實驗

設(shè)置3 組待優(yōu)化的上下游引物及探針濃度，如表2所示，以動物雙歧桿菌乳亞種HN019的DNA為模板，使用上述篩選得出的一對引物探針對3 組濃度分別參照1.3.2節(jié)進行ddPCR檢測，根據(jù)微滴檢測儀生成的結(jié)果，篩選出最優(yōu)的引物探針ddPCR濃度。

表2 3 組引物探針濃度Table 2 Three groups of primer and probe concentration nmol/L

1.3.4.2 ddPCR退火溫度優(yōu)化實驗

在設(shè)計ddPCR擴增的反應(yīng)程序時，以動物雙歧桿菌乳亞種HN019的DNA為模板，使用上述篩選得出的一對引物探針和相應(yīng)濃度，以1.3.2節(jié)的ddPCR體系為基礎(chǔ)，對ddPCR退火溫度進行優(yōu)化。設(shè)置退火溫度為53、53.5、54、55、56、58 ℃梯度ddPCR，根據(jù)微滴檢測儀生成的結(jié)果篩選出最佳退火反應(yīng)溫度。

1.3.5 雙歧桿菌純培養(yǎng)液的平板計數(shù)及ddPCR檢測

1.3.5.1 平板計數(shù)

對動物雙歧桿菌乳亞種HN019培養(yǎng)物原液選取合適稀釋度進行平板計數(shù)，依據(jù)GB 4789.34—2016《食品微生物學(xué)檢驗 雙歧桿菌檢驗》方法，每個稀釋度做2 個平皿，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落生長情況。選取菌落數(shù)在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)，每個稀釋度菌落數(shù)應(yīng)取2 個平板計數(shù)結(jié)果的平均值。

1.3.5.2 雙歧桿菌培養(yǎng)液ddPCR檢測

將37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h的動物雙歧桿菌乳亞種HN019培養(yǎng)物原液至10稀釋菌液，應(yīng)用1.3.2.1節(jié)方法提取DNA，應(yīng)用已建立的ddPCR檢測方法進行檢測，每個濃度梯度檢測重復(fù)3 次，借助SPSS 14.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。靈敏度根據(jù)拷貝數(shù)定量出的菌液濃度，同時與平板計數(shù)方法測定結(jié)果比較，確定定量范圍，并得到檢測限。

ddPCR 可直接測得每反應(yīng)的目標基因拷貝數(shù)（copies/20 μL），ddPCR的拷貝數(shù)與對應(yīng)菌懸液濃度的換算關(guān)系公式如下：

式中：為根據(jù)ddPCR 拷貝數(shù)換算得到菌懸液的濃度/（CFU/mL）；為ddPCR中20 μL體系的拷貝數(shù)/（copies/20 μL）；為DNA提取最終的定容體積/μL；為DNA提取的菌懸液體積/mL；為ddPCR反應(yīng)體系中DNA模板體積/μL。

1.3.6 模擬雙歧桿菌嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計數(shù)及ddPCR檢測

稱取未添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉5 g，置于裝有44 mL生理鹽水的均質(zhì)袋內(nèi)，將37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h的雙歧桿菌HN019菌懸液10～10稀釋度菌液各1 mL，至于均質(zhì)袋中，用拍擊式勻漿器拍擊2 min，制成質(zhì)量比為1∶10的樣品勻液，各添加水平分別設(shè)3 個樣品重復(fù)，另取1 份無菌稱樣5 g嬰兒乳粉樣品加入45 mL生理鹽水，代替添加菌液作為陰性對照品，將以上5 個濃度添加水平的嬰兒配方乳粉樣品溶液，分別梯度稀釋進行平板計數(shù)方法檢測。同時取各樣品溶液各1 mL用1.3.1.2節(jié)方法提取DNA，最終將核酸溶解在100 μL TE緩沖液中，并進行ddPCR檢測。ddPCR對樣品的檢測結(jié)果對應(yīng)的菌液濃度可由1.3.5.2節(jié)公式換算得到，將其定量結(jié)果與平板計數(shù)定量結(jié)果進行比較。

1.3.7 實際嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計數(shù)及ddPCR檢測

對市售10 份不同廠家的添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉樣品，應(yīng)用1.3.1.2節(jié)方法提取基因組DNA并進行ddPCR定量檢測，每個樣品取2 個平行樣品，每個平行樣品做3 次重復(fù)，同時對樣品應(yīng)用平板計數(shù)方法定量檢測，比較2 種方法的定量結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性驗證

以7 株雙歧桿菌及10 株近源乳酸菌培養(yǎng)物原液提取的DNA為模板，應(yīng)用表1中的雙歧桿菌引物探針進行ddPCR擴增，結(jié)果如圖1所示，7 株雙歧桿菌均出現(xiàn)藍色的陽性油滴信號，其他10 株乳酸菌均未擴增呈陰性，為灰色油滴信號，表明選取的雙歧桿菌引物探針特異性較好，能夠滿足雙歧桿菌的檢測。

圖1 引物探針特異性驗證Fig.1 Specificity evaluation of primers and probes

2.2 引物探針濃度優(yōu)化結(jié)果

以動物雙歧桿菌乳亞種HN019的DNA為模板，對3 組引物探針濃度進行ddPCR擴增，結(jié)果如圖2所示，3 組濃度的ddPCR擴增熒光信號強度無明顯差異，陰陽性微滴之間的熒光振幅差異不明顯，故選擇最適合實際應(yīng)用的引物探針濃度為第3組：500、500、250 nmol/L。

圖2 引物探針濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of primer and probe concentration

2.3 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

選擇ddPCR擴增體系的退火溫度53、53.5、54、55、56、58 ℃進行優(yōu)化實驗，結(jié)果如圖3所示，退火溫度在53～58 ℃范圍內(nèi)均有熒光信號被檢出，陰陽性微滴有明顯分界，且陰陽性油滴之間的擴增振幅逐漸增大，在58 ℃達到最大擴增振幅，且在此溫度條件下陰陽性油滴間的彌散油滴數(shù)量適中，表明ddPCR非特異擴增較少，故選擇58 ℃作為反應(yīng)最佳退火溫度。

圖3 退火溫度優(yōu)化Fig.3 Optimization of annealing temperature

2.4 雙歧桿菌純培養(yǎng)液的ddPCR檢測及平板計數(shù)

對雙歧桿菌純培養(yǎng)液進行梯度稀釋并應(yīng)用平板計數(shù)方法，得到原始菌液濃度為1.1×10CFU/mL，其對數(shù)值為8.05。ddPCR對原始菌液梯度稀釋至10檢測，ddPCR在10稀釋度模板濃度過高，達到檢測上限，無陰性油滴，儀器無法推算模板濃度，需要適當稀釋才能確定，在10稀釋度由于模板濃度過低，達到檢測下限，無陽性油滴，儀器無法推算模板濃度。如圖4所示，10～10稀釋度菌液ddPCR均能檢測到陽性及陰性油滴。如表3所示，ddPCR檢測得到原菌懸液定量對數(shù)值在8.13～8.47（lg（CFU/mL））之間，CV值在4.31%～12.76%之間，均小于20%，重復(fù)性較好，且與平板計數(shù)測定值相差在0.5（lg（CFU/mL））值之間，偏差小于10%（表3），與平板計數(shù)定量結(jié)果一致性較好。在10稀釋度菌液達到ddPCR方法的檢出限，菌液定量結(jié)果為296 CFU/mL。

圖4 梯度稀釋純菌液ddPCR擴增Fig.4 ddPCR amplification results of gradient dilutions of pure bacterial culture

表3 純菌液ddPCR定量Table 3 Quantitative results of pure bacterial culture by ddPCR

2.5 模擬雙歧桿菌嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計數(shù)及ddPCR檢測

10～10稀釋度菌懸液添加水平的嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計數(shù)結(jié)果分別為3.5×10、3.6×10、4.3×10、3.3×10、3.8×10CFU/g。同時ddPCR方法對于加入嬰幼兒配方乳粉食品基質(zhì)的雙歧桿菌定量結(jié)果由表4所示，分別為2.76×10、3.38×10、6.57×10、4.56×10、7.30×10CFU/g，在10～10CFU/g樣品濃度范圍中測定結(jié)果CV值在3.92%～15.80%之間，重復(fù)性較好，與平板計數(shù)定量對數(shù)值偏差范圍在1.37%～7.80%之間，偏差小于10%，與平板計數(shù)定量結(jié)果一致性較好，模擬樣品的檢出限為7.30×10CFU/g。

表4 模擬雙歧桿菌樣品ddPCR及平板計數(shù)定量Table 4 Quantitative results of simulated samples by ddPCR and plate counting method

2.6 實際嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計數(shù)及ddPCR檢測

對市售不同廠家僅含有雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉進行雙歧桿菌平板計數(shù)定量檢測，檢測結(jié)果顯示，活菌數(shù)均不小于10CFU/g，符合產(chǎn)品標準要求，與標簽標識相符。同時應(yīng)用已建立的ddPCR方法進行檢測，結(jié)果如表5所示，樣品定量檢測結(jié)果均大于10CFU/g，且ddPCR定量值與平板計數(shù)定量值相差在0.5（lg（CFU/g））值之間，偏差小于10%，結(jié)果一致性較好。由此可知本研究所建立的對嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌的ddPCR定量檢測方法可應(yīng)用于實際樣品的雙歧桿菌的定量檢測。

表5 市售樣品ddPCR及平板計數(shù)檢測Table 5 Quantitative results of commercial samples by ddPCR and plate counting method

3 討論

近年來，ddPCR檢測技術(shù)因其靈敏度高、快速等優(yōu)點在食品檢測中應(yīng)用日益增多。魏永新等利用ddPCR技術(shù)對食品中O157∶H7進行檢測，細菌純培養(yǎng)液中最低定量為10CFU/mL，人工污染三文魚樣品中檢出限為110 CFU/g；劉洋等基于ddPCR技術(shù)建立飲料中嗜酸乳桿菌的定量檢測方法，方法靈敏度達到0.25 pg/μL，重復(fù)性的相對標準偏差在2.34%～6.10%之間；Hansen等報道了PMA結(jié)合基因芯片dPCR技術(shù)同時檢測混菌樣品中NCFM和subsp.Bl-04的活菌數(shù)量，相對標準偏差分別為5%和4%，顯著優(yōu)于平板計數(shù)法（15%），可見該方法精確度高，穩(wěn)定性強。

本研究利用雙歧桿菌特異性引物建立ddPCR定量檢測方法，并對模擬和市售添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉進行測定。首先查閱文獻確定雙歧桿菌特異性單拷貝基因，并設(shè)計特異性引物探針，避免了多拷貝基因由于定量拷貝數(shù)的變化而使得ddPCR檢測結(jié)果準確度降低的問題。其次獲得高質(zhì)量及準確濃度的模板DNA是ddPCR準確定量的決定因素，由于雙歧桿菌是革蘭氏陽性菌、細胞壁不易破碎，且嬰幼兒配方乳粉含有大量蛋白質(zhì)分子且成分復(fù)雜，對提取高質(zhì)量的模板DNA增加難度，因此分別對雙歧桿菌DNA和嬰幼兒配方乳粉中的雙歧桿菌提取方法進行優(yōu)化；最后由于ddPCR檢測原理是將陽性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)用泊松分布公式計算出DNA分子的拷貝數(shù)，因此陰陽性油滴之間的熒光振幅能夠在一定程度上反映出ddPCR方法的準確性和擴增效率，而ddPCR條件的退火溫度及ddPCR中引物探針的濃度，都會對熒光振幅產(chǎn)生影響，由此對這2 個參數(shù)進行優(yōu)化，建立嬰幼兒配方乳粉中ddPCR定量檢測雙歧桿菌的快速檢測方法。

本研究將ddPCR檢測方法應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉中的雙歧桿菌檢測，所建立的ddPCR檢測方法對雙歧桿菌菌純培養(yǎng)液的檢出限為296 CFU/mL，模擬樣品檢出限為7300 CFU/g，CV值均小于20%，重復(fù)性較好。對市售添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉樣品進行檢測，表明ddPCR檢測方法和平板計數(shù)檢測方法檢測定量偏差小于10%，結(jié)果一致性較好?，F(xiàn)行有效的食品中雙歧桿菌定量檢測方法為平板計數(shù)法，一般檢驗周期為3 d左右，本研究所建立的方法可將檢驗周期減少至1 d左右，且具有特異性好、準確度高等優(yōu)點，適用于嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌的定量檢測工作。由于嬰幼兒配方食品基質(zhì)復(fù)雜，且不同生產(chǎn)廠家的嬰幼兒配方食品中添加的原輔材料多有差異，可能影響雙歧桿菌DNA模板提取效果，進而對ddPCR檢測準確度有一定影響，未來還需要對不同嬰幼兒配方食品基質(zhì)中的雙歧桿菌提取方法進行研究，研究出更簡便、高效的提取方法，以適應(yīng)于嬰幼兒配方食品的益生菌定量檢測的快速檢測要求。