崇慧影，潘紹佐，李冰晶，劉國(guó)華，王代波

（1.貴州省生物研究所，貴陽(yáng) 550009；2.三都水族自治縣九阡鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)綜合服務(wù)中心，貴州 黔南 558113）

九阡李（Prunus salicinaLindl.）為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Pnmoideae）李屬（PrunusLinn.）李［1］，是貴州省獨(dú)有的地方早熟優(yōu)良李品種［2-4］，因產(chǎn)地九阡鎮(zhèn)而得名［5］。其因果實(shí)色澤鮮艷［6］、風(fēng)味獨(dú)特［7］、早熟而聞名省內(nèi)外［8］。地方政府于2000年開(kāi)始重視九阡李種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［9］，種植面積曾達(dá)933 hm2，后由于缺乏科學(xué)的育苗及栽培管理技術(shù)［10］，經(jīng)濟(jì)效益沒(méi)有達(dá)到預(yù)期，面臨低產(chǎn)低效問(wèn)題，目前種植面積減至400 hm2。果實(shí)中的有機(jī)酸［11］及氨基酸是決定果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)的重要指標(biāo)，它的組成類(lèi)型、比例與果實(shí)酸味、口感密切相關(guān)［12］。有學(xué)者指出李屬果實(shí)含有多種有機(jī)酸和氨基酸，多以蘋(píng)果酸［13］、奎寧酸［14］、琥珀酸［15］中的1種或2種為主要有機(jī)酸［16］，氨基酸以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸［17，18］為主，但九阡李果實(shí)中有機(jī)酸及氨基酸在發(fā)育期的變化規(guī)律鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。筆者以九阡李為試驗(yàn)材料，研究其果實(shí)發(fā)育期有機(jī)酸及氨基酸的變化規(guī)律，旨在為今后九阡李果實(shí)品質(zhì)及其風(fēng)味的形成機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為科學(xué)栽培管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料取自九阡李產(chǎn)地貴州省三都縣九阡鎮(zhèn)水昔村山地果園10年生九阡李樹(shù)，果園面積0.67 hm2，海拔660 m，隨機(jī)選定3株果樹(shù)，從樹(shù)冠外圍的東、南、西、北、中5個(gè)方位各選取形態(tài)和成熟度相近的果實(shí)5枚［19］，自幼果期3月10日開(kāi)始采樣到果實(shí)成熟，15 d采樣1次，至果實(shí)成熟，共采樣5次。1.1.2主要試劑有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；氨基酸混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）；色譜級(jí)乙腈，德國(guó)默克公司；醋酸鈉、三乙胺等試劑為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備TG-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；FA1204型電子天平，上海衡際科學(xué)儀器有限公司；CHA-2型氣浴恒溫?fù)u床，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品公司；PS40A型超聲清洗儀，深華泰科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀：美國(guó)Waters 2695，配置Waters2998檢測(cè)器、安捷倫1260液相色譜串聯(lián)AB4000型質(zhì)譜儀、水浴氮吹儀，上海那艾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC法檢測(cè)九阡李果實(shí)發(fā)育期有機(jī)酸的含量準(zhǔn)確稱取樣品約1 g，加入4倍體積的0.2 mol/L偏磷酸溶液；冰水浴超聲30 min，12 000 g離心5 min，取上清液，定容至5 mL；取1 mL提取液，過(guò)0.22 μm水相濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為Polaris 180A C18-A（250.0mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.2.2 LC-MS法檢測(cè)九阡李果實(shí)發(fā)育期氨基酸的含量準(zhǔn)確稱量0.5 g樣品；加入0.001 mol/L HCl的20%乙 醇 溶 液3 mL；低 溫 水 浴 超 聲30 min，4℃12 000 g離心5 min，取上清液，沉淀加入1 mL提取液重新提取2次；合并3次上清液，定容至6 mL；吸取1 mL液體，過(guò)0.22 μm水相濾膜，置于-20℃冰箱待上機(jī)檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為Polaris 180A C18-A（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)育期主要有機(jī)酸的含量變化

2.1.1 發(fā)育期有機(jī)酸的檢測(cè)分析采用HPLC法對(duì)九阡李果實(shí)樣品進(jìn)行有機(jī)酸檢測(cè)，共檢測(cè)出5種有機(jī)酸，分別是琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、富馬酸、蘋(píng)果酸。在九阡李5個(gè)發(fā)育時(shí)期內(nèi)，有機(jī)酸平均含量最高為奎寧酸，達(dá)93.56 μg/g，其次為琥珀酸，平均含量為44.61 μg/g。莽草酸、蘋(píng)果酸、富馬酸平均含量較低，分別為2.03、0.64、1.40 μg/g（表1）。從有機(jī)酸平均含量來(lái)看，奎寧酸占總有機(jī)酸含量的65.78%，琥珀酸占總有機(jī)酸含量的31.36%。從有機(jī)酸積累量來(lái)看，成熟期果實(shí)5種有機(jī)酸積累量含量高低表現(xiàn)為奎寧酸＞琥珀酸＞富馬酸＞莽草酸＞蘋(píng)果酸，奎寧酸占總有機(jī)酸含量的64.35%，琥珀酸占總有機(jī)酸含量的33.16%，含量明顯高于富馬酸、莽草酸、蘋(píng)果酸，這3種有機(jī)酸僅占總有機(jī)酸含量的2.49%。

表1 有機(jī)酸含量測(cè)定

2.1.2 發(fā)育期主要有機(jī)酸的含量變化分析如圖1所示，在九阡李果實(shí)發(fā)育初期到中期奎寧酸含量逐漸減少，發(fā)育后期奎寧酸含量急劇增高達(dá)到峰值，至成熟期其含量減少至發(fā)育初期含量水平，奎寧酸含量在果實(shí)發(fā)育期有明顯變化，但成熟期奎寧酸含量與幼果期含量無(wú)明顯變化。琥珀酸在九阡李果實(shí)發(fā)育期內(nèi)含量變化整體呈先緩慢降低再緩慢升高再緩慢降低的趨勢(shì)，與奎寧酸不同，琥珀酸在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期雖有變化，但整體波動(dòng)不大，同樣在發(fā)育后期含量達(dá)到峰值（圖2）。

圖1 奎寧酸含量變化

圖2 琥珀酸含量變化

2.2 發(fā)育期氨基酸的含量變化分析

九阡李發(fā)育過(guò)程中的氨基酸含量變化如表2所示，九阡李供試樣品中共檢測(cè)出22種氨基酸，包括8種必需氨基酸。這22種氨基酸在九阡李發(fā)育過(guò)程中呈5種變化趨勢(shì)：同型半胱氨酸在九阡李果實(shí)整個(gè)發(fā)育期內(nèi)含量基本沒(méi)有變化，S-腺苷甲硫氨酸在發(fā)育期內(nèi)含量呈先升后降的趨勢(shì)，谷氨酸在發(fā)育期內(nèi)呈升-降-升-降的變化趨勢(shì)，纈氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸5種氨基酸在發(fā)育期內(nèi)呈升-降-升的變化趨勢(shì)，其余14種氨基酸呈升-降的變化趨勢(shì)。22種氨基酸在九阡李整個(gè)發(fā)育期內(nèi)，平均含量高低表現(xiàn)為天冬酰胺＞谷氨酰胺＞脯氨酸＞纈氨酸＞異亮氨酸＞絲氨酸＞γ-氨基丁酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞組氨酸＞谷氨酸＞丙氨酸＞色氨酸＞蘇氨酸＞苯丙氨酸＞酪氨酸＞精氨酸＞賴氨酸＞甘氨酸＞S-腺苷甲硫氨酸＞甲硫氨酸＞同型半胱氨酸，其中，前8種氨基酸含量＞100 μg/g，中間11種氨基酸含量處于10?100 μg/g，后3種氨基酸含量＜10 μg/g。天冬酰胺在整個(gè)發(fā)育周期內(nèi)平均含量遠(yuǎn)高于其他21種氨基酸，平均含量達(dá)1 797.30 μg/g。九阡李成熟期氨基酸含量達(dá)100 μg/g以上的有天冬酰胺（641.62 μg/g）＞脯氨酸（396.62 μg/g）＞絲氨酸（151.86 μg/g）＞天冬氨酸（116.98 μg/g）＞纈氨酸（100.51 μg/g）。天冬酰胺、脯氨酸在總氨基酸中占比分別為33.69%、20.82%，為主要氨基酸。

表2 氨基酸含量測(cè)定 （單位：μg/g）

3 小結(jié)與討論

果實(shí)有機(jī)酸組成與含量受基因控制［20］及果實(shí)發(fā)育的調(diào)控［21］，還與其他環(huán)境因子有關(guān)。李屬果實(shí)大部分以蘋(píng)果酸為主要有機(jī)酸，而在歐洲李（Prunus domesticaL.）果實(shí)中奎寧酸含量最高，本試驗(yàn)采用HPLC法在九阡李果實(shí)中檢測(cè)出5種有機(jī)酸，其中奎寧酸、琥珀酸含量遠(yuǎn)高于其他3種有機(jī)酸，奎寧酸含量占總有機(jī)酸含量的64.35%，確定九阡李是以奎寧酸、琥珀酸為主要有機(jī)酸，這可能是導(dǎo)致九阡李相較于其他李品種具有獨(dú)特風(fēng)味的主要原因，例如貴州省優(yōu)異李品種蜂糖李為蘋(píng)果酸型?？鼘幩岷顽晁岷靠傮w都呈降-升-降的變化趨勢(shì)，皆在果實(shí)發(fā)育后期達(dá)到峰值，成熟期有機(jī)酸含量降低是由于有機(jī)酸作為糖酵解、三羧酸循環(huán)（TCAC）及糖異生作用的基質(zhì)被消耗［22］，有機(jī)酸在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中是果實(shí)品質(zhì)形成的基礎(chǔ)物質(zhì)和代謝能量保障［23］。通過(guò)LCMS法檢測(cè)九阡李果實(shí)在發(fā)育期內(nèi)的氨基酸含量，測(cè)出22種氨基酸，這些氨基酸在九阡李發(fā)育期內(nèi)含量變化差異明顯，共出現(xiàn)5種變化規(guī)律。其中，天冬酰胺、脯氨酸含量豐富，占總氨基酸含量的54.51%，證明九阡李區(qū)別于大多數(shù)以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸為主要氨基酸的果樹(shù)品種，天冬酰胺含量呈現(xiàn)出在果實(shí)發(fā)育前期快速增長(zhǎng)，之后逐漸降低的變化趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楣麑?shí)發(fā)育中期受有機(jī)酸快速積累的影響。而脯氨酸也在發(fā)育前期迅速積累，發(fā)育中期急劇降低后又迅速積累至果實(shí)成熟。