廖 茜，陳 煒，于雪梅，卿 清

(四川綿陽(yáng)四○四醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 綿陽(yáng) 621000)

卵巢癌是特發(fā)于女性卵巢的惡性腫瘤，在50歲以上女性中尤為常見，約占女性癌癥的3.4%，主要(約占90%)以上皮型為主[1-2]。卵巢癌患者早期缺乏特異性癥狀，確診時(shí)多處于中晚期，其病死率位列乳腺癌和宮頸癌之后，是第三大致命的婦科惡性腫瘤[1-2]。卵巢癌治療以手術(shù)治療和化療為主，臨床常用的化療藥物為紫杉類藥物(如紫杉醇、多西他賽)，但化療藥物常有骨髓抑制、過(guò)敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性和水鈉潴留等副作用，且易產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果[1,3]。

S100A5是一種鈣結(jié)合蛋白，屬于E-F手型鈣結(jié)合蛋白S100家族成員[4]。目前對(duì)S100A5的生物學(xué)作用了解相對(duì)較少，有研究表明S100A5對(duì)蛋白質(zhì)與Ca2+和Cu2+的結(jié)合具有拮抗作用，且與炎癥和嗅覺(jué)信號(hào)有關(guān)[5-6]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌患者中S100A5表達(dá)量越高，其總生存期越長(zhǎng)[7-9]，提示其可能是卵巢癌的抑制因子。本研究利用外源性S100A5蛋白處理卵巢癌細(xì)胞SKOV3，分析其對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、遷移和侵襲的影響，以進(jìn)一步明確S100A5對(duì)卵巢癌的具體作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自上海蓋寧生物科技有限公司，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。人源重組S100A5蛋白凍干粉購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司，滅菌PBS復(fù)融為終濃度1 mmol/L的儲(chǔ)存液，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。CCK-8試劑購(gòu)自美國(guó)Bimake生物科技有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠(Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD公司；結(jié)晶紫染液購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；所有一抗、內(nèi)參β-actin抗體和HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司。

1.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

在96孔板中按照每孔1 000個(gè)的數(shù)量接種人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，并使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理細(xì)胞，每組5個(gè)重復(fù)孔。分別在24 h、48 h和72 h后徹底吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，CCK-8原液按1∶9的比例稀釋為工作液，每孔加入0.1 mL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，讀取450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

在6孔板中按照每孔800個(gè)的數(shù)量接種人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理7 d后，每孔加入0.1 mL結(jié)晶紫染液染色20 min，掃描成像后采用Image J軟件計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目。

1.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

在6孔板中按照每孔3×105個(gè)的數(shù)量接種人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用10 μL無(wú)菌槍頭沿孔板直徑劃線制造劃痕，使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理0 h和16 h后，于相同位置對(duì)劃痕進(jìn)行成像，采用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度，劃痕愈合率=(0 h寬度-16 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.5 Transwell小室(含基質(zhì)膠)實(shí)驗(yàn)

使用RPMI 1640培養(yǎng)基將基質(zhì)膠原液按1∶5的比例稀釋為工作液，60 μL基質(zhì)膠工作液均勻包被上室，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中使其完全凝固。將含有不同濃度S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)的完全RPMI 1640培養(yǎng)基添加到下室，將400 μL含有2.5×104個(gè)細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)基添加到上室。24 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下成像，采用Image J軟件計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Western blot

將人卵巢癌細(xì)胞SKOV3以1×106個(gè)/瓶的濃度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，使用不同濃度的S100A5蛋白(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)處理36 h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST(5%脫脂奶粉、4 g NaCl、1.214 g Tris-HCl和0.2% Tween-20)封閉2 h，分別用Ki67、PCNA、MMP2、MMP7、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vimentin一抗37 ℃孵育過(guò)夜，HPR標(biāo)記二抗37 ℃孵育1 h，ECL顯影、成像和分析。Quantity One軟件進(jìn)行灰度值定量，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外源性S100A5蛋白抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖具有明顯抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度依耐性(圖1a)。Western blot分析顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白可降低增殖標(biāo)志物Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)水平(圖1b)。克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L組相比，給予不同濃度外源性S100A5蛋白處理后，SKOV3細(xì)胞克隆形成數(shù)目減少(P<0.01)，見圖2。以上結(jié)果表明外源性S100A5蛋白可抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖。

a：外源性S100A5蛋白對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響(CCK-8)；b：外源性S100A5蛋白對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響(Western blot) *：與 0 μmol/L相比，P<0.05；**：與0 μmol/L相比，P<0.01

**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

2.2 外源性S100A5蛋白抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移和侵襲

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白處理組SKOV3細(xì)胞劃痕愈合率下降，遷移能力明顯受抑制(圖3a)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白處理組穿過(guò)基質(zhì)膠(Matrigel)包被小室的侵襲性SKOV3細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01)，見圖3b。以上結(jié)果表明外源性S100A5蛋白可抑制SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲。

a：外源性S100A5蛋白對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移的影響(劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，×40)；b：外源性S100A5蛋白對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲的影響(Transwell小室實(shí)驗(yàn)，×100) *：與0 μmol/L組相比，P<0.05；**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

2.3 外源性S100A5抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中MMP2、MMP7和MMP9蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白可抑制MMPs家族成員MMP2、MMP7和MMP9蛋白表達(dá)水平，見圖4。

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05；**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

2.4 外源性S100A5蛋白抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程

Western blot結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，外源性S100A5蛋白處理組中Vimentin、Snail、N-cadherin蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平上調(diào)。表明外源性S100A5蛋白可能通過(guò)抑制MMPs和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)而抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移和侵襲，見圖5。

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05；**：與0 μmol/L組相比，P<0.01

3 討論

S100蛋白家族是一類小分子鈣結(jié)合蛋白，人S100蛋白家族包括至少21個(gè)成員[4]。幾乎所有S100蛋白家族成員都與腫瘤密切相關(guān)，但各成員在不同類型腫瘤中的具體作用并不盡相同，如S100A2是口腔癌的抑制因子，但卻是肺癌的促進(jìn)因子[10]，S100A7抑制雌激素受體-α陽(yáng)性乳腺癌進(jìn)程，但促進(jìn)雌激素受體-α陰性乳腺癌進(jìn)程[11]。S100A5在腫瘤中的具體作用報(bào)道較少，有研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)S100A5的腦膜瘤患者更不易復(fù)發(fā)或者復(fù)發(fā)時(shí)間延后[12]。另有研究顯示，在卵巢癌中高表達(dá)S100A5的患者具有更為良好的預(yù)后，提示S100A5極可能是卵巢癌的抑制因子[7]。因此，本研究利用外源性S100A5蛋白處理人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，結(jié)果顯示S100A5蛋白可抑制SKOV3的增殖、遷移和侵襲。

核Ki67蛋白主要位于細(xì)胞核，在有絲分裂時(shí)被募集到濃縮染色體，通常僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)，Ki67可獨(dú)立預(yù)測(cè)癌癥進(jìn)展[13]。PCNA是一種重要的蛋白，參與DNA復(fù)制和修復(fù)、姐妹染色單體粘連和能量代謝，并與細(xì)胞存活密切相關(guān)[14]。Ki67和PCNA均是良好的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，也可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，S100A5蛋白可抑制Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)亦表明外源性S100A5蛋白可抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖。

MMPs是一類Zn2+依耐性的內(nèi)肽酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子[8]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞從非運(yùn)動(dòng)性上皮表型向遷移性間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程，其共同特征是上皮E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失，伴隨N-cadherin表達(dá)上調(diào)，增加了腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可賦予腫瘤轉(zhuǎn)移能力，預(yù)示著預(yù)后不良[9,15]。Snail作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中E-cadherin表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子，可使腫瘤保持高度的遷移侵襲能力，并促進(jìn)耐藥性、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[16]。Vimentin作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[17]。本研究結(jié)果顯示，S100A5顯著抑制MMP2、MMP7和MMP9蛋白的表達(dá)水平，有效降低了N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)提高了E-cadherin蛋白的表達(dá)水平。因此，我們推測(cè)外源性S100A5蛋白可能通過(guò)抑制MMPs和逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而降低人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移和侵襲。

綜上，外源性S100A5蛋白極可能是卵巢癌的抑制因子，可抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖、遷移及侵襲。因此，外源性S100A5蛋白可作為一種潛在的治療卵巢癌的方法。