郭 誼,韓 炎,周麗芝,王俊華,馬 躍,魯大鵬
(1.唐山市中醫(yī)醫(yī)院口腔科,河北 唐山063000;2.文安縣醫(yī)院口腔科,河北 廊坊 065800;3.唐山市第八醫(yī)院口腔科,河北 唐山 063000;4.文安縣醫(yī)院心內科,河北 廊坊 065800;5.首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院急診綜合治療中心,北京 100050)
口腔鱗癌是臨床常見的口腔頜面部惡性腫瘤,具有發(fā)病隱匿、惡性程度高、易復發(fā)轉移等特點,嚴重威脅患者生命健康[1]。手術切除、放化療及聯(lián)合治療均是治療口腔鱗癌的常用方法,但患者預后仍較差,5年生存率不足40%[2]。因此,了解口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的潛在機制,找到相關的治療靶點非常重要。PIWI家族在各種生物中的表達具有廣泛保守性,主要參與調控干細胞自我更新、轉座子沉默、基因重組等過程[3]。精原干細胞自我更新基因PIWIL2是PIWI家族的重要成員之一,可介導轉座子活化調控生殖干細胞的自我更新[4]。有研究顯示,PIWIL2可能具有促進腫瘤發(fā)生的潛力[5]。Wang等[6]發(fā)現(xiàn),PIWIL2可預測口腔鱗癌患者的預后及癌前口腔白斑的癌變風險,但PIWIL2在口腔鱗癌中的分子機制尚未完全明確。故本研究探討PIWIL2對口腔鱗癌細胞CAL27增殖、侵襲、遷移和裸鼠皮下移植瘤生長的影響,旨在為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)和該病的治療提供依據(jù)。
細胞與動物:人口腔鱗癌細胞株CAL27(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心);16只BALB/c雄性裸鼠,4~6周齡,體質量18~22 g,由河北省實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(冀)2018-004],飼養(yǎng)于溫度22~25 ℃、相對濕度40%~60%,每12 h光暗交替的環(huán)境中。
主要試劑:PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#和3#,慢病毒陰性對照病毒scramble(上海吉瑪制藥技術有限公司);胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco);TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa);Transwell小室、基質膠(美國BD);JC-1探針、細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司),兔抗Ki67、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、E-cadherin、N-cadherin、Snail抗體,小鼠抗β-actin抗體(美國Abcam)。
儀器:SpectraMax型多功能酶標儀(美國Molecular Devices),CX21BIM-SET5型顯微鏡(日本OLYMPUS),CyFlow Space型流式細胞儀(德國Partec)。
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基復蘇CAL27細胞,取對數(shù)生長期細胞接種于24孔板,將細胞分為空白組(不作處理),陰性對照組(轉染慢病毒陰性對照病毒scramble)和PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#、3#組(轉染PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#、3#),其中慢病毒陰性對照病毒滴度為3×108TU/mL,以感染復數(shù)為50進行轉染,培養(yǎng)72 h后加入1.5 mg/L嘌呤霉素,收集穩(wěn)定低表達PIWIL2的細胞。
收集各組轉染后細胞,加入TRIzol試劑提取總RNA,逆轉錄合成cDNA鏈,再添加SYBR Green PCR Master Mix試劑進行實時熒光定量PCR擴增。反應條件:94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,共38個循環(huán)。以GAPDH為內參,采用2-△△Ct法計算PIWIL2 mRNA的表達水平。PIWIL2上游引物序列為5’-ATCTATATCTGGCTGCTCCTC-3’,下游引物序列為5’-GATGCAAGATGTGTCCTGAC-3’;GAPDH上游引物序列為5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’,下游引物序列為5’-TCCCTCAAGAATGTCAGCAA-3’。
收集各組轉染后細胞,加入細胞裂解液提取總蛋白,定量后取70 μg進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離蛋白后切割目的蛋白處凝膠并轉移至聚偏二氟乙烯膜上,加入封閉液室溫封閉2 h,加入兔抗Ki67、VEGF、E-cadherin、N-cadherin、Snail抗體,小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000),4 ℃下反應過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000),37 ℃下反應1 h,洗膜后進行暗室曝光顯影。以β-actin為內參,目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達水平。
收集各組轉染后細胞,以500個/孔的密度接種于6孔板,培養(yǎng)約2周,每3天更換1次培養(yǎng)基,0.5%結晶紫染色后于光鏡下計數(shù)集落細胞。
預先用基質膠包被Transwell小室上室,收集各組轉染后細胞,用無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為1×105/mL,接種100 μL細胞于小室上室,下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后取出小室,除去上室未侵入細胞,并將侵入細胞于甲醇溶液中固定,0.5%結晶紫染色后于光鏡下計數(shù)染色侵襲細胞。
收集各組轉染后細胞,以1×106/mL的密度接種于6孔板,當細胞貼壁后,用200 μL無菌微量移液管尖端垂直于板底中央劃線,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于0 h、24 h時光鏡下選擇劃痕區(qū)拍照,測量劃痕寬度,計算劃痕愈合率。
收集各組轉染后細胞,以1×104/mL的密度接種于專用培養(yǎng)皿內,培養(yǎng)24 h后,添加500 μL JC-1工作液,繼續(xù)培養(yǎng)20 min,流式細胞儀檢測細胞內熒光情況。
將16只BALB/c裸鼠隨機分為陰性對照組和PIWIL2-shRNA慢病毒組,每組8只。取對數(shù)期細胞,調整細胞濃度為5×109/L,接種于PIWIL2-shRNA慢病毒組裸鼠背部皮下,每只200 μL,構建裸鼠皮下移植瘤模型。每隔5 d測量腫瘤長徑和短徑,計算腫瘤體積。腫瘤體積=長徑×短徑2/2。于第30天處死裸鼠,剝離腫瘤組織,稱重并計算其體積。再將腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定,制備石蠟組織切片,免疫組化染色檢測腫瘤組織中VEGF的陽性表達。
實時熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#和3#組CAL27細胞中PIWIL2 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),以PIWIL2-shRNA慢病毒3#組降低最為顯著(圖1),因此,后續(xù)選擇PIWIL2-shRNA慢病毒3#沉默CAL27細胞中PIWIL2的表達。
a:PIWIL2 mRNA水平比較;b:PIWIL2蛋白表達水平比較 *:與陰性對照組比較,P<0.05
集落形成實驗結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組細胞集落形成率顯著降低(P<0.05),見圖2。
a:集落形成實驗光鏡圖(×200);b:集落形成率定量圖 *:與陰性對照組比較,P<0.05
蛋白印跡法結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組Ki67和VEGF蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見圖3。
a:Ki67和VEGF蛋白電泳圖;b:Ki67和VEGF蛋白表達定量圖*:與陰性對照組比較,P<0.05
Transwell實驗結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05),見圖4。
a:Transwell實驗光鏡圖(×400);b:侵襲細胞數(shù)定量圖 *:與陰性對照組比較,P<0.05
劃痕實驗結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),見圖5。
a:劃痕實驗光鏡圖(×40);b:劃痕愈合率 *:與陰性對照組比較,P<0.05
JC-1探針結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組紅色熒光減少,綠色熒光增多,見圖6。
a:JC-1探針檢測流式圖;b:細胞中紅綠熒光比較
蛋白印跡法結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高,N-cadherin和Snail蛋白表達水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7。
a:蛋白電泳圖;b:蛋白相對表達定量圖 *:與陰性對照組比較,P<0.05
CAL27細胞裸鼠皮下移植瘤模型和免疫組化染色結果顯示,與陰性對照組比較,PIWIL2-shRNA慢病毒組移植瘤重量較輕,腫瘤體積較小,移植瘤組織中VEGF陽性表達率顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖8。
a:移植瘤剝離觀察圖;b:移植瘤重量比較;c:移植瘤體積生長曲線;d:移植瘤組織免疫組化染色(×200);e:移植瘤組織中VEGF陽性表達 *:與陰性對照組比較,P<0.05
早期研究認為,PIWIL2僅表達于生殖細胞,隨著研究的不斷深入,有學者發(fā)現(xiàn)PIWIL2在人類各種腫瘤中廣泛表達,隨后其在腫瘤領域的研究迅速發(fā)展[7]。Feng等[8]研究顯示,PIWIL2可激活Wnt3a/β-catenin信號通路介導體細胞的重編程過程,使其獲得干細胞特性,從而促進宮頸癌變。Zhao等[9]首次發(fā)現(xiàn)PIWIL2可通過調節(jié)細胞自噬和凋亡促進食管鱗狀細胞癌的生長,且其高表達與患者的不良預后密切相關。有研究表明,PIWIL2在口腔鱗癌和惡變前口腔白斑中高表達,在口腔癌樣干細胞中具有重建腫瘤異質性的能力[6]。本研究轉染PIWIL2-shRNA慢病毒至CAL27細胞中下調PIWIL2表達后,細胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯降低,且CAL27細胞裸鼠皮下移植瘤的重量和體積也受到明顯抑制,表明沉默PIWIL2可抑制CAL27細胞的增殖、侵襲及遷移。
細胞增殖抗原蛋白Ki67是一種僅存在于增生細胞的核蛋白,可表達于除G0期以外所有細胞周期階段的細胞核增殖標志物,細胞周期為G1期時Ki67開始表達,在S期和G2期其表達逐漸升高,于M期達到峰值,但在有絲分裂結束后迅速分解[10]。因此,常以Ki67表達水平反映細胞增殖能力。VEGF是重要的血管生成因子,對血管的調控具有高度特異性和高效性,主要通過增加血管通透性和誘導血管形成促進腫瘤生長和轉移[11]。本研究中PIWIL2-shRNA慢病毒組CAL27細胞中Ki67和VEGF蛋白表達水平降低,且移植瘤組織中VEGF陽性表達率也降低,說明沉默PIWIL2表達可抑制口腔鱗癌細胞的增殖。Qiu等[12]也發(fā)現(xiàn),沉默PIWIL2后,腫瘤細胞增殖能力降低,細胞周期受到阻滯。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),沉默PIWIL2表達后,細胞線粒體膜電位下降,這是細胞凋亡過程中的標志性事件。
上皮間質轉化是指在胞外信號的刺激下,上皮細胞喪失極性,獲得間質細胞特性,從而具有浸潤、游走、遷移的能力,這在腫瘤的侵襲和轉移過程中具有重要作用[13]。上皮間質轉化過程中伴有上皮細胞標志物(E-cadherin、β-catenin等)表達下調,間質細胞標志物(N-cadherin、波形蛋白等)表達上調,誘導上皮間質轉化的細胞因子和轉錄因子(Snail、腫瘤生長因子β等)表達上調,輔助性誘導上皮間質轉化的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達上調[14-15]。Zhang等[16]通過構建PIWIL2誘導腫瘤干細胞衍生的外泌體發(fā)現(xiàn),外泌體可促進成纖維細胞的癌癥相關表型,增強細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結果顯示,PIWIL2-shRNA慢病毒組CAL27細胞中E-cadherin蛋白表達水平高于陰性對照組,N-cadherin和Snail蛋白表達水平低于陰性對照組,提示沉默PIWIL2表達可抑制CAL27細胞上皮間質轉化,從而抑制細胞侵襲及遷移。
綜上所述,沉默PIWIL2可抑制口腔鱗癌細胞CAL27增殖、侵襲、遷移及裸鼠皮下移植瘤的生長,提示PIWIL2可能是口腔鱗癌的有效治療靶點。