董曉平，劉紅崗，張 勇

(空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院胸腔外科，陜西 西安 710038)

肺癌是人類最常見的癌癥類型之一，也是全球癌癥相關死亡的主要原因。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%，主要包括鱗狀細胞癌和腺癌。盡管針對NSCLC的診斷和現(xiàn)有的分子治療已經取得了進展，但患者的5年總生存率仍然很低，僅為19%[1]。而導致患者預后不良的主要原因是缺乏特異性的生物標志物及早期檢測工具，因此大多數(shù)患者確診時已處于晚期。外泌體是小的細胞外囊泡，直徑為30～150 nm，具有免疫相容性和低毒性。外泌體通常在不同細胞之間轉移生物分子，如蛋白質、脂質、mRNA和miRNA，從而在不同的病理生理過程中發(fā)揮作用[2]。腫瘤衍生的外泌體與腫瘤微環(huán)境中的其他細胞相互作用，可調控腫瘤的進展、轉移和免疫逃逸[3]。雖然細胞外miRNAs可以與特定的RNA結合蛋白結合并在循環(huán)系統(tǒng)中運輸，但外泌體miRNAs更穩(wěn)定，是癌癥治療的理想靶點。miRNAs是內源性的小的非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，其可以結合到靶基因的特定區(qū)域，如3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，以調控靶基因的降解或翻譯抑制。因此，miRNAs通過靶向靶mRNAs，在腫瘤發(fā)生發(fā)展和細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮關鍵作用[4]。據(jù)報道，外泌體的分泌可能導致癌細胞生物學行為的改變，miRNAs在NSCLC早期診斷中具有高度敏感性和特異性，可作為NSCLC患者診斷和治療的潛在生物標志物[5]。以往研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清外泌體中miR-454水平顯著下調[6]。然而，外泌體miR-454在NSCLC中的作用及相關機制尚未完全明確。因此，本研究擬探討外泌體miR-454對NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響，以期為NSCLC的診斷和治療提供理想的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 材料

納入2019年10月至2021年2月我院收治的NSCLC患者40例(NSCLC組)，同時選取我院體檢中心與之匹配的健康受試者40例(健康對照組)。所有NSCLC患者在試驗前均未接受任何放療或化療。在獲得受試者的書面同意后，采集其外周靜脈血樣本，離心后獲得血清樣本。冷凍保存管中的血清樣品用液氮處理后在-80 ℃條件下保存。本研究方案已獲得我院倫理委員會批準(倫理批號：KS2019027)。

1.2 主要試劑與儀器

人支氣管上皮樣細胞(human bronchial epithelial cells，HBE)、NSCLC細胞A549(武漢普諾賽生命科技有限公司)；ExoQuick外泌體提取試劑盒、Exo-FectTMExosome轉染試劑盒[安諾論(北京)生物科技有限公司]；外泌體蛋白提取試劑盒(美國EZBioscience公司)；MTT試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；TaqMan miRNA試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；NC mimic、miR-454 mimic、NC inhibitor、miR-454 inhibitor(廣州銳博生物科技有限公司)；Vector、pcDNA-PDK1(上海生工生物工程有限公司)；HSP70、CD63、CD81、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PDK1一抗(美國Abcam公司)。透射電鏡(日本Hitachi公司)；多功能酶標儀(美國Biotek公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.3 外泌體分離和鑒定

用ExoQuick外泌體提取試劑盒處理健康對照組和NSCLC組血清樣本，然后根據(jù)說明書將上清液在4 ℃下離心(1 500 r/min)以獲得外泌體，并使用透射電鏡進行形態(tài)學鑒定。將提取的血清外泌體用4%多聚甲醛固定1 h，隨后用PBS洗滌，然后將外泌體顆粒固定在2.5%戊二醛中，并裝載到formvar碳包覆的電子顯微鏡網格上，在室溫下保持5 min，隨后使用標準的1%乙酸鈾酰(pH 4.0)在室溫下對外泌體顆粒染色10 min，用PBS洗滌網格后在透射電鏡下觀察。將提取的NSCLC患者血清外泌體和去除外泌體的血清分別設為外泌體組和血清組，使用Western blot檢測外泌體中表面標志物HSP70、CD63和CD81蛋白的表達。

1.4 Western blot檢測

根據(jù)說明書使用RIPA裂解緩沖液或外泌體蛋白提取試劑盒提取總蛋白。然后用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(濃縮膠90 V，分離膠110 V)，并轉移到PVDF膜上(電流200 mA，90 min)。使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h，隨后與一抗于4 ℃孵育過夜。使用TBST洗滌3次，將膜與二抗孵育1 h，然后用TBST沖洗。將膜放置在干凈的玻璃板上，將增強化學發(fā)光試劑盒中等量的A溶液和B溶液在暗室中混合后加到膜上，對蛋白信號進行可視化，并使用Image J軟件進行定量。

1.5 細胞培養(yǎng)與轉染

根據(jù)說明書將HBE細胞置于添加10%無外泌體胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將A549細胞置于添加10%無外泌體胎牛血清的Ham’s F-12 K培養(yǎng)基中，所有細胞均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照說明書使用Exo-FectTMExosome轉染試劑盒將NC mimic、miR-454 mimic、NC inhibitor、miR-454 inhibitor、miR-454 mimic+Vector、miR-454 mimic+pcDNA-PDK1分別轉染到外泌體中，分別設為NC mimic組、miR-454 mimic組、NC inhibitor組、miR-454 inhibitor組、miR-454+Vector組、miR-454+pcDNA-PDK1組，檢測轉染效率。將A549細胞以2×103個/孔的密度接種到含10%無外泌體胎牛血清培養(yǎng)基的24孔板中，當匯合度為 50%～60%時，細胞與血清來源的外泌體(每孔 50 μL)共孵育24 h作為血清外泌體組，與不含外泌體的血清共孵育作為對照組。然后收集細胞進行細胞功能檢測。

1.6 MTT實驗

將A549細胞以5×103個/孔的密度接種到96孔板中，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后，向每孔中加入10 μL MTT溶液孵育2 h，然后加入DMSO溶解結晶物，使用酶標儀測定570 nm處各孔的光密度(OD)值。

1.7 Transwell實驗

分別使用預先涂有或未涂基質凝膠的Transwell小室進行侵襲或遷移實驗。將在不含血清培養(yǎng)基中的A549細胞(2×104)接種到預先涂有或未涂Matrigel的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，細胞遷移或侵襲到腔室的下表面，用甲醛固定并用結晶紫染色。使用倒置顯微鏡觀察遷移或侵襲細胞的形態(tài)。

1.8 流式細胞術

使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。收集細胞，用胰蛋白酶處理細胞并懸浮在PBS中。共收集5×104個細胞，用195 μL Annexin V-FITC結合緩沖液處理，然后用5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色，隨后在室溫下避光孵育20 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并計算凋亡率。

1.9 實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測

分別使用TRIzol試劑或外泌體RNA分離試劑盒從細胞或外泌體中分離總RNA。然后使用反轉錄試劑盒將1 μg總RNA轉錄為cDNA，并使用SYBR Green緩沖液擴增mRNA，進行RT-qPCR。反應條件：95 ℃預變性1 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共40個循環(huán)。根據(jù)說明書使用TaqMan miRNA試劑盒檢測miR-454的表達。以GAPDH和U6分別作為mRNA和miRNA的內參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.10 雙熒光素酶報告基因實驗

生物信息學網站預測PDK1與miR-454的靶向關系。構建PMIR-GlO-PDK1 3’UTR野生型和PMIR-GlO-PDK1 3’UTR突變型重組報告載體，命名為PDK1-WT和PDK1-MUT。將A549細胞以1×105個/孔的密度接種到24孔板中，將miR-454 mimic或NC mimic與重組載體(PDK1-WT或PDK1-MUT)轉染至細胞中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后收集細胞，使用雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 NSCLC患者血清中外泌體鑒定

透射電鏡結果顯示，外泌體形態(tài)為典型的脂質雙層膜包裹的圓形顆粒。Western blot結果顯示，與血清組比較，外泌體組中表面標志物HSP70、CD63和CD81蛋白的表達顯著增加(P<0.05)，見圖1。

a：透射電鏡觀察分離的外泌體形態(tài)；b：Western blot檢測HSP70、CD63、CD81蛋白的表達 *：與血清組比較，P<0.05

2.2 NSCLC患者血清外泌體對A549細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

MTT實驗結果顯示，血清外泌體組細胞增殖能力較對照組增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；流式細胞術結果顯示，血清外泌體組中細胞凋亡率較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Transwell實驗結果顯示，血清外泌體組細胞侵襲和遷移能力較對照組增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Western blot結果顯示，血清外泌體組中E-cadherin蛋白表達水平較對照組降低，N-cadherin以及Vimentin蛋白表達水平較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

a：MTT實驗檢測細胞增殖；b：流式細胞術檢測細胞凋亡;c：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲；d：Western blot檢測蛋白表達 *：與對照組比較，P<0.05

2.3 外泌體miR-454對A549細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

與健康對照組比較，NSCLC組患者血清來源的外泌體中miR-454的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與HBE細胞相比，A549細胞中miR-454的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與NC mimic組比較，miR-454 mimic組中的miR-454表達顯著升高，細胞增殖、侵襲和遷移能力降低，E-cadherin蛋白表達水平升高，N-cadherin及Vimentin蛋白表達水平降低，細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

a：RT-qPCR檢測NSCLC患者和健康對照組血清來源的外泌體中miR-454的表達；b：RT-qPCR檢測A549和HBE細胞中miR-454的表達；c：RT-qPCR檢測miR-454在外泌體中的轉染效率；d：MTT實驗檢測細胞增殖；e：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲；f：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達；g：流式細胞術檢測細胞凋亡 *：與健康對照組比較，P<0.05；#：HBE細胞比較，P<0.05;△：與NC mimic組比較，P<0.05

2.4 PDK1與miR-454的靶向關系

PDK1是miR-454的靶基因之一，miR-454與PDK1 3’UTR之間具有特殊的結合位點。雙熒光素酶報告基因結果顯示，A549細胞轉染miR-454 mimic和PDK1-WT后的熒光素酶活性顯著低于轉染NC mimic和PDK1-WT的細胞(P<0.05)，而共轉染miR-454 mimic和PDK1-MUT的細胞與共轉染NC mimic和PDK1-MUT的細胞相比，其細胞的熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。RT-qPCR和Western blot結果顯示，與NC mimic組比較，miR-454 mimic組細胞中miR-454的表達顯著升高(P<0.05)，PDK1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與NC inhibitor組比較，miR-454 inhibitor組細胞中miR-454的表達顯著降低(P<0.05)，PDK1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖4。

a：miR-454與PDK1 3’UTR的結合位點；b：雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-454與PDK1的關系；c：RT-qPCR檢測miR-454的轉染效率；d、e：RT-qPCR和Western blot檢測PDK1 mRNA和蛋白表達 *：與NC mimic組比較，P<0.05；#：與NC inhibitor組比較，P<0.05

2.5 PDK1在NSCLC患者血清外泌體和細胞中的表達

RT-qPCR和Western blot結果顯示，與健康對照組比較，NSCLC組患者血清外泌體中PDK1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與HBE細胞比較，A549細胞中的PDK1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖5。

a、b：RT-qPCR和Western blot檢測NSCLC組和健康對照組血清源外泌體中PDK1的表達；c、d：RT-qPCR和Western blot檢測PDK1在HBE、A549細胞中的表達 *：與健康對照組比較，P<0.05；#：與HBE細胞比較，P<0.05

2.6 外泌體miR-454通過靶向PDK1對NSCLC細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

與miR-454+Vector組比較，miR-454+pcDNA-PDK1組細胞中PDK1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，細胞增殖、侵襲和遷移能力增強，E-cadherin蛋白表達水平降低，N-cadherin及Vimentin蛋白表達水平升高，細胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6、7。

a、b：RT-qPCR和Western blot檢測各組PDK1 mRNA和蛋白的表達；c：MTT實驗檢測細胞增殖；d：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達；e：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 *：與NC mimic組比較，P<0.05；#：與miR-454+Vector組比較，P<0.05

*：與NC mimic組比較，P<0.05；#：與miR-454+Vector組比較，P<0.05

3 討論

NSCLC是全球癌癥相關死亡的主要原因，盡管治療策略取得了重大突破，但總體治愈率和存活率并不理想。有研究表明，外泌體具有作為肺癌早期診斷標志物的潛力[7]。從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體被描述為外泌體、細胞外囊泡、微粒或微囊泡，其可以黏附并融合到循環(huán)細胞或遠處的駐留細胞，傳遞細胞質成分。細胞通訊對于癌癥的發(fā)展至關重要，腫瘤細胞與基質細胞之間的相互作用可重塑腫瘤微環(huán)境，并通過腫瘤間通訊影響腫瘤生長、侵襲和存活。研究報道，腫瘤來源的外泌體通過運輸各種蛋白、脂質和核酸在細胞通訊中發(fā)揮重要作用[8]。已知腫瘤來源的外泌體可調節(jié)腫瘤生長、血管生成、腫瘤轉移、耐藥性和免疫逃逸。本研究亦發(fā)現(xiàn)，源自NSCLC患者的血清外泌體可顯著促進NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲，提示外泌體可作為NSCLC患者疾病監(jiān)測和預后的生物標志物。

研究表明，腫瘤來源的外泌體至少可部分通過運輸miRNAs介導腫瘤細胞的惡性進展，一些外泌體miRNAs已被認為是癌癥生物標志物和治療靶點[9-10]。先前研究報道，miR-454在NSCLC細胞外泌體中顯著下調[6]；此外，miR-454在NSCLC組織和細胞系中下調，miR-454過表達可顯著抑制NSCLC細胞增殖和轉移[11]。以上研究表明miR-454在NSCLC中可作為腫瘤抑制因子。本研究結果顯示，NSCLC血清來源的外泌體miR-454過表達可誘導NSCLC細胞凋亡，且削弱了NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移能力，與上述研究結果一致，提示miR-454可以通過外泌體轉移抑制NSCLC的進展。

為了進一步研究miR-454在NSCLC中的作用機制，本研究篩選并鑒定了miR-454的靶基因PDK1，并通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了兩者的靶向關系。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-454可通過靶向PDK1表達抑制人膠質母細胞瘤細胞增殖，本研究結果與之一致[12]。丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)是一種線粒體多酶復合物，可催化丙酮酸的氧化脫羧，是負責調節(jié)碳水化合物穩(wěn)態(tài)的主要酶之一。丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)可以介導PDH磷酸化，從而導致PDH失活。PDK1在腎癌和乳腺癌等多種癌癥中表達均升高[13-14]。miR-613通過調節(jié)PDK1抑制喉鱗狀細胞癌的進展[15]。此外，PDK1的高表達與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關，有研究報道，PDK1在NSCLC組織中表達上調，過表達PDK1可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[16]。PDK1過表達可逆轉miR-375對NSCLC細胞增殖和遷移的抑制作用[17]。本研究結果顯示，PDK1在NSCLC血清來源的外泌體和細胞系中的表達均升高；PDK1作為miR-454的靶基因，其過表達逆轉了miR-454對NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用；此外，miR-454顯著增加了NSCLC細胞中E-cadherin蛋白的表達，降低了N-cadherin和Vimentin的表達，而過表達PDK1逆轉了這一結果，提示miR-454可通過靶向PDK1抑制NSCLC細胞的惡性進展。

綜上所述，本研究探討了外泌體miR-454在NSCLC中的作用，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-454過表達阻斷了NSCLC的發(fā)生發(fā)展，這一機制是通過抑制PDK1發(fā)揮作用的。因此，外泌體miR-454可能成為NSCLC診斷和治療的新靶點。