葛孟清 鐘 嶸 盧亞萍 黃 超,3 肖 鑫 房經(jīng)貴,*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095；2 南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，江蘇 南京 210095；3 中山陵園管理局，江蘇 南京 210014)

葡萄(Vitisspp.)為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，原產(chǎn)于亞洲西部，在世界各地廣泛栽培，是世界上種植最廣泛的經(jīng)濟作物之一[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(http://faostat.fao.org)，2019年世界葡萄種植面積已達692萬公頃。隨著葡萄栽培面積的增加，大量的有機廢物和副產(chǎn)品隨之產(chǎn)生，在環(huán)境保護和資源利用等相關(guān)政策的驅(qū)動下，葡萄種子、葉片、莖等的再利用越來越受到重視。相關(guān)研究表明，葡萄葉片中含有多種生物活性物質(zhì)，花色苷是其中一類?；ㄉ帐且环N天然的水溶性色素，廣泛存在于植物果實、葉片、花等器官中，使其呈現(xiàn)不同的顏色，因其具有抗氧化、抗炎、無毒等特點而被廣泛用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[2-8]。根據(jù)花色苷連接的糖基數(shù)量可將其分為單糖苷和雙糖苷花色苷[9-10]。根據(jù)糖基修飾類型可將花色苷分為乙?；?、咖啡酰化、阿魏?；?、香豆?；ㄉ?，乙?；拖愣辊；ㄉ帐瞧咸压麑嵵凶畛Ｒ姷男揎楊惢ㄉ誟11-12]。根據(jù)花色苷B環(huán)R1、R2位上的取代基的不同，可將花色苷分為6類，分別是花青素、花翠素、甲基花青素、甲基花翠素、二甲基花翠素和花葵素[13]。葡萄花色苷的研究主要集中在葡萄果實。葡萄果實中單糖苷和雙糖苷花色苷均存在，單糖苷花色苷主要存在于歐亞種葡萄中，雙糖苷主要存在于美洲種葡萄(Vitislabrusca)、山葡萄(Vitisamurensis)和圓葉葡萄(Vitisrotundifolia)[14-16]。葡萄葉片中次級代謝物質(zhì)的相關(guān)研究更多地集中在其抗氧化功能方面。如Adriano等[17]研究發(fā)現(xiàn)紅色和綠色葉片進行烹煮處理后，綠色葉片具有更高的抗氧化活性；Carla等[3]發(fā)現(xiàn)葡萄莖富含兒茶素類化合物，是酚類化合物的重要來源。葡萄果實中花色苷研究的相關(guān)報道十分豐富，但是葡萄葉片中花色苷物質(zhì)的鑒定和分析尚鮮見更多報道。本研究選用3個紅色葉片和3個綠色葉片葡萄品種，擬探究葉片發(fā)育過程中花色苷種類和含量的變化，以及葉片顏色和花色苷的相關(guān)關(guān)系，旨在為紅色葉片中花色苷的利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中8612、紅雞心、玫瑰香、秋紅、葡萄園皇后、玫瑰露6個不同品種的葡萄葉片均采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院葡萄種質(zhì)資源圃，其中8612、紅雞心、玫瑰香屬于紅色葉片，秋紅、葡萄園皇后、玫瑰露屬于綠色葉片，兩組葉片顏色存在明顯差異(圖1)。采集不同發(fā)育時期的葉片(葉片展開后5、15、25、35、45、55 d)，放入冰盒帶回實驗室進行數(shù)據(jù)測定和后續(xù)試驗。

注：a: 紅雞心; b: 秋紅; c: 8612; d: 葡萄園皇后; e: 玫瑰香; f: 玫瑰露.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 ALPHA2-4真空冷凍干燥機，德國CHRIST公司；ACQUTTY UPLC I-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀、配備電噴霧離子源(electron spray ionization, ESI)、Masslynx4.1工作站，美國Waters公司；D3204R高速離心機，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；JXFSTPRP-24 L磨樣機，上海靜信公司；FRQ-1008HT小型超聲波清洗機，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；AUY220型電子天平，日本島津公司；UPH-I-20 L純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司；EPSON GT2000型掃描儀，日本愛普生公司。

1.2.2 主要試劑 花色苷標準品Mv-3-Glu，購自上海SIGMA公司，純度大于99%；鹽酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、0.45 μm微孔過濾頭、1 mL注射器，均購自南京壽德實驗器材有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉片色差的分析 將帶回實驗室的葉片用清水沖洗干凈，濾紙吸去表面水滴，使用葉片掃描儀對葉片進行掃描拍照。利用MATLAB軟件對葉片的RGB(R: Red; G: Green; B: Blue)數(shù)據(jù)進行提取，轉(zhuǎn)換成色差三要素L*(lightness)、a*(red green index)、b*(yellow blue index)進行后續(xù)試驗分析。RGB與L*、a*、b*轉(zhuǎn)換公式參考Chen等[18]的方法。

1.3.2 花色苷的提取 參考邢冉冉[15]的方法并稍作修改，葡萄葉片經(jīng)液氮冷凍，使用磨樣機充分研磨，裝入樣品瓶，真空冷凍干燥機中放置12 h進行凍干。稱取100 mg凍干樣品，溶于1 mL 0.1%的HCl-CH3OH溶液中，超聲波清洗機中提取25 min后，置于4℃冰箱12 h，期間多次顛倒混勻，過0.45 μm濾膜，備用。操作全程注意避光。

1.3.3 花色苷檢測的液相色譜質(zhì)譜條件 參考Carla等[3]的方法，并略作調(diào)整。色譜參數(shù)：100 mm×2.1 mm ACQUITY UPLC C18色譜柱；檢測器：photo-diadearray PAD檢測器；進樣量：2 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫梯度：0.5 min 5% B，20 min 5%～40% B，2 min 40%～95% B；質(zhì)譜條件：ESI電噴霧電離源；毛細管電壓：2.0 kV；溫度：120℃；離子掃描范圍：50～1 200 m/z。使用Masslynx 4.1和UNIFI進行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016 處理，DPS 7.05 軟件進行顯著性分析，并用RStudio繪制相關(guān)性圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片發(fā)育過程中色差的變化

L*值代表色澤明亮度，取值從0到100，表示亮度逐漸增加；a*值表示紅綠屬性，由負值變化到正值表示綠色減退，紅色增強；b*值表示黃藍屬性，其值由小變大表示藍色減退，黃色增強[19]。本研究中紅色葉片指在葉片萌芽至脫落的整個發(fā)育過程中存在較長時期的紅色階段，綠色葉片指在葉片發(fā)育過程中始終呈現(xiàn)綠色的葉片(圖1)。紅色與綠色葉片發(fā)育過程中色差變化趨勢明顯不同(圖2)。隨著葉片發(fā)育，紅葉中8612、玫瑰香葉片亮度(L*)在5～15 d短暫下降，之后逐漸升高。在15～35 d前后，紅葉的亮度均低于綠葉。葉片發(fā)育過程中紅葉中紅綠指數(shù)(a*)值呈先升高后下降的趨勢，綠葉中a*值均為負值，且絕對值逐漸增大；紅葉中黃藍指數(shù)(b*)值變化趨勢與a*值變化趨勢相反，隨著葉片發(fā)育b*值呈逐漸降低趨勢，在35 d后又逐漸上升，綠葉中b*值呈先升高后下降的趨勢。

圖2 葉片亮度(A)、紅綠指數(shù)(B)、黃藍指數(shù)(C)的變化

2.2 葉片中花色苷組分數(shù)量和含量的分析

2.2.1 花色苷類物質(zhì)的種類和含量 由圖1、圖2可知，在紅色葉片的整個發(fā)育過程中，紅色是逐漸加深又降低的。本研究選擇5、25、45 d三個階段的葉片，利用液相質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)技術(shù)對其花色苷成分進行定性定量分析，在葡萄葉片中共鑒定出18種不同的花色苷類物質(zhì)，均為單糖苷，其分子式、分子質(zhì)量及保留時間見表1，其中1～4屬于花青素類，5～8屬于花翠素類，9～12屬于二甲基花翠素類，13～16屬于甲基花青素類，17、18屬于甲基花翠素類。所有成分分子質(zhì)量在449.108～655.166 Da之間，保留時間在3.20～10.15 min之間。由圖3可知，紅色葉片中花色苷種類更加豐富。不同發(fā)育時期，8612、玫瑰香、紅雞心中花色苷類物質(zhì)最多達到14種，最少為9種；而葡萄園皇后、玫瑰露、秋紅中最多8種，最少僅有2種。

表1 葉片中鑒定到的18種花色苷類物質(zhì)

葉片中花色苷定量結(jié)果顯示(表2)，紅色葉片葡萄品種中花色苷含量在123.468～855.001 mg·100g-1之間，其中紅雞心葉片發(fā)育5 d時的花色苷總含量最高，為855.001 mg·100g-1；綠色葉片中花色苷含量為4.407～44.517 mg·100g-1。由圖3可知，8612、玫瑰香和玫瑰露花色苷的數(shù)量和總含量隨著葉片的發(fā)育呈先升高后下降的趨勢，紅雞心、秋紅和葡萄園皇后花色苷數(shù)量和總含量則隨葉片發(fā)育呈逐漸下降的趨勢。

表2 不同種類的花色苷在紅色和綠色葡萄葉片中的含量

圖3 葉片中花色苷類物質(zhì)的數(shù)量和含量

2.2.2 葉片中不同種類花色苷的含量 本研究在紅色葉片中共檢測到5類花色苷，未檢測到花葵素類花色苷的存在，綠色葉片中僅存在3類花色苷，分別是花青素、甲基花青素和二甲基花翠素。

在葉片的不同發(fā)育時期，不同種類的花色苷變化趨勢不同。在葉片展開5、25、45 d 3個不同時期，紅色葉片中花青素類、甲基花青素類和花翠素類花色苷含量逐漸降低，至45 d時，紅色葉片中未檢測到花翠素類的存在；甲基花翠素類則呈先升高后下降的趨勢，在5 d時平均含量最低，為9.747 mg·100g-1，在25 d時最高，為51.728 mg·100g-1；二甲基花翠素類花色苷含量變化不大，隨葉片發(fā)育時間增加，含量略有升高。不同階段的紅色葉片花色苷種類的變異程度也不相同，其中甲基花翠素的變異系數(shù)在不同發(fā)育時期均較高，變異系數(shù)均高于1。綠色葉片中花青素和甲基花青素類花色苷平均含量隨葉片發(fā)育時間延長而降低，二甲基花翠素則呈先上升后下降的趨勢。綠色葉片中各類花色苷的含量均較低，花青素和甲基花青素平均含量均在5 d時最高，分別為13.879 mg·100g-1和5.503 mg·100g-1，二甲基花翠素平均含量在25 d時最高，為15.503 mg·100g-1。

2.3 葉片中不同修飾類型花色苷的變化

2.3.1 葉片中甲基化和未甲基化花色苷的變化 根據(jù)花色苷是否甲基化進行分類，對葉片中甲基化和未甲基化花色苷的變化進行分析(表3，圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葉片展開5、25、45 d時，紅色葉片未甲基化花色苷含量分別為90.360～455.394、47.191～198.345和10.956～60.405 mg·100g-1，甲基化花色苷含量分別為63.949～399.608、108.994～419.002和110.556～210.885 mg·100g-1，甲基化花色苷所占比例分別為41.37%～50.27%、53.12%～73.54%和70.88%～95.06%；綠色葉片中未甲基化花色苷含量分別為12.338～15.600、0.666～18.032和0～1.012 mg·100 g-1，甲基化花色苷含量分別為1.176～27.327、8.478～26.448和3.982～10.303 mg·100g-1，甲基化花色苷所占比例分別為7.01%～66.61%、59.50%～92.71%和79.73%～100.00%。綜上，隨著葉片發(fā)育時間的延長，紅色和綠色葉片中甲基化花色苷的含量均逐漸高于未甲基化花色苷含量，甲基化花色苷在總花色苷中所占的比例逐漸升高。葡萄園皇后、秋紅2個品種在45 d時，甲基化花色苷比例高達100%。

表3 甲基化和未甲基化花色苷在葉片中的含量

圖4 甲基化和未甲基化花色苷在葉片中的比例

2.3.2 葉片中不同?；愋突ㄉ盏淖兓?由表4可知，在葡萄葉片中共發(fā)現(xiàn)5種?；惢ㄉ?，分別是乙?；?、咖啡?；⑾愣辊；?、阿魏酰化和糖?；惢ㄉ铡ｕ；惢ㄉ赵诓煌贩N中存在差異。紅色葉片紅雞心中存在5種，8612中存在4種，玫瑰香中存在3種，綠色葉片葡萄園皇后、玫瑰露中存在3種，秋紅中僅存在1種。在同一品種的不同發(fā)育時期，酰化類花色苷的種類也發(fā)生變化。8612、紅雞心中在5、25 d時均存在糖酰化花色苷，但在45 d時未檢測到糖?；ㄉ?，葡萄園皇后、玫瑰露在5、25 d時均存在乙?；ㄉ眨?5 d時未檢測到乙?；ㄉ眨患t雞心則僅在25 d時檢測到阿魏?；惢ㄉ?，玫瑰露僅在25 d時檢測到咖啡?；惢ㄉ?。

對所有品種不同發(fā)育階段的?；惢ㄉ蘸糠治霭l(fā)現(xiàn)(表4)，8612葉片在5 d時咖啡?；惢ㄉ蘸孔罡?，為3.167 mg·100g-1，紅雞心葉片在5 d時的乙?；?、香豆酰化、糖?；惢ㄉ站罡?，分別為34.613、576.869、0.832 mg·100g-1，另外，紅雞心葉片在25 d時阿魏?；惢ㄉ蘸恳沧罡?，為49.326 mg·100g-1。不同修飾類型花色苷在總花色苷的占比分析表明，香豆?；ㄉ赵诩t色和綠色葉片不同發(fā)育階段總花色苷中的占比均較高。其中，在秋紅葉片45 d時期，香豆?；惢ㄉ账急壤哌_100%。此外，紅色葉片中咖啡?；惢ㄉ账急壤S葉片發(fā)育而逐漸升高。

表4 不同品種中各種修飾類型花色苷成分的分析

2.4 花色苷與色差的相關(guān)性分析

由圖5可知，葡萄葉片色差和花色苷成分的相關(guān)性在不同顏色葉片的不同發(fā)育時期中有所不同。紅葉中各指標達到顯著或極顯著水平的結(jié)果要多于綠葉，且紅葉展葉5 d階段和綠葉展葉25 d階段的色差與花色苷成分的相關(guān)性更強，紅色葉片5 d階段有103對指標存在顯著或極顯著水平的相關(guān)性，綠色葉片展葉25 d階段有45對指標存在顯著或極顯著水平的相關(guān)性。相關(guān)性分析表明，在展葉5 d階段的紅色葉片中，色差值L*與絕大多數(shù)指標呈負相關(guān)，其中，與甲基化、乙?；⑾愣辊；然ㄉ站蕵O顯著負相關(guān)；紅綠指數(shù)a*分別與花翠素、甲基花翠素等呈顯著和極顯著正相關(guān)；黃藍指數(shù)b*與各類花色苷成分均呈極顯著負相關(guān)關(guān)系。綜上，紅色葉片色差值與花色苷各成分之間存在顯著的相關(guān)性。

注：A1：亮度(L*)；A2：紅綠指數(shù)(a*)；A3：黃藍指數(shù)(b*)；A4：未甲基化；A5：甲基化；A6：未修飾；A7：乙?；?；A8：咖啡?；籄9：香豆?；?；A10：阿魏?；?；A11：糖?；?；A12：花青素；A13：甲基花青素；A14：花翠素；A15：甲基花翠素；A16：二甲基花翠素；A17：總花青素。*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

3 討論

葡萄是全世界最重要的經(jīng)濟作物之一，葡萄果實用途很廣，根據(jù)其用途可分為釀酒葡萄，制干葡萄和鮮食葡萄三大類[18-19]。伴隨著葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，葡萄種植面積逐漸增加，在葡萄栽培過程中產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物隨之增加[20-22]。據(jù)估計，因修剪產(chǎn)生的果穗、枝條、葉片等每年每公頃約為1～2噸[23-26]。本研究以葡萄葉片為試驗材料，開發(fā)了葉片色差數(shù)據(jù)測定的新方法，與前人研究中提到的葉片色差測定方法相比[27-30]，通過MATLAB軟件與葉片掃描儀數(shù)據(jù)相結(jié)合，對整片葉的色差求平均值，使得到的葉片色差數(shù)據(jù)更具有代表性和科學性。本研究利用LC-MS技術(shù)對葡萄葉片中花色苷成分及含量進行鑒定，發(fā)現(xiàn)紅色葡萄葉片中含有更加豐富的花色苷成分，與葡萄果實相比，葉片中未檢測到花葵素成分。對不同發(fā)育時期紅色葉片中花色苷成分的鑒定發(fā)現(xiàn)，8612、玫瑰香和紅雞心葉片中花色苷種類多、含量豐富。豐富的花色苷成分和含量使葡萄葉片呈現(xiàn)紅色，也使紅色葡萄葉片有望成為花色苷提取的潛在材料。色差值與花色苷成分的相關(guān)性分析結(jié)果表明，葡萄葉片花色苷含量與色差參數(shù)a*值呈顯著正相關(guān)，與b*值呈顯著負相關(guān)，這一結(jié)果與紅葉山茶、彩葉草、黃連木、苧麻葉片等研究結(jié)果一致[27-30]。因此，葡萄葉片色差值可以在一定程度上反映葡萄葉片中花色苷含量的高低。前人研究表明，甲基化可以使花色苷顏色更深，?；梢栽黾踊ㄉ战Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[31-34]。通過對葉片中甲基化與非甲基化花色苷的比較分析發(fā)現(xiàn)，甲基化花色苷隨葉片發(fā)育逐漸增加。葉片花色苷修飾類型分析結(jié)果表明，葉片中花色苷修飾類型與前人報道的葡萄果實中花色苷修飾類型一致，且香豆?；ㄉ找彩侨~片中花色苷的主要修飾類型[32]。綜上，本研究采用的葡萄葉片色差值測定分析方法可以對葡萄葉片顏色進行定量表征，使量化分析葡萄葉片顏色與花色苷各成分含量間的關(guān)系成為可能。

4 結(jié)論

本研究通過分析6種葡萄葉片發(fā)育過程中葉片顏色及花色苷成分和含量的變化，在6種葡萄葉片中共鑒定出5類18種花色苷成分。與綠色葉片相比，紅色葡萄葉片中花色苷種類更多，含量更豐富。因此，紅色葉片可作為花色苷的潛在來源。色差與花色苷相關(guān)性熱圖顯示紅色葉片色差值a*和b*與花色苷含量呈顯著相關(guān)，這為葉片中花色苷的利用提供了量化指標。