劉欣杰，吳曉雪，劉素平，袁利明，陳 寧，賽務(wù)加甫

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003)

卵母細(xì)胞體外成熟是一種輔助生殖技術(shù)，對改善動(dòng)物生殖發(fā)育、生殖健康和繁殖至關(guān)重要。通過模擬機(jī)體內(nèi)環(huán)境，使得卵母細(xì)胞可以在機(jī)體外進(jìn)行培養(yǎng)，其成熟過程主要包括細(xì)胞的減數(shù)分裂及卵母細(xì)胞的核、質(zhì)、膜、透明帶和卵丘細(xì)胞的成熟。眾所周知，卵母細(xì)胞的成熟是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，在體外成熟培養(yǎng)的過程中許多卵母細(xì)胞都發(fā)生退化，只有部分卵母細(xì)胞可發(fā)育成熟。在卵母細(xì)胞成熟過程中，每一步都需要相關(guān)基因的及時(shí)和適當(dāng)表達(dá)，以及不同水平的相關(guān)影響因素的精確調(diào)節(jié)，以確保卵母細(xì)胞的正常成熟。在這個(gè)過程中，特定分子在不同階段的表達(dá)、激素、pH的變化以及卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化都十分重要。

磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C(phospholipase C，PLC)可使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)水解為第二信使肌醇-1，4，5-三磷酸(PIP3)和二酰甘油(DAG)，在調(diào)節(jié)各種受體分子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。PIP3可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放出Ca，使細(xì)胞內(nèi)Ca的濃度升高；DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，繼而引發(fā)下一步的信號(hào)傳遞。迄今為止，已有6種已知的PLC同種類型，β、γ、δ、ε、ζ和η，其中PLC-γ可作為一種傳遞信號(hào)參與受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)介導(dǎo)的細(xì)胞分裂、抗原抗體結(jié)合引起免疫反應(yīng)及卵細(xì)胞受精等過程。磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)作為PLC家族的成員，除參與細(xì)胞分裂外，其在細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)和分化中也有重要作用。通常過度表達(dá)RTK下游分子會(huì)引起腫瘤轉(zhuǎn)移，PLC-γ1也具有這種作用；一般認(rèn)為，RTK的下游分子能刺激或抑制細(xì)胞分化，也有報(bào)道證明PLC-γ1能誘導(dǎo)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞生長與分化。Dittmar等報(bào)道，表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的遷移是由PLC-γ1的短暫激活引起的。Smith等報(bào)道，在小鼠3YI的纖維原細(xì)胞中PLC-γ1的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。PLC-γ1蛋白在不同家畜、物種及進(jìn)化過程中具有較高的序列保守性，對于細(xì)胞的生長、增殖、胚胎發(fā)育等都有著重要影響。

卵母細(xì)胞凋亡是影響卵巢生殖細(xì)胞衰竭的主要原因之一，是其質(zhì)量和發(fā)育能力的代表，對各種哺乳動(dòng)物的生育能力都有著直接影響。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體激活并釋放caspase，隨著黃體細(xì)胞年齡的增長，caspase-3和Bax在黃體細(xì)胞中的比例增加。6是一種抗卵巢癌有效的基因，參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂途徑。PLC抑制劑U73122可以抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖，而PKC可以抑制細(xì)胞凋亡。然而，目前關(guān)于PLC-γ1對綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)影響的研究較少?？紤]到卵母細(xì)胞凋亡在卵母細(xì)胞發(fā)育中的基本作用，本試驗(yàn)研究了PLC-γ1是否對綿羊卵母細(xì)胞的成熟具有調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 TCM199、DMEM購自美國Lifetechnology公司；Prime ScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒購自TaKaRa有限公司；生理鹽水、抗生素均購自石河子藥店；胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；脫脂奶粉購自美國BD公司；U73122、m-3M3FBS購買于上海absin生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜、預(yù)染蛋白Marker購自賽默飛世爾科技公司；全蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PLC-γ1一抗、BAK一抗、BAX一抗、CASP3一抗、CASP8一抗、P53一抗、BCL6一抗、β-actin一抗、羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)二抗均購自Abcam公司；GenElute單細(xì)胞RNA純化試劑盒、綿羊用割卵液、成熟培養(yǎng)液、SoFaa胚胎培養(yǎng)液配方所用試劑均購自Sigma公司。

割卵液：PBS 95 mL、Heperin 0.005 g、Penicillin 0.008 g、Streptomycin 0.005 5 g、Phenol red 0.001 g、FBS 5 mL。成熟培養(yǎng)液：TCM199 0.92 g、NaHCO0.25 g、Hepes 0.246 3 g、Na-Py 0.033 g、Glutamine 0.005 g、0.075 IU·mLHMG 1 mL、1 μg·mL17β-雌二醇 1 mL、S/N 0.007 g、Phenol red 0.001 g、FBS 10 mL、無菌去離子水88 mL。SoFaa胚胎培養(yǎng)液：NaCl 0.632 5 g、KCl 0.048 2 g、KHPO0.012 3 g、NaHCO0.265 1 g、Na-Py 0.003 6 g、L-Glutamine 0.015 8 g、BSA 0.8 g、CaCl·2HO 0.024 8 g、MgCl·6HO 0.01 g、BME(amino acids) 2 mL、MEM(amino acids) 1 mL、Sodium lactate 28.22 μL、Pencillin 0.008 g、Strep 0.005 5 g、Phenol red 0.001 g、無菌去離子水96.97 mL。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 微量移液器(Eppendorf公司)；超凈工作臺(tái)(ZHJH-1112)；恒溫水浴鍋(DKB-510A)；超速離心機(jī)(Eppendorf，centrifuge-5415D)；立式高壓滅菌鍋(ZEAL-GR60DA)；離心機(jī)(Thermo)；聚丙烯凝膠電泳儀(DYY-8B)；顯微鏡加熱板(CRYOLOGIC)；倒置熒光顯微注射操作儀(Nikon)；FormaSteri-CultCO2 Incubators(Thermo)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；Protein simple成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物序列(表1)。引物序列由生工(上海)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 綿羊卵母細(xì)胞的收集 綿羊卵巢采自新疆石河子市屠宰場，保溫在添加青鏈霉素(100 IU·mL)的38.5 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用加入抗生素的生理鹽水(37 ℃預(yù)熱)沖洗綿羊卵巢 2～3次，剔除周圍的結(jié)締組織后繼續(xù)用加入抗生素的生理鹽水洗滌2次，將預(yù)熱平衡2 h的割卵液取出，將卵巢放入含2 mL割卵液的60 mm培養(yǎng)皿中并用鑷子固定，肉眼可見卵巢表面卵泡則用11 cm手術(shù)刀片切開，然后用撿卵針收集割卵液中胞質(zhì)均勻、包裹卵丘細(xì)胞3層及以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。

1.2.2 PLC抑制劑U73122及激活劑m-3M3FBS的稀釋 在電子天平上稱取5 mg的U73122及m-3M3FBS溶解于1 mL的DMSO中，配置成5 mg·mL的U73122及m-3M3FBS溶解液，按試驗(yàn)需要添加到成熟培養(yǎng)液中，直至獲得所需的濃度。通過反復(fù)吹打混合充分。在玻片上滴加一滴配置好的稀釋液，顯微鏡下觀察是否有沉淀。

1.2.3 綿羊卵母細(xì)胞在不同條件下的成熟培養(yǎng) 將收集到的COCs在成熟培養(yǎng)液中潤洗3次后隨機(jī)轉(zhuǎn)移至含有不同濃度的U73122(0、0.005、0.05、0.5、5、50 μmol·L)及m-3M3FBS(0、0.005、0.05、0.5、5、50 μmol·L)的成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO飽和濕度。每個(gè)濃度150個(gè)細(xì)胞，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.4 綿羊卵母細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的成熟狀態(tài)統(tǒng)計(jì) 將COCs體外成熟培養(yǎng)22 h后，在透明質(zhì)酸酶中作用5 min除去顆粒細(xì)胞，然后在體視顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)成熟卵母細(xì)胞排出第一極體的概率。

1.2.5 孤雌激活和早期胚胎的培養(yǎng) 收集經(jīng)0.5 μmol·LU73122及0.5 μmol·Lm-3M3FBS處理后成熟的卵母細(xì)胞150個(gè)，用離子霉素聯(lián)合6-DMAP進(jìn)行孤雌激活，即離子霉素作用5 min后放入6-DMAP中作用4 h后，將細(xì)胞放入SoFaa液中，在培養(yǎng)條件為5% CO、38.5 ℃飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.6 綿羊早期胚胎發(fā)育狀況統(tǒng)計(jì) 培養(yǎng)24 h后觀察卵母細(xì)胞卵裂情況，48 h開始統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞卵裂率，168 h統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞桑葚胚率。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測綿羊卵母細(xì)胞中-1 mRNA表達(dá)情況 使用GenElute單細(xì)胞RNA純化試劑盒對0.5 μmol·LU73122及0.5 μmol·Lm-3M3FBS培養(yǎng)48 h后的綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，對反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算mRNA水平上-1表達(dá)情況。

1.2.8 Western blot檢測綿羊卵母細(xì)胞中PLC-γ1蛋白表達(dá)情況 使用全蛋白提取試劑盒對0.5 μmol·LU73122及0.5 μmol·Lm-3M3FBS培養(yǎng)48 h后的綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，5×SDS蛋白上樣液煮沸變性，免疫印跡法檢測PLC-γ1蛋白表達(dá)。

1.2.9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測綿羊卵母細(xì)胞中、、3、8、53、6 mRNA表達(dá)情況 使用GenElute單細(xì)胞RNA純化試劑盒對0.5 μmol·LU73122及0.5 μmol·Lm-3M3FBS培養(yǎng)48 h后的綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，對反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算mRNA水平上、、3、8、53、6表達(dá)情況。

1.2.10 Western blot檢測綿羊卵母細(xì)胞中BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白表達(dá)情況 使用全蛋白提取試劑盒對0.5 μmol·LU73122及0.5 μmol·Lm-3M3FBS培養(yǎng)48 h后的綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，5×SDS蛋白上樣液煮沸變性，免疫印跡法檢測BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白表達(dá)。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 8.0繪制結(jié)果圖。采用IBM SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組間的多重比較采用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。單因素方差分析(ANOVA)用于確定多組之間的差異。兩組間差異采用檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示。<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組數(shù)據(jù)中不同字母表示其數(shù)據(jù)平均數(shù)有顯著性差異(<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的U73122及m-3M3FBS作用下綿羊成熟卵母細(xì)胞第一極體排出率

在含有不同濃度U73122及m-3M3FBS的成熟培養(yǎng)液中隨機(jī)放入150個(gè)COCs，體外培養(yǎng)22 h后統(tǒng)計(jì)排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值(表2、表3、圖1、圖2)。0.5 μmol·LU73122培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，與對照組相比(0 μmol·L)第一極體排出率最高((86±1.2)%)(<0.05)。0～0.5 μmol·L濃度的U73122培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，隨著濃度的增大，排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞數(shù)量呈遞增的趨勢，超過0.5 μmol·LU73122時(shí)，第一極體排出率下降。與對照組相比(0 μmol·L)，不同濃度的m-3M3FBS培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)第一極體排出率總體下降，且在0.5 μmol·L時(shí)第一極體排出率最低((40.7±0.7)%)(<0.05)。綜上所述，考慮到綿羊卵母細(xì)胞的成熟率，以0.5 μmol·LU73122為促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞成熟的最佳濃度，以0.5 μmol·Lm-3M3FBS為抑制綿羊卵母細(xì)胞成熟的最佳濃度。

表2 不同濃度U73122作用下成熟卵母細(xì)胞第一極體排出率Table 2 The probability of mature oocytes excreting the first polar body under different concentrations of U73122

圖1 不同濃度U73122作用下成熟卵母細(xì)胞第一極體排出率Fig.1 The probability of mature oocytes excreting the first polar body under different concentrations of U73122

表3 不同濃度m-3M3FBS作用下成熟卵母細(xì)胞第一極體排出率Table 3 The probability of mature oocytes excreting the first polar body under different concentrations of m-3M3FBS

圖2 不同濃度m-3M3FBS作用下成熟卵母細(xì)胞第一極體排出率Fig.2 The probability of excretion of the first polar body from mature oocytes under different concentrations of m-3M3FBS

2.2 0.5 μmol·L-1 U73122及0.5 μmol·L-1 m-3M3FBS對孤雌激活后早期胚胎發(fā)育的影響

將150個(gè)正常處理的成熟卵母細(xì)胞、150個(gè)經(jīng)0.5 μmol·LU73122處理過的成熟卵母細(xì)胞及150個(gè)經(jīng)0.5 μmol·Lm-3M3FBS處理過的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活和培養(yǎng)。48 h開始統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞卵裂率，168 h統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞桑葚胚率，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值(表4、圖3、圖4)。經(jīng)0.5 μmol·LU73122處理過的成熟卵母細(xì)胞其卵裂率(22.67%±0.29%，<0.05)和桑葚胚率(8.33%±0.25%，<0.05)均顯著低于對照組。而經(jīng)0.5 μmol·Lm-3M3FBS處理過的成熟卵母細(xì)胞其卵裂率(42.67%±0.35%，<0.05)和桑葚胚率(12.67%±0.34%，<0.05)均顯著高于對照組。

圖3 經(jīng)0.5 μmol·L-1 U73122及0.5 μmol·L-1 m-3M3FBS處理過的成熟卵母細(xì)胞孤雌激活后48 h卵裂率Fig.3 Cleavage rate of mature oocytes treated with 0.5 μmol·L-1 U73122 and 0.5 μmol·L-1 m-3M3FBS at 48 h after parthenogenetic activation

圖4 經(jīng)0.5 μmol·L-1 U73122及0.5 μmol·L-1 m-3M3FBS處理過的成熟卵母細(xì)胞孤雌激活后168 h桑葚胚率Fig.4 Morula rate of mature oocytes treated with 0.5 μmol·L-1 U73122 and 0.5 μmol·L-1 M-3M3FBS at 168 h after parthenogenetic activation

表4 經(jīng)0.5 μmol·L-1 U73122及0.5 μmol·L-1 m-3M3FBS處理過的成熟卵母細(xì)胞孤雌激活后48 h卵裂率及168 h桑葚胚率Table 4 Cleavage rate and morula rate of mature oocytes treated with 0.5 μmol·L-1 U73122 and 0.5 μmol·L-1 m-3M3FBS at 48 and 168 h after parthenogenetic activation

2.3 綿羊卵母細(xì)胞PLC-γ1基因mRNA表達(dá)情況

對在正常成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·LU73122的成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·Lm-3M3FBS的成熟培養(yǎng)液體外成熟培養(yǎng)48 h后的3組綿羊卵母細(xì)胞采用RT-qPCR方法對-1基因進(jìn)行mRNA表達(dá)量的檢測，試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)，與對照組相比，U73122組的-1表達(dá)量顯著下降(<0.05)，而m-3M3FBS組的-1表達(dá)量極顯著升高(<0.01)。這說明PLC抑制劑和激活劑可顯著改變-1基因表達(dá)量。

*. P< 0.05；**. P< 0.01；***. P< 0.001，下同*. P<0.05;**. P< 0.01；***. P<0.001, the same as below圖5 綿羊卵母細(xì)胞PLC-γ1基因mRNA表達(dá)量Fig.5 mRNA expression of PLC-γ1 gene in sheep oocytes

2.4 綿羊卵母細(xì)胞PLC-γ1蛋白水平表達(dá)情況

對在正常成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·LU73122的成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·Lm-3M3FBS的成熟培養(yǎng)液體外成熟培養(yǎng)48 h后的3組綿羊卵母細(xì)胞裂解收集總蛋白，進(jìn)行WB分析。分析結(jié)果顯示，在149 ku大小處，與對照組相比，m-3M3FBS組PLC-γ1蛋白豐度顯著升高，而U73122組PLC-γ1蛋白豐度顯著下降(圖6、圖7)。這說明PLC抑制劑和激活劑可顯著改變PLC-γ1蛋白表達(dá)量。

1. 對照組；2. U73122組；3. m-3M3FBS組1. Control group; 2. U73122 group; 3. m-3M3FBS group圖6 綿羊卵母細(xì)胞PLC-γ1蛋白表達(dá)量Fig.6 Expression of PLC-γ1 protein in sheep oocytes

圖7 PLC-γ1蛋白相對豐度Fig.7 PLC-γ1 protein relative abundance

2.5 綿羊卵母細(xì)胞BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6基因mRNA表達(dá)情況

對在正常成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·LU73122的成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·Lm-3M3FBS的成熟培養(yǎng)液體外成熟培養(yǎng)48 h后的3組綿羊卵母細(xì)胞采用RT-qPCR方法對其、、3、8、53、6基因進(jìn)行mRNA表達(dá)量的檢測，試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖8)，兩種不同的處理方式表現(xiàn)出兩種不同的表現(xiàn)趨勢。與對照組相比，0.5 μmol·LU73122組6 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(<0.01)，(<0.001)、(<0.001)、3(<0.01)、8(<0.001)、53(<0.01)mRNA相對表達(dá)量極顯著上升；0.5 μmol·Lm-3M3FBS組6 mRNA相對表達(dá)量極顯著上升(<0.001)，(<0.01)、(<0.01)、3(<0.01)、8(<0.001)、53(<0.01)mRNA相對表達(dá)量極顯著下降。

圖8 綿羊卵母細(xì)胞BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6基因mRNA表達(dá)量Fig.8 mRNA expression levels of BAK, BAX, CASP3, CASP8, P53 and BCL6 genes in sheep oocytes

2.6 綿羊卵母細(xì)胞BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白水平表達(dá)情況

對在正常成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·LU73122的成熟培養(yǎng)液、含有0.5 μmol·Lm-3M3FBS的成熟培養(yǎng)液體外成熟培養(yǎng)48 h后的3組綿羊卵母細(xì)胞裂解收集總蛋白，進(jìn)行WB分析。分析結(jié)果顯示(圖9、圖10)，與對照組相比，U73122組中CASP8(<0.001)、BAX(<0.01)、BAK(<0.001)蛋白豐度極顯著上升，BCL6(<0.001)蛋白豐度極顯著下降，P53和CASP3蛋白豐度無顯著變化；與對照組相比，m-3M3FBS組中P53(<0.001)、CASP3(<0.05)、BAX(<0.001)蛋白豐度極顯著下降，BCL6(<0.01)蛋白豐度極顯著上升，CASP8和BAK蛋白豐度無顯著變化。

1. 對照組；2.U73122組；3.m-3M3FBS組1. Control group; 2. U73122 group; 3. m-3M3FBS group圖9 綿羊卵母細(xì)胞BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白表達(dá)量Fig.9 Expression of BAK, BAX, CASP3, CASP8, P53 and BCL6 proteins in sheep oocytes

圖10 BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白相對豐度Fig.10 BAK, BAX, CASP3, CASP8, P53 and BCL6 proteins relative abundance

3 討 論

綿羊?qū)儆诩竟?jié)性多次發(fā)情的動(dòng)物，發(fā)情周期主要集中在8、9月份，但因本研究開展時(shí)間在4～6月，此時(shí)并非綿羊卵巢組織質(zhì)量最好的時(shí)候，而卵母細(xì)胞本身質(zhì)量是決定其生長發(fā)育能力的一個(gè)重要因素，因此，本研究從卵巢表面卵泡里所獲取的COCs可能在發(fā)育潛能上受到影響，這導(dǎo)致卵母細(xì)胞在孤雌激活后的卵裂率較低，且只發(fā)育至桑葚胚階段便停止發(fā)育。

PLC是磷酸肌醇調(diào)控的關(guān)鍵酶，具有多種功能。研究證實(shí)，其通常在胚胎發(fā)育及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用，可以參與生殖的調(diào)控。PLC-γ1在不同類型組織或細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮不同的作用。盡管關(guān)于PLC-γ1參與小鼠和斑馬魚的胚胎發(fā)育的影響已有報(bào)道，但是關(guān)于PLC-γ1對綿羊卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育影響的研究還未見報(bào)道。本研究檢測了PLC抑制劑U73122和激活劑m-3M3FBS在最適濃度下對綿羊卵母細(xì)胞中PLC-γ1基因和蛋白表達(dá)量的影響，并檢測了6種凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量的變化，以闡明PLC-γ1對綿羊卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育的影響。

本研究結(jié)果表明，在綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)并孤雌激活的培養(yǎng)體系中，0.5 μmol·L濃度的U73122促進(jìn)了綿羊卵母細(xì)胞的成熟，并抑制了其卵裂率和桑葚胚率；而0.5 μmol·L濃度的m-3M3FBS則抑制了綿羊卵母細(xì)胞的成熟，增加了其卵裂率和桑葚胚率。本研究中，卵母細(xì)胞發(fā)育不符合成熟的趨勢，這可能與-1表達(dá)量的改變導(dǎo)致某些信號(hào)通路的抑制或激活，進(jìn)一步導(dǎo)致卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育受到影響。Cui等在小鼠卵母細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)-1表達(dá)量增加時(shí)CDC42表達(dá)量也增加，此時(shí)小鼠卵母細(xì)胞的成熟率與隨后的卵裂率及囊胚率呈負(fù)相關(guān)，這與本研究的結(jié)果相似。-1基因參與調(diào)控CDC42信號(hào)通路的表達(dá)，致使小鼠卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育到早期胚胎。盡管不同物種可能存在不同的機(jī)制，但-1在卵母細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用這一事實(shí)仍然是一個(gè)共同的因素。但在綿羊卵母細(xì)胞中，-1基因是否參與調(diào)控CDC42信號(hào)通路還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在含有0.5 μmol·LPLC抑制劑或激活劑的成熟培養(yǎng)液體外成熟培養(yǎng)48 h后PLC-γ1基因和蛋白表達(dá)量發(fā)生顯著改變，這進(jìn)一步證明了PLC-γ1參與綿羊胚胎發(fā)育且在其中發(fā)揮重要作用。在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，線粒體不僅決定卵母細(xì)胞質(zhì)量、發(fā)育潛力和胚胎活力，還參與哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞凋亡，包括調(diào)控、、53和3的表達(dá)。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的紡錘體中可檢測到3，這說明其在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中是不可或缺的，它可能參與了卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控。6是參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂途徑的靶基因之一，是一種抗卵巢癌的有效基因。有研究報(bào)道，CASP3、CASP8、CASP9在小鼠卵母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)，且PLC-γ1不僅參與了哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的凋亡，還包括調(diào)控BCL6、P53、CASP3和BAX的表達(dá)，這與本研究中PLC-γ1表達(dá)量的減少與增多而導(dǎo)致的BCL6、CASP8、P53、CASP3、BAX、BAK表達(dá)量的減少與增多結(jié)果一致。

綿羊是一種常見的家養(yǎng)動(dòng)物，同時(shí)也經(jīng)常是人類某些疾病研究的動(dòng)物模型。能夠產(chǎn)生Ca信號(hào)的最廣泛的機(jī)制是PLC，其調(diào)節(jié)機(jī)制有潛力轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)科學(xué)中的應(yīng)用。因此，接下來的重點(diǎn)將是繼續(xù)以綿羊卵母細(xì)胞為研究對象，對綿羊卵母細(xì)胞Ca敏感蛋白進(jìn)行檢測，以及運(yùn)用共聚焦監(jiān)測鈣離子波動(dòng)技術(shù)進(jìn)一步探索PLC-γ1對體外培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞的影響，以填補(bǔ)PLC-γ1對綿羊卵母細(xì)胞影響研究的空白以及促進(jìn)對人類疾病的治療。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究表明PLC-γ1在綿羊卵母細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)量的減少或增多可促進(jìn)或抑制卵母細(xì)胞的成熟以及抑制或增強(qiáng)早期胚胎的發(fā)育能力。