于建寧，閆樂艷，陳 哲，戴子淳，胡夢蝶

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結合重點實驗室，南京 210014)

【研究意義】垂體是動物最重要的內(nèi)分泌腺，分為腺垂體和神經(jīng)垂體兩部分。生長激素細胞是腺垂體的重要組成細胞之一，合成并分泌生長激素。垂體同其他器官一樣，在動物胚胎發(fā)育過程中逐漸發(fā)育成為具有功能的器官。研究表明，在出生前或者孵化期的胚胎中，糖皮質激素能夠促進垂體細胞表達和分泌生長激素(Growth hormone，GH)，促進垂體細胞向生長激素細胞分化，可見糖皮質激素對于垂體的正常發(fā)育至關重要?！厩叭搜芯窟M展】研究顯示，雞胚發(fā)育到11～17 d時，血漿中皮質酮(糖皮質激素類)水平大幅升高[1]，與垂體細胞分化的時間相同[2]，從發(fā)育時間分析，兩者可能是關聯(lián)性事件。隨后的實驗證實，糖皮質激素在啟動并誘導垂體細胞的功能分化方面具有關鍵作用[3-4]。向體外培養(yǎng)大鼠和雞胚的垂體細胞添加糖皮質激素(大鼠：皮質酮0.5～5 μmol/L，地塞米松5～50 nmol/L；雞：皮質酮0.2～2 g/L)，能顯著提高垂體細胞中生長激素的表達，提高生長激素細胞的分化數(shù)量和比例，表明一定濃度的糖皮質激素能夠體外誘導垂體細胞向生長激素細胞分化[5-7]。不僅如此，體內(nèi)試驗也得到類似結果。在雞胚中注射皮質酮(5×10-6～5×10-8mol/L)或者在大鼠孕期飲用地塞米松(10 μg/d)，糖皮質激素同樣促進了體內(nèi)垂體生長激素細胞的分化[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c】養(yǎng)鵝是我國的傳統(tǒng)特色養(yǎng)殖業(yè)。近幾年我國鵝業(yè)發(fā)展尤為迅速，但關于鵝胚胎發(fā)育的基礎研究相對薄弱。相比一般家禽(雞胚、鴨胚)，對鵝胚胎的發(fā)育特點、發(fā)育規(guī)律以及胚胎發(fā)育調(diào)控機制等研究明顯不足，與養(yǎng)鵝大國地位不協(xié)調(diào)，因此有必要對鵝胚的發(fā)育特點及其調(diào)控機制展開系統(tǒng)研究?！緮M解決的關鍵問題】本實驗以鵝胚垂體為研究對象，通過體內(nèi)外添加糖皮質激素，探究糖皮質激素在鵝胚垂體發(fā)育過程中的作用。通過本研究，一方面可以補充和豐富家禽發(fā)育生物學和內(nèi)分泌學的科學理論，為鵝胚發(fā)育規(guī)律應用于養(yǎng)鵝生產(chǎn)奠定基礎；另一方面也為糖皮質激素更加合理有效用于科研、人類醫(yī)療等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 鵝受精蛋來源與注射方法

受精鵝蛋購自安徽全椒種鵝養(yǎng)殖場，孵化條件為：55%～60%的濕度，溫度控制在36.7～38.2 ℃，正常孵化時間為31 d。發(fā)育到15 d時，受精蛋隨機分成3組(每組30枚蛋)，并分別注入以下溶液：對照組每枚蛋注射300 μL 0.9%的生理鹽水；高濃度組每枚蛋注射300 μL 5×10-6mol/L地塞米松(DEX)；低濃度組每枚蛋注射300 μL 5×10-8mol/L地塞米松。

具體操作方法：受精蛋的小頭待70%酒精擦拭消毒后用18 G的針頭打孔，使用針頭為25 G的無菌注射器將含有不同濃度地塞米松溶液注入深度約10 mm的蛋清中，隨后用石蠟封口。完成以上操作后將受精蛋放回孵化箱中繼續(xù)孵化，在胚胎發(fā)育到20和28 d時，采集血液絨毛尿囊血管血液，放入含有10 μL EDTA[0.5 mol/L(pH 8)]緩沖液中，14 000 r/min離心10 min，分離血漿，-20 ℃保存, 用于RIA檢測。

1.2 鵝胚垂體細胞的體外分離與短期培養(yǎng)

鵝胚發(fā)育到15和20 d時，從腦部分離垂體組織，胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞[2]；采用臺盼藍染色檢測細胞活力；每一處理組所用細胞來自90個左右的胚胎；分離的單個垂體細胞接種于多聚賴氨酸提前處理過的24孔培養(yǎng)板中，接種濃度為1×106個/孔，所用細胞培養(yǎng)液為添加0.1% BSA、5 μg/mL牛胰島素、5 μg/mL人轉鐵蛋白、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的無血清DMEM/F12；放入5% CO2、飽和濕度的37.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，用DMEM/F12洗去未貼壁的細胞，并加入含有以下激素濃度的培養(yǎng)液：1和1000 nmol/L地塞米松(DEX-L，DEX-H)，細胞在以上培養(yǎng)液中處理6 h。激素處理濃度參照相關文獻[11-14]。6 h后，收集細胞培養(yǎng)液，300 r/min離心去除未貼壁細胞，保存于-20 ℃，用于RIA檢測。貼壁細胞，用于免疫熒光染色和實時熒光定量PCR實驗。

1.3 放射免疫法檢測血液和培養(yǎng)液中GH的濃度

GH的濃度使用125I放射免疫分析試劑盒(北京北方研究所)測定，按照試劑盒說明書進行具體操作。GH的濃度以對照組GH水平進行標準化。

1.4 免疫熒光染色法檢測體外培養(yǎng)垂體細胞中GH蛋白的表達

體外培養(yǎng)的垂體細胞經(jīng)PBS沖洗3次，3.7%多聚甲醛固定20 min；用0.05%Triton X-100處理20 min；PBS+1% BSA封閉30 min；將細胞放在含有1% BSA的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)100倍稀釋的兔抗鵝GH多克隆一抗中孵育過夜(多抗為本實驗室自備，GenBank:AAN37412.1)；用PBST(PBS+0.05%吐溫-20)洗滌3次；將細胞放在山羊抗兔IgG H&L(Cy3?)二抗(1∶500稀釋)(Abcam公司)室溫下孵育1 h；細胞核用Hoechst33342進行染色；熒光倒置顯微鏡下觀察細胞。

1.5 RNA提取和實時熒光定量PCR

使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從胚胎內(nèi)垂體或體外培養(yǎng)的垂體細胞中提取總RNA，通過反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，具體操作參照產(chǎn)品說明書(Toyobo，Osaka，Japan)。PCR最終反應體系為含有SYBR Green I的50 μL反應體積。引物序列和退火溫度詳見表1。ABI PRISM-7500實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems；Foster City，CA，USA)用于檢測擴增產(chǎn)物。完成qPCR后，Ct值使用軟件(SDS 1.2.2)進行計算，基因表達使用2-ΔΔCt方法分析，并以看家基因β-actin的表達量進行標準化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 11.0中ANOVA進行相關統(tǒng)計學分析，顯著性差異以P<0.05為標準。

2 結果與分析

2.1 蛋內(nèi)注射DEX對垂體細胞分化的影響

2.1.1 DEX對鵝胚血液中生長激素水平的影響 鵝胚發(fā)育15 d時，注射兩種濃度的DEX，分別在20和28 d采集血漿，檢測其中的GH相比對照組的表達量，如圖1所示。低濃度和高濃度的DEX，均顯著提高了血漿中GH蛋白的表達水平(P<0.05)。

2.1.2 DEX對鵝胚垂體組織中GH mRNA表達的影響 如圖2所示：DEX處理后，鵝胚發(fā)育到20 d時，垂體組織中的GH mRNA表達量顯著上升(P<0.05)，但提高的幅度不大；當鵝胚發(fā)育28 d時，

DEX的作用發(fā)揮明顯，極顯著提高了垂體組織中的GH mRNA表達量(P<0.01)，而且較低濃度DEX即能達到明顯的促進效果。

2.1.3 DEX對鵝胚垂體組織中GR mRNA表達的影響 如圖3所示，當鵝胚垂體發(fā)育20 d時，DEX處理前后GR mRNA的表達量沒有顯著變化(P>0.05)；在發(fā)育28 d的鵝胚中，DEX處理組GR mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組GR mRNA的表達升高幅度更加顯著(P<0.01)。

2.2 添加DEX對體外培養(yǎng)垂體細胞分化的影響

2.2.1 DEX對體外培養(yǎng)垂體細胞中生長激素細胞比例的影響 通過向體外培養(yǎng)的垂體細胞中添加DEX，進一步明確DEX促進垂體生長激素細胞的分化功能。第一組實驗向15 d胚齡的垂體細胞中添加不同濃度的DEX，結果表明，無論DEX的濃度高低，均能顯著提高含有生長激素的細胞比例(圖5，P

<0.05，熒光圖片見圖4-a～c)；第二組實驗向20 d胚齡的垂體細胞中添加不同濃度的DEX，與15 d所得結果不同的是，DEX并沒有顯著提高垂體中生長激素細胞的比例，與對照組差異不顯著(圖5，P>0.05，熒光圖片見圖4-A～C)。

2.2.2 DEX對體外培養(yǎng)垂體細胞GH mRNA表達的影響 采用實時熒光定量PCR方法檢測添加DEX后，兩種胚齡垂體細胞中GH mRNA表達量的變化(圖6)。GH mRNA與垂體細胞中GH蛋白的表達趨勢一致，僅在15 d胚齡的垂體細胞大幅升高(P<0.01)，而在20 d胚齡中沒有顯著變化。

2.2.3 DEX對體外培養(yǎng)垂體細胞GR mRNA表達的影響 如圖7所示。在15 d胚齡的垂體細胞中，GR mRNA的表達與GH mRNA的表達趨勢基本一致。低劑量組雖然與對照組相比差異不顯著，但有升高的趨勢；在高劑量組，則顯著高于對照組(P<0.05)。但對于20 d胚齡組，GR mRNA表達量同對照組相比沒有顯著變化。

3 討 論

糖皮質激素是由腎上腺皮質產(chǎn)生的一種代謝調(diào)節(jié)激素，對于出生后動物的主要生理功能是促進糖異生、肝外組織的蛋白質代謝，以及脂肪分解代謝等。糖皮質激素在胚胎發(fā)育過程中的功能還有待進一步探索，雖在小鼠和雞上已有研究，但并不全面。本實驗以鵝胚為研究對象，從體內(nèi)和體外兩個方面，研究糖皮質激素在鵝胚垂體發(fā)育和分化過程中的作用。

從血漿中GH蛋白、垂體中的GH mRNA表達和GR mRNA表達三方面開展體內(nèi)實驗，檢測上述指標在DEX注射前后的變化。在注射高低濃度的DEX后，鵝胚血漿中GH蛋白表達均顯著上升；垂體中GH mRNA表達也有相同趨勢；GR mRNA在28 d時顯著上升。由此推斷，糖皮質激素可以誘導垂體細胞向生長激素細胞分化，糖皮質激素受體(GR)可能參與調(diào)控GH mRNA的上升。研究表明，對于出生后動物，GR是糖皮質激素發(fā)揮作用的重要轉錄因子，它通過與糖皮質激素結合調(diào)控靶基因的表達[15-16]。將皮質酮注射到鵝胚中，發(fā)現(xiàn)皮質酮誘導鵝胚垂體表達GH可能與GR有關[17]。由此可見，不論動物在胚胎期還是出生后，GR都是糖皮質激素發(fā)揮作用的重要因子。

為進一步研究糖皮質激素與鵝胚垂體細胞分化的關系，由于體內(nèi)實驗環(huán)境復雜、影響因素多，我們決定利用體外短時間培養(yǎng)的原始鵝胚垂體細胞繼續(xù)進行研究。向體外培養(yǎng)的發(fā)育中期(胚齡15 d)的鵝胚垂體添加高低濃度的DEX后，垂體細胞中表達GH蛋白的細胞比例明顯升高，而且同體內(nèi)的結果一致，較低濃度的DEX表現(xiàn)出顯著效果；GH mRNA的表達變化也同體內(nèi)的表達變化一致，垂體細胞中的GH mRNA顯著上升；在15 d鵝胚垂體中，GR mRNA在低濃度DEX處理組表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，在高濃度DEX處理組達到顯著差異。體外實驗更加明確了GR很可能參與DEX促進垂體細胞表達GH過程，這一推斷與在大鼠上的研究結果一致[5]。除GR之外，磷脂酰肌醇3-激酶、Ras通路和ERK 1/2信號通路可能都參與了DEX的誘導過程[14,18]。

4 結 論

本實驗第一次從體內(nèi)、體外兩個方面研究糖皮質激素在鵝胚垂體發(fā)育中的作用，結果表明糖皮質激素可能通過其受體促進鵝胚垂體發(fā)育和垂體細胞分化。雖然其中的分子機理仍需要深入探討，但為更加全面地研究糖皮質激素在鳥類胚胎發(fā)育過程中的作用、建立與完善相關信號通路奠定了重要基礎。