李青芝，陳葉雨，吳曉雲(yún)，劉 亞，賴見生，李 華，楊煥超，宋明江，龔 全，林 玨

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，成都 611731)

【研究意義】糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids, GCs)參與脊椎動(dòng)物的許多生理過程，尤其在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，其功能在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過程中非常保守[1-2]。在硬骨魚中，皮質(zhì)醇被認(rèn)為是應(yīng)激刺激時(shí)產(chǎn)生的主要糖皮質(zhì)激素[3]。皮質(zhì)醇通過與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptors, GR)結(jié)合作用于細(xì)胞，GC/GR系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)代謝、心血管和免疫功能來介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。GR屬于核受體超家族，在哺乳動(dòng)物中，GR包含GRα和GRβ兩種亞型。GC主要和GRα結(jié)合發(fā)揮其生理作用，而GRβ競爭性負(fù)調(diào)節(jié)GRα的功能[6]。目前為止，魚類中GR相關(guān)研究非常有限，2003年在兩種硬骨魚虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[7]和伯氏樸麗(Haplochromisburtoni)[8]中發(fā)現(xiàn)了編碼GR的基因序列。此后，一些硬骨魚中也被發(fā)現(xiàn)存在有兩種不同的GR基因[9-10]，而在斑馬魚中只鑒定出一種GR基因[11]。目前關(guān)于硬骨魚中兩類GR的功能研究還處于起步階段。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，魚類經(jīng)常會(huì)受到病原微生物及其它不良環(huán)境因子造成的應(yīng)激干擾。應(yīng)激反應(yīng)將激活下丘腦—垂體—腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-interrenal axis, HPI)，導(dǎo)致魚類機(jī)體快速釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)進(jìn)入血液和分泌糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇[12-13]。由于血漿皮質(zhì)醇含量的持續(xù)升高對魚類的生長、繁殖與免疫機(jī)能等多方面有重要影響，因此涉及皮質(zhì)醇合成調(diào)控的HPI軸在應(yīng)激相關(guān)研究中備受關(guān)注[14]。釋放到循環(huán)系統(tǒng)的皮質(zhì)醇通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞或通過載體介導(dǎo)的過程進(jìn)入細(xì)胞[15]，在細(xì)胞內(nèi)，它與GR結(jié)合，作為配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子控制和調(diào)節(jié)基因表達(dá)[16]。受體數(shù)量或親和力可能直接影響靶細(xì)胞的反應(yīng)程度[17]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，關(guān)于魚類中環(huán)境因子應(yīng)激對GR表達(dá)量影響的相關(guān)研究還十分有限。在低水位急性應(yīng)激作用下，斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)肝臟中GR基因的表達(dá)了會(huì)發(fā)生顯著性變化；腹腔注射皮質(zhì)醇會(huì)引起團(tuán)頭魴不同組織中GR表達(dá)水平的變化[3]；隨著養(yǎng)殖密度的變化，歐洲鱸魚(DicentrarchuslabraxL.)肝臟中的GR表達(dá)量會(huì)顯著變化，高密度養(yǎng)殖會(huì)顯著抑制GR基因的表達(dá)，說明養(yǎng)殖密度也是調(diào)節(jié)GR表達(dá)的應(yīng)激因子之一[18]。大鼠在饑餓脅迫作用后，胃部的GR在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上都發(fā)生了顯著性上升[19]，而饑餓應(yīng)激對魚類GR基因表達(dá)量影響的相關(guān)研究目前還幾乎處于空白階段?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】長江鱘(Acipenserdabriyanus)又稱達(dá)氏鱘，是我國長江上游的特有物種[20]。近年來，由于人類活動(dòng)的影響，長江鱘的自然種群數(shù)量急劇下降。到目前為止，長江鱘野生種群基本絕跡，被國際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN, www.iucnredlist.org/details/231/0)列為極度瀕危物種，并被列為中國一級保護(hù)動(dòng)物。因此，目前對長江鱘進(jìn)行有效的人工養(yǎng)殖是維持其種群數(shù)量的關(guān)鍵。然而，在長江鱘養(yǎng)殖過程中，常常會(huì)受到各種環(huán)境因子造成的應(yīng)激干擾，從而影響其成活率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以長江鱘為研究對象，首次報(bào)道糖皮質(zhì)激素受體GR的cDNA序列，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，檢測了組織表達(dá)的特征和饑餓脅迫作用下的表達(dá)模式，將為進(jìn)一步研究長江鱘應(yīng)激反應(yīng)過程中GR的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的長江鱘為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所F2代幼魚。在實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)魚在工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)兩周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件。飼喂蛋白質(zhì)41.31%、脂肪10%、水分9.14%、灰分13.51%的商品飼料。

1.2 基因序列及生物信息學(xué)分析

GR基因的全長序列來源于長江鱘SMRT全長轉(zhuǎn)錄組測序[21]。cDNA序列開放閱讀框ORF分析用Vector NTI 10.3.0進(jìn)行。從NCBI主頁(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載其他脊椎動(dòng)物GR基因的氨基酸序列，利用ClustalX和DNAMAN對GR基因與其它魚類同源氨基酸序列開展多重比對。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特征。采用phyre2軟件預(yù)測蛋白三維結(jié)構(gòu)。利用MEGA 6.0的Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 RNA提取及組織表達(dá)分析

選取5尾健康的長江鱘，采集皮膚、眼、腦、鰓、肝、脾、胃、心、腸和肌肉10個(gè)組織進(jìn)行組織表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)魚解剖前用MS-222處理，分離組織后速凍于液氮，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。用TRIzol法提取總RNA，RNA質(zhì)量用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初檢，隨后利用超微量分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度。第一鏈cDNA使用ReverTra Ace-First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 饑餓復(fù)投喂下GR基因的表達(dá)量檢測

饑餓復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為10尾長江鱘，共120尾長江鱘。初始體重為(60.53±0.28) g(平均±標(biāo)準(zhǔn)誤，下同)，初始體長為(19.96±0.28) cm。經(jīng)過兩周暫養(yǎng)后，魚被隨機(jī)分為4個(gè)組別：禁食0 d和復(fù)投喂14 d (0 d，對照組)；禁食3、7和14 d，復(fù)投喂14 d(3、7 和14 d)。在禁食結(jié)束后和復(fù)投喂14 d時(shí)，采集肝臟和腸道組織，隨即在液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測通過Bio-Rad CFX Con nect System (Bio-Rad, 美國)進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件如下：98 ℃ 3 min；98 ℃ 5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)反應(yīng)40次；最后，70～95 ℃獲取熔解曲線。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括5 μL TB Green Premix ExTaqTMII (Takara, 日本)，2 μL 20倍稀釋后的cDNA模板，各0.5 μL的上下游特異性引物(表1)和2 μL PCR級滅菌水。內(nèi)參基因選取β-Actin，采用2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中GR基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 本研究使用引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

饑餓復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)中，GR基因在各組之間的差異表達(dá)，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析?；趩我蛩胤讲罘治龌A(chǔ)上，采用Turkey多重比較法對組間差異進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 長江鱘GR序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

長江鱘GR基因開放閱讀框?yàn)?316 bp，編碼771個(gè)氨基酸，其分子量為84.97 kDa，等電點(diǎn)為5.70。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的功能分析，發(fā)現(xiàn)此編碼蛋白在403～483位置存在保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，在559～723位置存在一個(gè)激素受體配體結(jié)合域HOLI(圖1-A)。根據(jù)phyre2軟件預(yù)測結(jié)果，GR的三維結(jié)構(gòu)由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖1-B)。

將長江鱘和其他物種的GR氨基酸序列進(jìn)行比對(圖2)，序列相似性依次如下：小體鱘(Acipenserruthenus, 98.6%)、匙吻鱘(Polyodonspathula, 92.4%)、斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteusoculatus, 73.0%)、熱帶雀鱔 (Atractosteustropicus, 72.1%)和大海鰱(Megalopscyprinoides, 68.0%)。

采用MEGA 6繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，長江鱘的GR均可與其他物種的GR聚類，其中，長江鱘的GR與小體鱘同源性較高，緊密聚在一起，置信度為100%，且與匙吻鱘GR聚為一分支，隨后與其余魚類GR聚為一個(gè)大的分支，而哺乳動(dòng)物人和小鼠的GR則聚為另一個(gè)單獨(dú)的分支(圖3)。

2.2 不同組織中GR的表達(dá)水平

GR在長江鱘的皮膚、眼、腦、鰓、肝、脾、胃、心、腸和肌肉共10個(gè)組織中都有表達(dá)(圖4)，但是表達(dá)水平不同。其中，脾臟中GR表達(dá)量為最高，其次為鰓、肝臟、心臟和腦，其余組織中表達(dá)量相對較低。

2.3 饑餓脅迫下長江鱘GR表達(dá)量的變化

長江鱘各組織中GRmRNA表達(dá)量在饑餓期間出現(xiàn)不同的變化(圖5)。饑餓3 d后，腸道中GR表達(dá)量無顯著性變化。在饑餓第7天表達(dá)量出現(xiàn)峰值，顯著高于第0天(P<0.05)，饑餓第14天后無顯著性變化。肝臟中GR相對表達(dá)量隨饑餓時(shí)間的增加而逐漸上升，在饑餓7和14 d后，其表達(dá)量均顯著高于對照組。復(fù)投喂后，腸道和肝臟中GR在各處理中的表達(dá)量與對照組相比均無顯著性變化(圖6)。

3 討 論

3.1 長江鱘GR氨基酸序列特征及進(jìn)化分析

長江鱘的GR序列與其他硬骨魚的GR序列具有共同特征和高度相似性，包含有保守的鋅指結(jié)構(gòu)域和激素受體配體結(jié)合域，與斑點(diǎn)叉尾鮰[3]和虹鱒[22]

相似。GR在硬骨魚中相對保守的氨基酸結(jié)構(gòu)表明其在魚類中具有相似的生理功能。硬骨魚GR氨基酸序列中，存在一個(gè)獨(dú)有的9-aa插入序列(WRARQNTDG)，位于鋅指結(jié)構(gòu)域之間[23]。迄今為止報(bào)道的大多數(shù)硬骨魚GR中，都有WRARQNTDG氨基酸插入序列。在綠河鲀(Tetraodonnigroviridis)[10]和鯉魚(Cyprinuscarpio)[24]中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)例外，其插入序列分別為WRARQNTVC和WRARQNADG。最近，對進(jìn)化上處于原始地位的硬骨魚GR的研究還發(fā)現(xiàn)了另外兩個(gè)插入序列，即小體鱘(Acipenserruthenus)的WRARQNMDG序列和非洲蝴蝶魚(Pantodonbuchholzi)的WRARQTSEG序列[9]。本研究中，該特殊的9-aa插入序列為WRARQNMDG，與小體鱘一致，這些研究結(jié)果表明，插入序列尤其前7個(gè)氨基酸在魚類進(jìn)化中非常保守，但這些保守氨基酸的功能意義目前尚不清楚。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，所有魚類不同物種的GR形成了一個(gè)大的分支，表明魚類糖皮質(zhì)激素受體的形成來自于同一祖先，而長江鱘及其余鱘魚的GR位于進(jìn)化樹硬骨魚分支中相對根部的位置，說明鱘魚在進(jìn)化上處于較于原始的地位。

3.2 長江鱘GR基因組織分布特征

健康長江鱘所有檢測組織中均有GR基因表達(dá)，各組織之間的表達(dá)水平不同，暗示了其廣泛參與機(jī)體功能活動(dòng)的生物學(xué)意義。在本研究中，長江鱘GR高表達(dá)于免疫器官脾臟、肝臟和鰓，該結(jié)果與團(tuán)頭魴[14]和斑點(diǎn)叉尾鮰[3]的研究類似。本研究中，長江鱘GR在滲透調(diào)節(jié)、應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)和代謝的相關(guān)組織中存在差異表達(dá)。Stolte等[24]對鯉魚的研究中發(fā)現(xiàn)，LPS注射后，GR表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著性下降；同時(shí)，寄生蟲侵染鯉魚后，會(huì)引起脾臟中的GR表達(dá)量顯著上調(diào)，證明GR參與到了鯉魚免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)過程中。本研究中，脾臟中GR的高表達(dá)暗示著長江鱘GR可能也具有免疫調(diào)節(jié)相關(guān)功能。肝臟是魚類重要的代謝器官及應(yīng)激反應(yīng)后的主要應(yīng)答器官。研究表明肝臟中GR的表達(dá)量會(huì)隨環(huán)境脅迫因子(例如低水位急性應(yīng)激和養(yǎng)殖密度等)的變化而出現(xiàn)顯著變化[3, 18]。GR在肝臟中的高表達(dá)提示著長江鱘GR與肝臟抗應(yīng)激反應(yīng)的密切關(guān)系。鰓具有排泄氮代謝廢物和參與滲透壓調(diào)節(jié)的重要功能，同時(shí)，鰓是魚類的一種粘膜免疫器官，對病原微生物的入侵起到了第一防線的作用。在斑馬魚的研究中，Kumai等[25]發(fā)現(xiàn)GR參與了鰓的滲透壓調(diào)節(jié)活動(dòng)。GR在長江鱘鰓中的高表達(dá)提示其可作用于滲透調(diào)節(jié)功能。除免疫器官外，常波等[26]對大鼠的研究結(jié)果顯示，GR在大腦的海馬區(qū)高度表達(dá)，與其參與HPA (Hypothalamic-pituitary-adrenalaxis)功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)。應(yīng)激反應(yīng)會(huì)激活機(jī)體HPI軸，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇的分泌，GR參與到該生物學(xué)過程中，并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[16]。HPI軸和HPA軸作為同源結(jié)構(gòu)，基于脊椎動(dòng)物進(jìn)化的保守性，長江鱘GR在大腦中的高表達(dá)意味著其相似的調(diào)節(jié)功能。

3.3 長江鱘GR在應(yīng)激環(huán)境下的表達(dá)特征分析

類固醇激素在魚類中具有重要作用，相關(guān)激素受體系統(tǒng)在急劇變化的應(yīng)激條件下，起到調(diào)節(jié)代謝功能以及鹽和水平衡的作用[22]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，了解應(yīng)激水平是實(shí)現(xiàn)和維持良好魚類養(yǎng)殖和福利標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵參數(shù)。為了評估魚在環(huán)境應(yīng)激條件下的暴露情況，需要檢測一系列生物標(biāo)志物，包括對內(nèi)分泌參數(shù)的評估。糖皮質(zhì)激素及其受體在許多生理過程中具有調(diào)節(jié)作用，包括碳水化合物代謝、骨代謝、發(fā)育、細(xì)胞周期、免疫功能、應(yīng)激反應(yīng)、中樞神經(jīng)功能、生長和生殖[1-2]。糖皮質(zhì)激素對正常發(fā)育和維持基礎(chǔ)和應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)環(huán)境平衡至關(guān)重要。糖皮質(zhì)激素的所有生物學(xué)功能都是由糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)[23]。在魚類中，GR也被證實(shí)參與到了多種抗應(yīng)激反應(yīng)過程中[3, 18, 24]。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，饑餓不僅會(huì)導(dǎo)致魚類生長停止，而且會(huì)對魚類造成應(yīng)激反應(yīng)。研究表明饑餓脅迫條件下，長江鱘細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制被激活，熱休克蛋白HSP70-4基因表達(dá)量表現(xiàn)出顯著上調(diào)，以對抗應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體造成的損傷[27]。而饑餓脅迫對應(yīng)激相關(guān)基因GR在肝臟和腸道轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量的影響，目前還沒有相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，GR基因的表達(dá)量在饑餓期間發(fā)生了改變，長江鱘腸道和肝臟中GRmRNA顯著上調(diào)表達(dá)，表明GR在維持因饑餓引起的應(yīng)激中起到了一定穩(wěn)態(tài)作用。在饑餓14 d后，肝臟中GR基因仍出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.01)，表明在相對長時(shí)間的饑餓脅迫后，GR仍處于較高表達(dá)水平，并在此期間具有保護(hù)作用。而在復(fù)投喂過程中，與對照組相比，各組別的GR相對表達(dá)量沒有顯著變化，表明補(bǔ)充食物后，GR的表達(dá)量恢復(fù)到了正常水平，機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)得到了緩解。禁食是一種應(yīng)激狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致血液中糖皮質(zhì)激素濃度高[28]。在魚類中，饑餓脅迫對肝臟和腸道GR轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量的影響鮮有報(bào)道。在大鼠中，禁食可引起血漿皮質(zhì)酮濃度升高，并引起胃部GR在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)量增高[19]；在北極紅點(diǎn)鮭(Arcticcharr)中，禁食會(huì)提高血漿皮質(zhì)醇水平和大腦中的GR含量，這種升高可能在北極紅點(diǎn)鮭適應(yīng)長時(shí)間禁食的過程中發(fā)揮著重要的作用[29]。本研究結(jié)果表明長江鱘GR參與了饑餓脅迫對機(jī)體造成的應(yīng)激反應(yīng)，并在此期間具有保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

本研究從長江鱘中鑒定了GR基因，序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該基因與魚類糖皮質(zhì)激素受體高度相似，具有其家族保守的結(jié)構(gòu)域；長江鱘GR廣泛分布于不同組織中，對饑餓脅迫有明顯的應(yīng)答響應(yīng)，該研究結(jié)果不僅有助于對魚類GR生物學(xué)功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，也可為今后長江鱘對抗應(yīng)激反應(yīng)的研究提供理論依據(jù)。