杜雨寒, 侯培杰, 邢璐瑤, 劉錫亮, 陳棟梁, 熊成東, 張麗芳*

(1. 中國(guó)科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)研究所,四川 成都 610041; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

近年來,由于骨缺損的發(fā)生率較高,臨床上對(duì)骨移植的需求量很大。骨缺損主要是由骨感染、骨腫瘤和外傷造成的[1-3]。目前,傳統(tǒng)的骨移植如自體骨移植、同種異體骨移植和異種骨移植已不能完全滿足臨床需要。自體骨移植通常受到供體短缺和供體部位發(fā)病率的限制,而異體骨移植在實(shí)際應(yīng)用中存在骨結(jié)合性差,免疫排斥,血液病傳播和植入技術(shù)復(fù)雜等問題[4-6]。

隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展,骨組織工程支架的出現(xiàn)為臨床應(yīng)用解決骨缺損問題提供了新的思路,并制造了大量的組織工程支架。與傳統(tǒng)組織工程支架的制備技術(shù)相比,3D打印可以精確地控制支架的孔徑大小、幾何形狀和互連性,同時(shí)該技術(shù)可以根據(jù)用戶定義的圖案,在短時(shí)間內(nèi)“自下而上”創(chuàng)建3D人工植入物[7-8]。擠出生物3D打印技術(shù)包括生物陶瓷顆粒、藥物和生物分子等打印方法,其作為一種可以在室溫或低溫環(huán)境下進(jìn)行溶劑共混的打印方式,主要通過將合成的聚酯溶解在1,4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜(DMSO)等多種有機(jī)溶劑中,從而形成印刷油墨,并負(fù)載大量的生物制劑。同時(shí)還可以通過對(duì)材料和溶劑比例進(jìn)行調(diào)整,進(jìn)而調(diào)節(jié)支架的表面形態(tài),從而仿生人體骨骼的微結(jié)構(gòu),達(dá)到提高細(xì)胞增殖和粘附的目的[9]。LAI等[10]利用低溫?cái)D出生物3D打印構(gòu)建了PLGA/β-TCP/Mg+骨修復(fù)支架。該支架不僅具備良好的力學(xué)性能和生物相容性,并且在Mg2+的存在下還具備良好的骨誘導(dǎo)性和光熱效應(yīng),此外,還可以針對(duì)性地解決內(nèi)固醇等骨科疾病。

目前,部分合成聚合物因其良好的生物相容性、生物可降解性以及可調(diào)節(jié)的力學(xué)性能而被用于模擬骨組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組織工程支架[11],主要包含聚-L-旋乳酸(PLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸-ε-己內(nèi)酯(PLCL)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等[12-15]。PLCL作為己內(nèi)酯和乳酸的共聚物,具備降解速度可控、柔韌性高、彈性可調(diào)和拉伸強(qiáng)度可調(diào)等優(yōu)勢(shì),因而引起研究人員的廣泛關(guān)注并已成功應(yīng)用到骨組織工程支架中[16]。然而,PLCL的降解周期過長(zhǎng),極大限制了PLCL在骨組織工程中的應(yīng)用[17]。因此,需要引入快速降解的生物材料對(duì)PLCL降解周期進(jìn)行調(diào)整。聚對(duì)二氧環(huán)己酮(PPDO)因其高柔韌性、良好的生物相容性、生物降解性快和高親水性的特征,被人們認(rèn)為是一種理想的生物材料,并被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)為臨床生物材料[18]。PAN等[19]報(bào)道了熔融3D打印不僅可以吸收胰腸,還可以通過使用不同比例的PPDO來改善聚乳酸降解速率和親水性,從而為PPDO改善PLCL的親水性和降解速率提供了可行性。

本研究將PPDO與PLCL共混,通過3D打印技術(shù)制備了兩種不同共混比例的PLCL/PPDO三維多孔骨修復(fù)支架PLCL91、 PLCL73。并以PLCL作為對(duì)照組,考察了共混材料的熱性能以及支架的表面形態(tài),并進(jìn)一步探究了PLCL/PPDO共混后對(duì)復(fù)合支架降解性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Fisher Nicolet 6700型傅立葉紅外光譜;DSC Q20型差式掃描量熱儀;MP Bioprint 3.0型生物印刷機(jī);AMRAY 1000B型掃描電子顯微鏡。

聚(L-丙交酯-己內(nèi)酯(PLCL)和聚二氧雜環(huán)乙酮(PPDO)均由組內(nèi)合成,純度>99.5%;六氟異丙醇,二氯甲烷為分析純。

(1) 紅外光譜實(shí)驗(yàn)

將2.0 mg樣品與200.0 mg溴化鉀粉末于瑪瑙研缽中順時(shí)針研磨2 min。之后將混合粉末加入壓片機(jī)中,升壓至15 Mpa,保持20 s。取出壓片進(jìn)行測(cè)試,通過OMNIC軟件對(duì)得到的譜圖進(jìn)行處理并標(biāo)峰。

(2) 熱力學(xué)性能表征

使用差示掃描量熱儀對(duì)PLCL、 PPDO原材料以及PLCL/PPDO共混支架的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以及熔融溫度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件為：在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下首先以10 ℃/min的速度降溫至-20 ℃,再以10 ℃/min的速度升溫至180 ℃。將得到的DSC曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2 PLCL/PPDO骨修復(fù)支架的制備

首先將PLCL及PLCL/PPDO分別按照10/0, 9/1和7/3的質(zhì)量比溶解到六氟異丙醇中。將生物3D打印機(jī)的填充密度設(shè)置為70%,用內(nèi)徑為0.4 mm的針頭在100 KPa氣壓下以15 mm/s的平均速度擠出。擠出成型后將支架置于-20 ℃條件下進(jìn)行冷凍干燥,直至溶劑完全蒸發(fā)。打印后的支架分別命名為PLCL, PLCL91和PLCL73。

1.3 PLCL/PPDO骨修復(fù)支架的性能表征

(1) 支架孔隙率表征

根據(jù)阿基米德定律,在以乙醇作為介質(zhì)的條件下,測(cè)試尺寸大小為1.0 mm×1.0 mm×4.0 mm的3D打印支架樣品(n=5),并計(jì)算支架的內(nèi)部孔隙率。每組支架選取尺寸大小為1.0 mm×1.0 mm×4.0 mm的樣品置于液氮中冷凍20 min,之后用虎口鉗對(duì)微球進(jìn)行脆斷處理,從而制得斷面樣品。

(2) SEM表征

將表面和斷面微球樣品分別進(jìn)行真空噴金處理5 min,并在5 kV條件下利用掃描電鏡觀測(cè)材料表面和斷面的微觀結(jié)構(gòu)。選取支架樣品SEM照片上10個(gè)孔徑,并采用Nano-measure方法對(duì)支架孔徑進(jìn)行處理和分析。

1.4 PLCL/PPDO骨修復(fù)支架的降解實(shí)驗(yàn)

將尺寸大小為1.0 mm×1.0 mm×4.0 mm的各組支架樣品試樣稱量并記下初始干重,之后將其置于10.0 mL離心管中。加入8.0 mL磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.4),然后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外模擬降解。依據(jù)設(shè)置的時(shí)間點(diǎn),在3, 5, 7, 11和15 w時(shí)取出樣品,用去離子水浸泡并沖洗3次,濾紙小心吸去表面水分并測(cè)量濕重。之后將樣品置于真空烘箱常溫烘干1 w至恒重并測(cè)量其干重。最后分別計(jì)算降解周期里各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的樣品質(zhì)量損失率和吸水率,同時(shí)測(cè)量每個(gè)降解時(shí)間點(diǎn)處待測(cè)樣品取出后模擬體液的pH值。

1.5 顯著性差異分析

所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析(ANOVA)。由Tukey’s多重比較檢驗(yàn)(SPSS Statistics 17.0, IBM Corp., USA)可知,當(dāng)P<0.0001, ****; P<0.0010, ***; P<0.0100, **; P<0.0500, *時(shí),該數(shù)據(jù)被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。而n, s:則不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLCL和PPDO的紅外表征

PLCL和PPDO的紅外譜圖如圖1所示。由圖1可知,1184.0 cm-1和1759.0 cm-1特征峰分別為PLCL上C—O伸縮振動(dòng)峰和C=O伸縮振動(dòng)峰。以上兩種波數(shù)在聚合物中都有明顯的特征吸收,證明了共聚物PLCL的化學(xué)結(jié)構(gòu)[20]。1755.5 cm-1處有一個(gè)尖而窄的吸收峰,該峰歸屬于C=O的伸縮振動(dòng)峰;2917.7 cm-1附近的峰為C—H伸縮振動(dòng);1186.2 cm-1處的峰為C—O的伸縮振動(dòng);在1430.5 cm-1處的峰為CH2基團(tuán)的彎曲振動(dòng),證明了共聚物PPDO的化學(xué)結(jié)構(gòu)[21]。

ν/cm-1圖1 PLCL和PPDO的紅外譜圖Figrue 1 Infrared spectra of PLCL and PPDO

Temperature/℃圖2 PPDO、 PLCL、 PLCL91和PLCL73的DSC曲線Figrue 2 DSC curves of PPDO, PLCL, PLCL91 and PLCL73

表1 材料PLCL和PPDO的粘度以及支架PLCL、PLCL91和PLCL73的玻璃轉(zhuǎn)化溫度Table 1 The viscosity of the materials PLCL and PPDO and the glass transition temperatures of the scaffolds PLCL, PLCL91 and PLCL73

2.2 PLCL和 PLCL/PPDO共混物支架的熱性能

采用差示掃描量熱法(DSC)對(duì)材料和支架進(jìn)行熱穩(wěn)定分析,其結(jié)果如圖2和表1所示。由圖2 DSC曲線可知,PLCL不存在結(jié)晶峰,屬于無規(guī)共聚物,因而其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)為36.8 ℃。而PPDO為結(jié)晶聚合物,Tg為-16.10 ℃。此外,也可以觀察到PLCL91和PLCL73也存在明顯的Tg,分別為35.89 ℃和36.20 ℃。從圖2還可以看出,PLCL91和PLCL73均存在明顯的熔融峰。其中,PLCL91在139.99 ℃處的熔融峰為PLCL的熔融峰。而PLCL73的兩個(gè)明顯的熔融峰分別屬于PPDO和PLCL。DSC的研究結(jié)果表明,PLCL和PPDO兩種聚合物不具備良好的相容性。

2.3 PLCL/PDOO骨修復(fù)支架表面形態(tài)表征

從圖3骨修復(fù)支架的SEM照片可知,所有支架均為白色且尺寸(25.0 mm×200.0 mm×1.0 mm)大小一致,孔洞分布規(guī)則均勻。利用掃描電鏡檢測(cè)支架中大孔的平均尺寸和形貌,其結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,支架的孔徑為400.0 μm,各組之間無顯著性差異。PLCL支架表面較為光滑,然而隨著PPDO的加入,可以觀察到支架表面粗糙程度明顯增加。這種粗糙的表面形態(tài)有利于成骨細(xì)胞的增殖和粘附。此外,PLCL支架的斷面和表面相同,都較為光滑。然而,在PLCL91支架的內(nèi)部可以看到明顯的相分離現(xiàn)象,這是由于PPDO以均勻的顆粒形式分布在PLCL中,為典型的海島結(jié)構(gòu)。在PLCL73的支架內(nèi),相分離現(xiàn)象進(jìn)一步加深,PPDO顆粒變大,并且分布極不均勻。這些現(xiàn)象可以說明PLCL與PPDO之間的相容性不佳,該結(jié)果與DSC分析結(jié)果一致。通過乙醇浸泡法檢測(cè),支架的平均孔隙率均約為60%(表2)。據(jù)文獻(xiàn)顯示,孔徑大于300.0 μm、孔隙率大于50%的生物材料支架因其良好的血管化性能而成為骨替代植入物的首選材料[2]。

圖3 PLCL、 PLCL91和PLCL73支架的宏觀照片和SEM照片

圖4 PLCL、 PLCL91和PLCL73支架斷面的SEM照片

Table 2 Pore size and pore space of PLCL, PLCL91 and PLCL73 scaffolds

2.4 PLCL/PPDO骨修復(fù)支架的降解

在復(fù)合骨修復(fù)支架浸泡的PBS微環(huán)境中,溶液的pH值隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖5所示。由圖5可知,隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),各個(gè)支架的pH值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中,PLCL的下降速率最慢,在浸泡時(shí)間達(dá)到12 w時(shí),pH降低至7.22,之后變化不明顯。而對(duì)于PLCL91和PLCL73,在浸泡時(shí)間達(dá)到15 w后,pH分別下降至6.70和6.20。值得注意的是,PLCL73在整個(gè)降解的過程中,各個(gè)降解時(shí)間點(diǎn)上的pH始終低于其他兩組支架,說明支架中PPDO的含量越多,支架的pH下降越快,這種現(xiàn)象主要是由PPDO的酸性降解以及降解過程中的自加速效應(yīng)導(dǎo)致的。

Time/weeks圖5 降解過程中PLCL、 PLCL91和PLCL73支架的pHFigrue 5 pH values of PLCL, PLCL91 and PLCL73 scaffolds during degradation

Time/weeks圖6 降解過程中PLCL、 PLCL91和PLCL73支架的質(zhì)量損失Figrue 6 Mass loss of PLCL, PLCL91 and PLCL73 scaffolds during degradation

浸泡過程中,復(fù)合骨修復(fù)支架的質(zhì)量損失隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖6所示。由圖6可知,在浸泡15 w期間,PLCL與PLCL91的降解趨勢(shì)接近,說明兩者降解速率基本相同。而在15 w后,支架的質(zhì)量損失為15.72%±1.25%。然而,當(dāng)支架中PPDO組分達(dá)到30%后,PLCL73支架在降解1 w后的質(zhì)量損失就已達(dá)到23.00±2.12%,高于PLCL和PLCL91在12 w時(shí)的質(zhì)量損失。當(dāng)支架降解12 w后,PLCL73支架的質(zhì)量損失為60.30%±2.30%,由此可見,PPDO可明顯加速PLCL降解。

通過計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸水率,便于檢測(cè)支架的親水和疏水行為。復(fù)合骨修復(fù)支架的吸水率隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖7所示。由圖7可知,PPDO的加入對(duì)于PLCL/PPDO復(fù)合骨支架的吸水率存在顯著影響。在浸泡了15 w后,PLCL91和PLCL73支架的吸水率分別達(dá)到21.20%±4.21%和35.10%±2.21%,而PLCL的吸水率較低,僅有19.10%±2.30%。PLCL/PPDO復(fù)合骨支架的降解加速效應(yīng)可能是由于PPDO和PLCL的相容性不佳,從而使得支架內(nèi)部存在相分離現(xiàn)象。因此,在支架降解過程中,PPDO首先降解成小分子PDO,由支架內(nèi)部向表面遷移,并向外擴(kuò)散,從而產(chǎn)生了孔洞和裂縫,進(jìn)而導(dǎo)致支架的吸水率增大,同時(shí)這也是支架質(zhì)量損失增加的原因。

本文首次采用生物3D打印制備出PLCL, PLCL91和PLCL73 3種復(fù)合骨修復(fù)支架。該系列支架具有良好的孔隙率(60%)和規(guī)則均勻的孔隙(400 μm)。相較于PLCL支架,PPDO的加入增加了復(fù)合支架表面的粗糙程度。由于PLCL和PPDO之間的相容性較差,支架內(nèi)部的相分離現(xiàn)象會(huì)隨著PPDO組分的增加進(jìn)一步增強(qiáng)。支架降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PPDO的加入可有效調(diào)整支架的降解周期,彌補(bǔ)PLCL支架的降解速度過慢的缺陷,使其更好地符合骨修復(fù)速度。因此利用生物3D打印PLCL/PPDO基復(fù)合骨支架在骨修復(fù)支架領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景。

Time/weeks圖7 PLCL、 PLCL91和PLCL73支架的在降解過程中的吸水率Figrue 7 Water uptake of PLCL, PLCL91 and PLCL73 scaffolds during degradation