張 愈， 王曉宇， 周 興， 邱 菊， 昝林森,3， 李安寧,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.四川省龍日種畜場(chǎng)，四川 紅原 624400；3.國(guó)家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)由4個(gè)基因編碼組成，分別為PDHA、PDHB、PDHC和PDHD，是參與糖代謝和脂肪酸代謝過程的關(guān)鍵酶[1-2]。其中丙酮酸脫氫酶β亞基(pyruvate dehydrogenase β subunit，PDHB)可催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，是將糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝途徑連接起來的關(guān)鍵酶[3]。PDHB基因突變或缺陷會(huì)導(dǎo)致一系列代謝疾病的發(fā)生[4-6]。在帕金森疾病相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，PDHB基因表達(dá)水平的改變導(dǎo)致血漿中丙酮酸的含量明顯升高[7]。在癌癥相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)PDHB基因的過表達(dá)能夠促使丙酮酸代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)過程，而不是糖酵解過程，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，從而可以減緩癌癥進(jìn)程[8-11]。近年來，也有研究表明，PDHB基因的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪(IMF)含量呈正相關(guān)。通過對(duì)大理石紋含量高和低的兩組牛骨骼肌進(jìn)行差顯PCR(ddPCR)分析，發(fā)現(xiàn)PDHB基因的表達(dá)存在顯著差異[12]。在對(duì)豬IMF的研究中，也發(fā)現(xiàn)PDHB基因的表達(dá)水平與IMF呈正相關(guān)[13]。在對(duì)瘦肉型和脂肪型北京鴨的肝臟進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究發(fā)現(xiàn)，PDHB基因的蛋白表達(dá)量存在顯著差異[14]。我們的前期研究中也發(fā)現(xiàn)：在瘦肉型(長(zhǎng)白豬)和脂肪型(藍(lán)塘豬)豬中的PDHB基因的蛋白表達(dá)量存在顯著差異[15]。因此，我們推測(cè)PDHB基因可能在肌內(nèi)脂肪的形成過程中起著重要的作用。我們還對(duì)牛PDHB基因的啟動(dòng)子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋β和肌細(xì)胞生成素很可能是調(diào)控該基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[16]。

目前，關(guān)于PDHB基因在牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的功能尚不清楚。本研究擬采用秦川牛背最長(zhǎng)肌組織作為試驗(yàn)材料，克隆秦川牛PDHB基因。利用AdEasy-1系統(tǒng)構(gòu)建牛PDHB基因的高滴度重組腺病毒，從而能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)該基因,為研究該基因在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中的功能提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)用到的cDNA是以24月齡秦川公牛背最長(zhǎng)肌提取RNA后反轉(zhuǎn)錄而來的(由本實(shí)驗(yàn)室保存)；腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV、含有骨架載體pAdEasy-1的E.coliBJ5183菌株、HEK 293A細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基、瓊脂糖、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA、脂質(zhì)體LipofectaminTM2000、胎牛血清FBS均購自美國(guó)invitrogen公司；Top10-gold感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提中量抽提試劑盒、無內(nèi)毒素大提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；Trans2K Plus II DNA Marker購自北京全式金生物公司；pGEM-T Easy載體、DNA T4連接酶購自Promega公司；DL2000 Marker、λ-HindⅢ digest marker、KOD高保真DNA聚合酶、熒光定量PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ、KpnI和NotI均購自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNA引物合成和測(cè)序均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 秦川牛PDHB基因的克隆 根據(jù)牛PDHB基因mRNA(GenBank Accession No.NM_001035435)序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列為PDHB-F：AGATGGCGGTGGTTGCTGTG；PDHB-R：ATTAAAAGGTCTTATGGGAT，PCR產(chǎn)物大小為1 166 bp。以肌肉cDNA為模板，用KOD高保真DNA聚合酶擴(kuò)增牛PDHB基因，PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：模板1.2 μL，引物F/R(10 μmol/L)各0.6 μL，KOD酶0.4 μL，10×Buffer 2.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Mg2+2.0 μL，ddH2O 12.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終止反應(yīng)10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。用DNA片段回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后連接到pGEM-T Easy載體，接著轉(zhuǎn)化到Top10-gold感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，菌液PCR鑒定正確后送測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。以測(cè)序正確的菌液為模板，引物序列為gPDHB-F：GGggtaccAGATGGCGGTGGTTGCTGTG；gPDHB-R：ATAAGAATgcggccgcATTAAAAGGTCTTATGGGAT(小寫字母分別為引入的KpnI和NotI酶切位點(diǎn))，進(jìn)行亞克隆牛PDHB基因的CDS序列，PCR產(chǎn)物大小為1 080 bp。PCR反應(yīng)體系同前。反應(yīng)條件退火溫度為62 ℃，其余條件也同前。PCR產(chǎn)物純化后連接到pGM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化后挑取pGMT-PDHB陽性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，菌液PCR鑒定正確后送測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 腺病毒Ad-PDHB的構(gòu)建及鑒定 (1)重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-PDHB的構(gòu)建及鑒定。將pGMT-PDHB重組質(zhì)粒和pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到后Top10-gold感受態(tài)細(xì)胞后挑取pAdTrack-CMV-PDHB陽性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

(2)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PDHB的構(gòu)建及鑒定。將pAdTrack-CMV-PDHB重組質(zhì)粒用PmeⅠ線性化后，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到含有骨架載體pAdEasy-1的E.coliBJ5183感受態(tài)細(xì)胞。挑取pAd-PDHB陽性克隆，搖菌后提取質(zhì)粒。用PacⅠ對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PDHB進(jìn)行酶切鑒定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆、菌液鑒定后送測(cè)序驗(yàn)證。

(3)腺病毒Ad-PDHB的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定。取5 μg無內(nèi)毒素試劑盒提取重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PDHB，用PacⅠ酶切后回收大片段。當(dāng)HEK 293A細(xì)胞生長(zhǎng)到80%左右時(shí)，按脂質(zhì)體LipofectaminTM3000說明書2 μg質(zhì)粒/孔轉(zhuǎn)染，進(jìn)行重組腺病毒Ad-PDHB包裝。將細(xì)胞置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育6 h后換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，將細(xì)胞傳代于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中。每天觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，再傳到75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每天觀察瓶?jī)?nèi)出毒跡象，即細(xì)胞收縮變圓和脫落情況。轉(zhuǎn)染12～14 d后，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變反應(yīng)，且有50%以上細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落后收集細(xì)胞，-80 ℃/37 ℃反復(fù)凍融3次，10 000 g離心10 min，收集病毒上清，即為第1代病毒母液P1。將P1病毒再次感染HEK 293A細(xì)胞，感染48 h后收集細(xì)胞，-80 ℃/37 ℃反復(fù)凍融3次，10 000 g離心10 min收集病毒上清，標(biāo)記為P2。同樣方法用P2代病毒感染大量的HEK 293A細(xì)胞擴(kuò)增病毒至P3代。取200 μL的P3代病毒沸水孵育10 min后立即冰浴，短暫離心后取上清用于PCR鑒定模板。PCR鑒定反應(yīng)體系和條件同1.2.1。將收集的高滴度病毒懸液用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度的方法[17-18]。

1.2.3 重組腺病毒Ad-PDHB的活性鑒定 當(dāng)牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)到80%左右時(shí)，分別侵染高滴度病毒Ad-PDHB和Ad-EGFP。侵染48 h后觀察綠色熒光表情況，收集細(xì)胞提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)PDHB基因的表達(dá)情況。定量引物為PDHB-RT-F：TCTGAGATGGGCTTTGCTGG，PDHB-RT-R：TGACCTGGTCGATGGCTTGC，PCR產(chǎn)物大小為109 bp。以牛GAPDH基因(Accession No. NM_001034034)作為內(nèi)參，引物為：GAPDH-RT-F：CCAACGTGTCTGTTGTGGAT，GAPDH-RT-R：CTGCTTCACCACCTTCTTGA[19]，PCR產(chǎn)物大小為80 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛PDHB基因的克隆及鑒定

通過克隆獲得條帶單一的PCR產(chǎn)物大小為1 166 bp(圖1)，膠回收后連接到pGM-T Easy載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，目的基因與數(shù)據(jù)庫GenBank收錄的序列一致。設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行亞克隆獲得1 080 bp的條帶單一的PCR產(chǎn)物(圖2)，即為牛PDHB基因的CDS序列，膠回收后連接到pGM-T Easy載體，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證無誤。說明牛PDHB基因克隆成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

注：M為DL2000 DNA marker；1-2為PDHB基因PCR產(chǎn)物。

注：M為DL2000 DNA marker；1為PDHB基因CDS序列>PCR產(chǎn)物。

2.2 重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-PDHB的鑒定

限制性內(nèi)切酶KpnI和NotI雙酶切pAdTrack-CMV-PDHB質(zhì)粒，得到大小分別約為9 kb和1 kb的兩條條帶(圖3)，符合預(yù)期。說明重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-PDHB構(gòu)建成功，可與腺病毒骨架載體重組。

注：M為Trans2K Plus II DNA Marker；1為雙酶切產(chǎn)物。

2.3 腺病毒重組質(zhì)粒pAd-PDHB的鑒定

將經(jīng)PmeⅠ酶切線性化的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-PDHB轉(zhuǎn)化到含有pAdEasy-1的E.coliBJ5183感受態(tài)。提取質(zhì)粒后PacⅠ酶切鑒定，電泳檢測(cè)到兩條大小分別約為30 kb和4.5 kb(圖4)的電泳條帶，初步證明腺病毒重組質(zhì)粒pAd-PDHB重組成功。后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，表明pAd-PDHB重組成功，可進(jìn)行下一步的腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)。

注：M為λ-HindⅢ digest marker；1為PacⅠ酶切產(chǎn)物。

2.4 腺病毒Ad-PDHB的包裝、擴(kuò)繁及滴度測(cè)定

將經(jīng)PacⅠ酶切線性化后的30 kb左右的大片段膠回收后，轉(zhuǎn)染HEK 293A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h，Ad-PDHB在熒光顯微鏡下已能看到少量細(xì)胞開始出現(xiàn)綠色熒光；10 d時(shí)，綠色熒光數(shù)明顯增多，視野變亮并在局部出現(xiàn)葡萄串樣熒光聚集，呈彗星狀；13 d時(shí)，綠色熒光鋪滿整個(gè)視野，大量細(xì)胞病變脫落，出現(xiàn)明顯的空斑(圖5)。而空白對(duì)照組Ad-EGFP，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)也出現(xiàn)綠色熒光；7 d時(shí)，呈現(xiàn)彗星狀；11 d時(shí)，大量細(xì)胞病變脫落，出現(xiàn)明顯的空斑(圖5)。反復(fù)感染HEK 293A細(xì)胞3次后獲得高滴度病毒。滴度病毒用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度，滴度為1.66×109PFU/mL。

圖5 重組腺病毒Ad-PDHB的包裝

2.5 病毒活性鑒定

重組腺病毒Ad-PDHB感染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞48 h后，觀察到大量的綠色熒光(圖6)，表明病毒感染效率較高。收集細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明感染腺病毒Ad-PDHB的PDHB基因表達(dá)量比對(duì)照組Ad-EGFP高25.5倍(圖7)。

注：A為重組腺病毒Ad-PDHB；B為對(duì)照組Ad-EGFP；C為空白對(duì)照。

圖7 牛PDHB基因在感染48 h的相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

IMF含量是影響肉質(zhì)的重要因素之一，對(duì)肉的風(fēng)味、多汁性和嫩度都有影響[16,20]，而PDHB基因的表達(dá)水平又與IMF含量呈正相關(guān)[12-15]，因此PDHB基因很可能是影響肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因。在前期研究中，我們已對(duì)牛PDHB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)C/EBPβ和MYOG很可能是調(diào)控牛PDHB基因表達(dá)的兩個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子[16]。

本研究首先通過設(shè)計(jì)特異引物，將牛PDHB基因克隆出來，然后再通過設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行亞克隆獲得牛PDHB基因的CDS區(qū)，采用此方法可以有效提高克隆的效率[21-23]。目前，將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞表達(dá)的載體主要有兩類。一類是非病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，常見的為pCDNA3.1(±)非融合性真核細(xì)胞表達(dá)載體，其優(yōu)點(diǎn)是安全性高、毒性小、外源基因長(zhǎng)度不受限制，缺點(diǎn)為效率較低，在細(xì)胞中屬于瞬時(shí)表達(dá)，表達(dá)時(shí)間較短[24]；另一類是病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，常見的有慢病毒(屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)載體系統(tǒng)和腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可將外源基因整合到靶細(xì)胞基因組，持久穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，缺點(diǎn)為可引起人獲得性免疫缺陷癥，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的安全級(jí)別要求較高[25]。腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生的病毒顆粒比較穩(wěn)定，裝載量大(可插入約10 kb的外源基因)，對(duì)人的致病性低，且能將外源基因在靶細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)10 d以上[26]。本研究中使用的AdEasy腺病毒表達(dá)載體已在基因的功能研究中廣泛應(yīng)用[27-28]。

本研究通過構(gòu)建秦川牛PDHB基因的腺病毒過表達(dá)載體系統(tǒng)，為接下來研究PDHB基因在牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建了秦川牛PDHB基因的重組腺病毒表達(dá)載體，重組腺病毒Ad-PDHB能夠在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)PDHB基因。