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        不同激活比例和干預(yù)頻率富血小板血漿對大白兔 半月板損傷修復(fù)的效果研究

        2022-10-27 09:45:02仇建軍石文俊鄒翰林張磊
        國際骨科學(xué)雜志 2022年5期
        關(guān)鍵詞:大白兔半月板軟骨

        仇建軍 石文俊 鄒翰林 張磊

        既往臨床認(rèn)為半月板是無功能的殘留物,但隨著運動醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,對半月板功能的認(rèn)識越來越深入,半月板的功能也被熟知[1]。半月板損傷是臨床上常見的關(guān)節(jié)損傷類型,近年越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)富血小板血漿(PRP)在半月板損傷修復(fù)中起到重要作用,但對于PRP的激活方式及比例、應(yīng)用方式、應(yīng)用頻率均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[2]。本研究以大白兔為研究對象,分為Ⅰ期和Ⅱ期試驗,分析PRP不同激活比例和干預(yù)頻率對半月板修復(fù)的影響,進一步為臨床應(yīng)用PRP治療半月板損傷提供理論依據(jù),現(xiàn)報告如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2021年4月至2021年6月期間上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實驗室培養(yǎng)的成年健康大白兔68只作為研究對象,其中雄性大白兔35只,雌性大白兔33只,年齡1~2歲,平均年齡(1.4± 0.2)歲,體質(zhì)量為2.3~3.3 kg,平均體質(zhì)量(2.8± 0.3) kg。所有大白兔雙膝均建立半月板損傷模型,以關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP凝膠的右膝關(guān)節(jié)為試驗組,以關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不含PRP凝膠的左膝關(guān)節(jié)為對照組,進行Ⅰ期試驗和Ⅱ期試驗。

        1.2 方法

        1.2.1 半月板損傷建模

        所有大白兔雙膝進行半月板損傷建模,麻醉后內(nèi)側(cè)入路切開內(nèi)側(cè)副韌帶做一長2 cm弧形的切口,沿髕骨內(nèi)側(cè)上緣至脛骨結(jié)節(jié),切開所有皮膚和皮下組織。半月板拉鉤顯露出內(nèi)側(cè)半月板前角、體部和股骨踝軟骨面。采用刀片在內(nèi)側(cè)半月板游離緣做一長0.6 cm的縱行全層裂傷,術(shù)后縫合關(guān)節(jié)囊,肌注60萬單位青霉素以預(yù)防術(shù)后感染。

        1.2.2 PRP凝膠制備

        采集兔血標(biāo)本置入離心管旋轉(zhuǎn)離心,離心力200 g,離心時間10 min。離心結(jié)束后兔血呈上、下2層,上層為血清,下層為血漿,血清與血漿交界處有一薄層,即為富血小板。保留上層血清,交換血清下層1~2 mm處的紅細(xì)胞,去除含紅細(xì)胞的底層液體。以200 g的離心力對血清液體進行旋轉(zhuǎn)離心10 min,使血小板聚集在離心管底部。去除離心管內(nèi)大部分上層血清,約占血清總量的3/4。將剩余的血清液體搖勻,得到PRP。在PRP中加入激活劑,等待6~10 s,可形成PRP凝膠。

        1.2.3 干預(yù)方法

        Ⅰ期試驗:將36只大白兔右膝關(guān)節(jié)按隨機數(shù)字表法分為A、B、C 3組,每組各12膝,以大白兔左膝關(guān)節(jié)為對照組。A、B、C組大白兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射激活比例為3∶1、5∶1、7∶1的自體PRP凝膠,對照組大白兔左膝關(guān)節(jié)腔注射不含PRP的凝膠,每周注射1次,且均在注射后使用夾板固定膝關(guān)節(jié)2周。

        Ⅱ期試驗:將32只大白兔右膝關(guān)節(jié)按隨機數(shù)字表法分為A、B、C、D 4組,每組各8膝,以大白兔相應(yīng)左膝關(guān)節(jié)為對照1、2、3、4組。A組僅進行1次右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)PRP凝膠注射治療,對照1組左膝關(guān)節(jié)腔注射1次不含PRP的凝膠;B組每周進行1次右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)PRP凝膠注射治療,對照2組左膝關(guān)節(jié)腔每周注射1次不含PRP的凝膠;C組每2周進行1次右膝關(guān)節(jié)腔PRP凝膠注射治療,對照3組左膝關(guān)節(jié)腔每2周注射1次不含PRP的凝膠;D組每4周進行1次右膝關(guān)節(jié)腔PRP凝膠注射治療,對照4組左膝關(guān)節(jié)腔每4周注射1次不含的PRP凝膠。所有大白兔注射的PRP激活比例均為7∶1,且在所有治療結(jié)束后進行夾板固定膝關(guān)節(jié)2周。

        1.2.4 大白兔處理方法

        Ⅰ期試驗:PRP凝膠治療后4、8、12周,每組分別以空氣栓塞的方式處死4只大白兔,取大白兔半月板,對半月板標(biāo)本采用10%甲醛固定液固定、洗滌、脫鈣、透明、透蠟、包埋等,制備成石蠟切片,蘇木精-伊紅染色(HE染色),在光學(xué)顯微鏡下觀察半月板的結(jié)構(gòu)情況。

        Ⅱ期試驗:于PRP凝膠治療后第8周和第12周,每組分別處死4只大白兔,以空氣栓塞的方式處死大白兔,取大白兔半月板,將半月板標(biāo)本采用10%甲醛固定液固定、洗滌、脫鈣、透明、透蠟、包埋等,制備成石蠟切片,HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察半月板的結(jié)構(gòu)情況。

        1.3 觀察指標(biāo)

        根據(jù)石蠟切片觀察Ⅰ、Ⅱ期試驗不同時期大白兔半月板損傷愈合情況。愈合等級評估標(biāo)準(zhǔn)[3]:Ⅰ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣整齊,無纖維組織增生,無幼稚成纖維細(xì)胞;Ⅱ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣新生膠原纖維,創(chuàng)緣可見軟骨細(xì)胞密度增大;Ⅲ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣內(nèi)有膠原纖維填充,但填充區(qū)域無纖維軟骨細(xì)胞或未形成軟骨陷窩;Ⅳ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣內(nèi)存在大量膠原纖維填充,有少量纖維軟骨細(xì)胞或形成軟骨陷窩;Ⅴ級為切片無法辨認(rèn)創(chuàng)緣,纖維軟骨分布均勻。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料用百分比表示,采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 Ⅰ期試驗

        2.1.1 4周時半月板愈合等級比較

        Ⅰ期試驗4周時,A、B、C組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),3組與對照組半月板愈合等級差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

        表1 Ⅰ期試驗4周時半月板愈合等級比較/側(cè)

        2.1.2 8周時半月板愈合等級比較

        Ⅰ期試驗8周時,A、B、C組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),A、B組與對照組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),C組與對照組半月板愈合等級差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)(表2)。

        表2 Ⅰ期試驗8周時半月板愈合等級比較/側(cè)

        2.1.3 12周時半月板愈合等級比較

        Ⅰ期試驗12周時,C組半月板愈合等級優(yōu)于A組、B組和對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);A組、B組與對照組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

        表3 Ⅰ期試驗12周時半月板愈合等級比較/側(cè)

        A組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有膠原纖維組織填充,相互編織連接,但未發(fā)現(xiàn)纖維軟骨細(xì)胞,無軟骨凹陷形成(下頁圖1a)。B組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有膠原纖維組織填充,相互編織連接,有軟骨陷窩形成(下頁圖1b)。C組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有大量膠原纖維組織填充,相互編織連接,還有少數(shù)纖維軟骨細(xì)胞和軟骨陷窩形成(下頁圖1c)。對照組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)創(chuàng)面邊緣整齊,無明顯纖維組織增生,無幼稚成纖維細(xì)胞生成(下頁圖1d~f)。

        圖1 Ⅰ期試驗12周時,HE染色(×100) a. A組 b. B組 c. C組 d~f. 對照組

        2.2 Ⅱ期試驗

        2.2.1 8周時半月板愈合等級比較

        Ⅱ期試驗8周時,A、B、C、D組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);A、B、C、D組半月板愈合等級均優(yōu)于對照1、2、3、4組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(下頁表4)。

        表4 Ⅱ期試驗8周時半月板愈合等級比較/側(cè)

        2.2.2 12周時半月板愈合等級比較

        Ⅱ期試驗12周時,A、B、C、D 4組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);4組半月板愈合等級均優(yōu)于對照1、2、3、4組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表5)。

        表5 Ⅱ期試驗12周時半月板愈合等級比較/側(cè)

        A、B、C、D組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有膠原組織填充,相互編織連接,偶有發(fā)現(xiàn)軟骨陷窩形成(圖2a~d)。對照1、2、3、4組HE染色顯示左側(cè)損傷區(qū)局部無明顯纖維組織增生,未發(fā)現(xiàn)幼稚成纖維細(xì)胞(圖2e~h)。

        圖2 Ⅱ期試驗12周時,HE染色(×100) a. A組 b. B組 c. C組 d. D組 e. 對照1組 f. 對照2組 g. 對照3組 h. 對照4組

        3 討論

        PRP來源廣泛,制備簡單,且安全性較高,被臨床廣泛應(yīng)用于組織修復(fù),在肌肉、肌腱、韌帶、創(chuàng)面、骨損傷中均具有良好的應(yīng)用前景[4-5]。李朝暉等[6]研究發(fā)現(xiàn),PRP具有損傷小、療程短、不易復(fù)發(fā)、安全性高等優(yōu)勢。史昱暉等[7]研究發(fā)現(xiàn),PRP在緩解膝關(guān)節(jié)疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能方面具有較好效果,能明顯提高關(guān)節(jié)功能,改善患者生活質(zhì)量。因此,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PRP在修復(fù)關(guān)節(jié)損傷中也有良好效果[8-10]。

        半月板是脛骨關(guān)節(jié)面上內(nèi)側(cè)和外側(cè)半月形狀骨,其血供局限于外側(cè)1/3,來源于半月板前后角韌帶滑膜套。半月板內(nèi)側(cè)1/3無毛細(xì)血管,因此內(nèi)側(cè)1/3又稱為無血運區(qū),由于缺少血供,損傷后難以修復(fù)[11-13]。近年來越來越多的學(xué)者進行大量體外研究,發(fā)現(xiàn)采用PRP治療半月板損傷具有較好的修復(fù)作用[14-16]。但體內(nèi)實驗的結(jié)果卻不盡人意。臨床上對于PRP的激活方式、激活比例、應(yīng)用方式、應(yīng)用頻率等均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),因此探究PRP的激活比例、應(yīng)用頻率等,有助于為臨床應(yīng)用PRP治療半月板損傷提供統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究對我院培養(yǎng)的大白兔雙膝進行半月板損傷建模,應(yīng)用不同激活比例和不同干預(yù)頻率分別進行Ⅰ期和Ⅱ期試驗。Ⅰ期試驗結(jié)果顯示,在治療4周后,3∶1、 5∶1以及7∶1的PRP激活比例治療半月板損傷效果并無明顯差異,A、B、C組與對照組治療效果也無明顯差異;治療后8周和12周時,C組半月板愈合等級明顯優(yōu)于A組、B組和對照組。究其原因,前4周治療效果不明顯可能是由于治療時間尚短,效果并不突出;治療后8周和12周,7∶1 激活比例的PRP對半月板損傷的修復(fù)效果較佳,明顯優(yōu)于3∶1和5∶1激活比例的PRP,提示7∶1 激活比例的PRP修復(fù)半月板損傷效果較好。Ⅱ期試驗結(jié)果顯示,無論治療8周還是12周,A、B、C、D組半月板愈合等級均無差異,且4組均優(yōu)于對照1、2、3、4組,結(jié)果提示不同干預(yù)頻率的PRP注射并不會影響PRP對半月板損傷的愈合效果,且對半月板損傷均具有較好修復(fù)效果。這可能是由于血小板源性生長因子體內(nèi)代謝及關(guān)節(jié)活動影響了組織修復(fù)[17]。

        綜上所述,半月板損傷修復(fù)主要取決于PRP凝膠制備時的激活比例,7∶1的PRP凝膠對半月板損傷修復(fù)效果最佳。而PRP凝膠注射頻率對半月板的影響,仍然需要進一步深入研究。

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