楊文權(quán)，劉 玲，吳 娜，張躍進，孫建華，張小燕

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西漢王略陽中藥科技有限公司，陜西 略陽 724300；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)是屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)泡頭菌科(Physalacriaceae)蜜環(huán)菌屬(Armillaria)非常重要的真菌[1]。因其含有多種倍半萜類化合物、多糖、氨基酸及各種微量元素等，具有免疫調(diào)節(jié)、護肝、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用和重要的食用、藥用價值[2-4]。同時，蜜環(huán)菌又是名貴中藥材天麻(Gastrodiaelata)的共生菌，而天麻沒有根莖葉，只有開花時花莖才抽出地面，其余時間都在地下，營養(yǎng)來源全憑共生的蜜環(huán)菌供給，因此，蜜環(huán)菌是天麻生長中唯一的外來營養(yǎng)源，是天麻栽培中不可缺少的材料[5-6]。

蜜環(huán)菌菌種在生產(chǎn)中分為三個級別，一級母種用于保存和運輸，二級原種用于擴大繁殖，三級栽培種用于生產(chǎn)栽培[7]。其中，一級母種培養(yǎng)基可以確保蜜環(huán)菌得以良好保藏和運輸，三級栽培種培養(yǎng)基可以確保生產(chǎn)出優(yōu)良、健壯的蜜環(huán)菌，服務(wù)天麻生產(chǎn)，因此，在蜜環(huán)菌生產(chǎn)中非常重要。蜜環(huán)菌生長過程中需要不同的營養(yǎng)源，主要包括碳源、氮源、無機鹽等[8]，已有研究表明，雖然蜜環(huán)菌可利用多種營養(yǎng)源，但對最有效利用的營養(yǎng)源有選擇[9]，因此，不同配方的母種和栽培種培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌的生長情況不同。在適宜的培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌萌發(fā)速度快，菌索白嫩、粗壯，分枝多，生物量大，不僅可以縮短蜜環(huán)菌培養(yǎng)時間，降低蜜環(huán)菌生產(chǎn)成本，而且培養(yǎng)的蜜環(huán)菌健壯，在天麻栽培過程中可快速形成菌索侵染菌棒，與天麻建立共生關(guān)系后，盡早為天麻提供營養(yǎng)，提高天麻產(chǎn)量和質(zhì)量[10-11]。雖然蜜環(huán)菌母種和栽培種培養(yǎng)基配方已有很多研究，但由于菌株不同，研究結(jié)果差異較大，在實際中無法通用[9,12]。為此，本試驗擬以寧強真菌研究所分離的1株蜜環(huán)菌MC4為對象，研究其最佳的一級母種和三級栽培種培養(yǎng)基，給該蜜環(huán)菌的商品化及蜜環(huán)菌的育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試蜜環(huán)菌菌株編號MC4，由寧強真菌研究所分離提供，經(jīng)rDNA-ITS序列分析鑒定為蜜環(huán)菌(Armillariamellea)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化 將MC4母種從冰箱取出，室溫黑暗放置24 h，接種到PDA平板中央，于25 ℃黑暗下培養(yǎng)，待菌索長滿平板備用。

1.2.2 蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)基配方

(1)不同碳源培養(yǎng)基

1 L培養(yǎng)基，加碳源(紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米粉、麥芽浸粉)20 g，蛋白胨10 g，MgSO41 g，KH2PO42 g、瓊脂15 g。

(2)不同氮源培養(yǎng)基

1L培養(yǎng)基，加氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏)10 g，葡萄糖 20 g，MgSO41 g，KH2PO42 g，瓊脂15 g。

(3)不同無機鹽培養(yǎng)基

1L培養(yǎng)基，加無機鹽(MnSO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4)2 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g。

1.2.3 蜜環(huán)菌栽培種培養(yǎng)基配方

(1)Ⅰ號培養(yǎng)基

櫟木木屑50%，棉籽殼30%，麩皮18%，石膏1%，生石灰0.5%，蔗糖0.4%,KH2PO40.1%，料水比1∶1.4 kg·L-1，裝入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(2)Ⅱ號培養(yǎng)基

櫟木枝條40%，水60%。其中，櫟木枝條210 g，水315 mL，裝入650 ml細口組培瓶。

(3)Ⅲ號培養(yǎng)基

櫟木枝條50%，麩皮20%，木屑20%，玉米面7%，石膏1%，白糖2%，料水比1∶1.4 kg·L-1，裝入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(4)Ⅳ號培養(yǎng)基

櫟木枝條40%，馬鈴薯汁60%，其中馬鈴薯汁由去皮馬鈴薯200 g·L-1煮沸制成。其中，櫟木枝條210 g，馬鈴薯汁315 ml，裝入650 ml細口組培瓶。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備 12種母種培養(yǎng)基分別按配方配制，裝入18 mm×200 mm的試管，每管裝35 ml，橡膠塞封口，121 ℃滅菌20 min，取出后自然冷卻凝固，待用。4種栽培種培養(yǎng)基封口后121 ℃滅菌4 h，備用。

1.2.4 接種 母種培養(yǎng)基每試管接活化菌株1塊(0.5 cm直徑菌塊)，栽培種每袋(瓶)接種活化菌株4塊，每處理3個重復(fù)，25 ℃，黑暗培養(yǎng)。

1.3 測試指標(biāo)

1.3.1 蜜環(huán)菌的吃料深度 蜜環(huán)菌深入試管、袋子或瓶中培養(yǎng)基的深度，每3 d測1次。

1.3.2 蜜環(huán)菌的生物量 培養(yǎng)45 d后，將試管中的培養(yǎng)基和蜜環(huán)菌菌索一起倒出，蜜環(huán)菌菌索與培養(yǎng)基分離后用蒸餾水沖洗，60 ℃烘箱烘12 h，稱重。

1.3.3 菌索的直徑 從袋子或瓶子外面，隨機挑選10個菌索，測量其直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用Excel 2016進行初步處理，用SPSS18.0軟件進行One-way ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同母種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌MC4的影響

2.1.1 不同碳源對蜜環(huán)菌MC4生長的影響 由圖1可以看出，蜜環(huán)菌MC4在以紅薯淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲萌發(fā)最早，第9 d開始萌發(fā)，在馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基上菌絲萌發(fā)最晚，15 d以后才開始萌發(fā)。以麥芽浸粉為碳源的培養(yǎng)基菌絲萌發(fā)的最初一段時間生長迅速，在21 d時，吃料深度已達8.533 cm。在4種不同碳源培養(yǎng)基中，玉米粉培養(yǎng)基上蜜環(huán)菌的菌索生長速度最慢，36 d時，吃料深度只有3.833 cm，顯著低于(P<0.05)在其它3個碳源培養(yǎng)基上的吃料深度。培養(yǎng)36 d時，以紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉及麥芽浸粉為碳源的3個培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蜜環(huán)菌的吃料深度無顯著差異(P>0.05)，均在12 cm左右(圖1)。

圖1 不同碳源的蜜環(huán)菌生長

在4種碳源培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌MC4的生物量差異較大，其中馬鈴薯淀粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌株生物量最大，干重為0.191 g，顯著高于(P<0.05)其它3種碳源培養(yǎng)基上的生物量；以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌株MC4的生物量最少，只有0.050 g，顯著低于(P<0.05)其它3個培養(yǎng)基上的生物量；4種碳源培養(yǎng)基上菌株生物量由大到小為：馬鈴薯淀粉>麥芽浸粉>紅薯淀粉>玉米粉(圖2)。

注：不同小寫字母表示差異顯著，下同。

2.1.2 不同氮源對蜜環(huán)菌MC4生長的影響 以大豆為氮源的培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌MC4菌絲萌發(fā)最晚，12 d以后才開始萌發(fā)。萌發(fā)后，在酵母粉培養(yǎng)基中，MC4的菌索生長最快，36 d時吃料深度為12.550 cm，顯著高于(P<0.05)在其它3種培養(yǎng)基中的吃料深度(圖3)。在牛肉膏培養(yǎng)基中，MC4的生長速度也較快，36 d時吃料深度為10.125 cm。在蛋白胨和大豆粉培養(yǎng)基中，MC4的生長速度較慢，36 d時吃料深度分別只有6.659 cm和6.400 cm，顯著低于(P<0.05)酵母粉和牛肉膏培養(yǎng)基中的吃料深度。

圖3 不同氮源的蜜環(huán)菌生長

氮源顯著影響蜜環(huán)菌的生物量，從圖4可以看出，在4種不同氮源培養(yǎng)基中，酵母粉培養(yǎng)基中的生物量最大，為0.481 g，顯著高于(P<0.05)其它3種培養(yǎng)基中的生物量。

圖4 不同氮源的蜜環(huán)菌生物量

大豆粉培養(yǎng)基中的生物量最低，只有0.119 g，顯著低于(P<0.05)其它培養(yǎng)基中的生物量。4種培養(yǎng)基中菌株的生物量由大到小依次為：酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>大豆粉。

2.1.3 不同無機鹽對蜜環(huán)菌MC4生長的影響 4種不同無機鹽對蜜環(huán)菌MC4的生長影響顯著(圖5)，在FeSO4培養(yǎng)基中，MC4的菌絲不萌發(fā)，隨時間推移，培養(yǎng)基逐漸變褐變黑。在KH2PO4培養(yǎng)基中菌絲萌發(fā)最早，培養(yǎng)第9 d時開始萌發(fā)，而在MnSO4培養(yǎng)基中的萌發(fā)最晚，18 d以后菌絲才開始萌發(fā)。培養(yǎng)36 d時，KH2PO4培養(yǎng)基中的生長速度最快，吃料深度為5.700 cm，顯著高于(P<0.05)在MgSO4和MnSO4培養(yǎng)基中的生長速度，其中，在MnSO4培養(yǎng)基中的生長速度最慢，只有1.740 cm。

圖5 不同無機鹽下蜜環(huán)菌的生長

從圖6可以看出，培養(yǎng)基中添加不同無機鹽后，蜜環(huán)菌MC4的生物量差異較大。由于添加FeSO4后，MC4沒有生長，因此生物量為零。而在添加KH2PO4的培養(yǎng)基中，MC4的生物量最大，為0.182 g，顯著高于(P<0.05)添加MgSO4和MnSO4培養(yǎng)基中的生物量。

圖6 不同無機鹽下蜜環(huán)菌的生物量

2.2 不同栽培種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌MC4的影響

2.2.1 不同栽培種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌MC4生長的影響 從圖7可以看出，MC4在Ⅳ號培養(yǎng)基中培養(yǎng)時最先萌發(fā)，但前14 d均生長緩慢，14～20 d內(nèi)生長迅速，后基本保持平穩(wěn)速度生長，44 d時長滿菌瓶。在Ⅰ號培養(yǎng)基中，MC4生長速度較快，33 d時已經(jīng)長滿。在Ⅲ號培養(yǎng)基中，MC4萌發(fā)最晚，12 d后菌絲才開始萌發(fā)，36 d時長滿整個菌袋。在Ⅱ號培養(yǎng)基中，前18 d長勢緩慢，后加速生長，48 d時吃料深度達10.833 cm，54 d時基本長滿。

圖7 不同三級栽培種培養(yǎng)基的蜜環(huán)菌生長

2.2.2 蜜環(huán)菌MC4在不同栽培種培養(yǎng)基上的形態(tài)特征 從表1可以看出，在Ⅰ號和Ⅲ號培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，MC4的菌絲萌發(fā)較慢，接近10 d左右，菌索形成時間也較長，需要15 d左右。而在Ⅱ號和Ⅳ號培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌絲不僅萌發(fā)時間較短，而且菌索形成時間也較快。但是，Ⅲ號和Ⅳ號培養(yǎng)基上形成的菌索較粗，直徑均為0.45 cm，且均較Ⅰ號和Ⅱ號培養(yǎng)基上的菌索茂密。因此，菌株在Ⅳ號三級培養(yǎng)基中不僅萌發(fā)時間短，生長速度快，且菌索粗壯，分枝茂密。

表1 蜜環(huán)菌在不同三級栽培種培養(yǎng)基上的形態(tài)特征

3 結(jié)論與討論

微生物生長需要碳源、氮源、無機鹽等不同的營養(yǎng)物質(zhì)[13]，碳源可提供菌體細胞的碳架和生命活動所需的能量，氮源是構(gòu)成菌體蛋白質(zhì)、核酸的不可或缺的原料，而無機鹽可作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑等，參與代謝反應(yīng)[14-15]。以往的研究表明，蜜環(huán)菌對營養(yǎng)物質(zhì)要求并不嚴格，馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、玉米粉、麥麩、葡萄糖、蔗糖等均是其優(yōu)質(zhì)的碳源，菜籽餅、蠶蛹粉、蛋白胨、酵母浸粉、尿素等均是其常用的氮源[9，16-18]，而KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2等是常用的無機鹽[8,17]。但是，由于不同營養(yǎng)物質(zhì)的添加比例及不同菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的利用差異，因此直接影響蜜環(huán)菌的生長狀況。如彭述敏對2株分離自昭通的蜜環(huán)菌的研究表明，葡萄糖為其最佳的碳源，酵母膏和蛋白胨為最佳的氮源，最適無機元素為K2SO4和KH2PO4[8]。李再新的研究表明，葡萄糖和酵母粉為蜜環(huán)菌培養(yǎng)最佳的碳、氮源[19]。程顯好通過1株蜜環(huán)菌對15種碳源和6種氮源的研究表明，碳源因素對蜜環(huán)菌生長的影響大于氮源因素，在以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上生物量最高，但在不同氮源條件下，蜜環(huán)菌都能很好的生長，形態(tài)無顯著差異[20]。

本試驗結(jié)果也表明，以馬鈴薯淀粉為碳源、以酵母粉為氮源、以KH2PO4為無機鹽的一級母種培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌MC4的生長速度及生物量顯著高于其它培養(yǎng)基。這可能是因為相比馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉和麥芽浸粉，玉米粉的養(yǎng)分較少，所以不利于蜜環(huán)菌的生長，因此生長速度和生物量均較低，而蜜環(huán)菌雖然在紅薯淀粉和麥芽浸粉培養(yǎng)基上的生長速度與馬鈴薯淀粉接近，但由于菌索分枝少、較細，因此生物量顯著低于馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基。與彭述敏[8]、閆軍[21]試驗所得蛋白胨是蜜環(huán)菌最佳氮源不同，本試驗在以蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏為不同氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，MC4在酵母粉培養(yǎng)基上的生物量最高，在大豆粉和蛋白胨中不僅吃料深度最淺，生物量也低。由此可知，不同菌株對氮源有不同喜好，以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基更適合菌株MC4的生長。在添加不同無機鹽的培養(yǎng)基中，蜜環(huán)菌MC4在添加了FeSO4的培養(yǎng)基中沒有生長，無菌絲和菌索萌發(fā)，可能是因為FeSO4濃度過高，抑制了蜜環(huán)菌的萌發(fā)和生長[22-23]。與彭述敏[8]結(jié)果一致，MC4在添加KH2PO4的培養(yǎng)基上，生長最好，吃料深度最深，生物量顯著高于其他處理。而在生產(chǎn)三級栽培種培養(yǎng)基時，不僅要考慮蜜環(huán)菌的生長速度，縮短培養(yǎng)時間，還要考慮生產(chǎn)成本和工藝的復(fù)雜性[24]。本試驗研究表明，在以櫟木枝條40%+馬鈴薯汁60%配制的Ⅳ號培養(yǎng)基上，不僅菌株萌發(fā)最早，生長最快，菌索最粗，而且生產(chǎn)成本低，工藝簡單，易于操作，因此列為首選栽培種培養(yǎng)基。