張 絨，李慧芳，陳炎歡，陳仲婷

（無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東江門 529100）

霉菌和酵母菌在自然界廣泛存在，受霉菌污染的食品對(duì)人體造成的危害不容小覷，輕則中毒、重則致癌、致畸、致突變。酵母菌作為一種發(fā)酵菌，可將食物中的糖發(fā)酵，易致使食品腐敗變質(zhì)，對(duì)人體造成不同程度的傷害。因此，霉菌和酵母菌檢測(cè)項(xiàng)目常被作為食品加工企業(yè)評(píng)價(jià)食品安全的重要指標(biāo)。

食品中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)主要依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）[1]，但該方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)，從樣品準(zhǔn)備到出具報(bào)告至少需要6 d，而快速測(cè)試片檢測(cè)過程僅需3 d。霉菌和酵母菌快速測(cè)試片（以下簡(jiǎn)稱快速測(cè)試片法）是一種預(yù)先制備好的一次性培養(yǎng)基制品，含有微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及顯色劑，具有操作簡(jiǎn)便、便于運(yùn)輸、成本低等優(yōu)點(diǎn)[2]。但由于快速測(cè)試片還不是我國(guó)食品微生物檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，所以現(xiàn)階段無(wú)法在檢測(cè)機(jī)構(gòu)和食品企業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用。

本研究將日常工作中的兩款原料進(jìn)行人工污染并作為試驗(yàn)樣品，分別添加白色念珠菌、黑曲霉兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用霉菌和酵母菌快速測(cè)試片法和GB 4789.15—2016對(duì)兩種試驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)定，通過開展快速測(cè)試片法的重復(fù)性試驗(yàn)、差異比較試驗(yàn)，確認(rèn)快速測(cè)試片法是否與國(guó)標(biāo)方法存在顯著差異，為快速測(cè)試片法作為原料日常監(jiān)控霉菌和酵母菌的檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

酪蛋白磷酸肽（廣州市銳力發(fā)展有限公司）；碳酸鈣（廣東大地食用化工有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基及菌種

3M PetrifilmTM霉菌和酵母菌檢驗(yàn)快速測(cè)試片（3M公司）；孟加拉紅培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404），均來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心（國(guó)家專利菌種保藏平臺(tái)）。

1.1.3 設(shè)備

超凈工作臺(tái)；生物安全柜；霉菌培養(yǎng)箱；恒溫水浴箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株適用性試驗(yàn)

樣品制備：按照GB 4789.15—2016方法，在25 g樣品中加入225 mL稀釋液，充分溶解，混合均勻。

試驗(yàn)菌株制備：將試驗(yàn)菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）復(fù)蘇后，制成一定濃度的菌懸液。

供試液制備：將一定濃度的試驗(yàn)菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）制成的菌懸液加入樣品中，使每1 mL樣液中含菌量為10～150 CFU。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15—2016測(cè)試方法：按上述方法進(jìn)行樣品制備后，吸取1 mL待測(cè)樣液于平皿內(nèi)，傾注孟加拉紅瓊脂，置于（28±1）℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。

菌株適用性試驗(yàn)方法：為確認(rèn)樣品中的微生物能被充分檢出，先選擇最低稀釋級(jí)的樣液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。加菌液的體積不超過供試液體積的1%，依照GB 4789.15—2016方法開展檢測(cè)，培養(yǎng)后觀察結(jié)果，驗(yàn)證樣品對(duì)試驗(yàn)菌株是否有生長(zhǎng)抑制性。

1.2.2 試驗(yàn)樣品重復(fù)性試驗(yàn)

將一定濃度的試驗(yàn)菌懸液加入通過菌株適用性試驗(yàn)的樣品中，制成終濃度為10～150 CFU·mL-1的加標(biāo)樣品。

快速測(cè)試片法：按產(chǎn)品使用操作說(shuō)明，取1 mL待測(cè)樣品置于快速測(cè)試片中，置于（28±1）℃培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果。

重復(fù)性分析方法：用快速測(cè)試片法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行霉菌和酵母的檢測(cè)，每個(gè)樣品由同一操作者使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)，參照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）[3]中重復(fù)性要求進(jìn)行快速測(cè)試片法試驗(yàn)結(jié)果分析，兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)的絕對(duì)差值不應(yīng)大于重復(fù)性限0.25（即r≤0.25）。

1.2.3 試驗(yàn)樣品顯著性差異比較試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）制成高中低5種濃度的菌懸液，加入待測(cè)樣品中采用快速測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)[4]。通過Minitab 15對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，若t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的概率P＜0.05，認(rèn)為快速測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法有顯著差異；P＞0.05，則認(rèn)為快速測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株適用性試驗(yàn)結(jié)果

由表1、表2可知，對(duì)添加白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）的兩種樣品按照GB 4789.15—2016開展檢測(cè)后，結(jié)果表明霉菌和酵母菌在試驗(yàn)樣品中生長(zhǎng)良好，回收PR值在0.5～2.0，兩種樣品酪蛋白磷酸肽、碳酸鈣對(duì)所測(cè)試菌株無(wú)生長(zhǎng)抑制性。

表1 酪蛋白磷酸肽菌株適用性試驗(yàn)結(jié)果

表2 碳酸鈣菌株適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 試驗(yàn)樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表3、表4可知，用快速測(cè)試片法進(jìn)行霉菌和酵母菌測(cè)試，參照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）中重復(fù)性要求進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，酪蛋白磷酸肽和碳酸鈣樣品采用快速測(cè)試片法的兩次測(cè)試結(jié)果r值均＜0.25，重復(fù)性結(jié)果可接受。

表3 酪蛋白磷酸肽重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

表4 碳酸鈣重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

2.3 試驗(yàn)樣品顯著性差異比較試驗(yàn)結(jié)果

由表5、表6可知，用快速測(cè)試片和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法分別對(duì)添加菌液的樣品進(jìn)行霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢測(cè)，t檢驗(yàn)分析后表明，酪蛋白磷酸肽中，霉菌t=1.55，P=0.132（P＞0.05），酵母菌t=0.03，P=0.974（P＞0.05）；碳酸鈣中，霉菌t=0.14，P=0.888（P＞0.05），酵母菌t=-0.01，P=0.989（P＞0.05）。結(jié)果表明，酪蛋白磷酸肽和碳酸鈣兩組樣品采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法和快速法測(cè)試的霉菌和酵母菌檢測(cè)結(jié)果均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 酪蛋白磷酸肽顯著性差異比較測(cè)試結(jié)果

表6 碳酸鈣顯著性差異比較測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)論與探討

通過Minitab 15對(duì)霉菌和酵母菌快速測(cè)試片法與《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示快速測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)方法相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。霉菌和酵母菌快速測(cè)試片易于操作，無(wú)需其他輔助器具即可快速檢測(cè)樣品，能有效縮短檢測(cè)周期，達(dá)到快速評(píng)估的目的，同時(shí)該方法也得到美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）的認(rèn)可。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果參照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）中重復(fù)性要求對(duì)快速測(cè)試片法檢測(cè)霉菌和酵母的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果在要求范圍。但由于重復(fù)性限的范圍（r≤0.25）較寬，對(duì)數(shù)據(jù)的要求不嚴(yán)格，在實(shí)際檢測(cè)過程中，建議根據(jù)情況采取等效的、更嚴(yán)格的控制方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行仲裁判定，確保風(fēng)險(xiǎn)得到有效控制[5]。

本試驗(yàn)所用酵母和霉菌測(cè)試片，其培養(yǎng)基含有作為載體的冷水可溶性凝膠和對(duì)霉菌和酵母敏感的指示劑（5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽），與酵母、霉菌在培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中發(fā)生特異性顯色反應(yīng)，通過生長(zhǎng)特征和顏色變化來(lái)判定霉菌和酵母的種類和數(shù)量[6]。其中酵母菌為藍(lán)綠色，較小菌落，筆者在其他物料的檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)其中的小型顆粒比較容易在檢測(cè)過程中被染色，對(duì)結(jié)果判讀造成干擾，建議對(duì)于需要用快速測(cè)試片法進(jìn)行檢測(cè)的機(jī)構(gòu)或企業(yè)，在使用前應(yīng)針對(duì)每一種物料進(jìn)行適用性驗(yàn)證，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。