肖建華 游艷 董自強(qiáng)

(三峽大學(xué) 1第一臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科 三峽大學(xué)泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003；2附屬仁和醫(yī)院)

膀胱癌發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，其發(fā)生機(jī)制同其他腫瘤一樣，是機(jī)體在各種致癌因素作用下，膀胱組織的個(gè)別細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其異?？寺⌒栽錾纬傻男律铩＜?xì)胞凋亡是指生物體內(nèi)細(xì)胞在特定內(nèi)外源信號(hào)誘導(dǎo)下，死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。生存素(Survivin)作為凋亡抑制蛋白家族(IAP)家族中的重要成員，能明顯抑制Fas、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)、B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)X蛋白(Bax)及多種經(jīng)典化療藥物、白細(xì)胞介素(IL)-3、腫瘤壞死因子(TNF)-α、X-射線等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔1〕，選擇性表達(dá)于膀胱癌、胃癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、皮膚癌等常見惡性腫瘤，而在癌旁正常組織和成人分化組織并不表達(dá)，可能與腫瘤細(xì)胞獲得的某種異?？沟蛲瞿芰ο嚓P(guān)。Du等〔2〕在研究 shRNA沉默survivin基因?qū)θ税螂滓菩屑?xì)胞癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為影響的過程中發(fā)現(xiàn)pshRNA-survivin 2組細(xì)胞侵襲力與運(yùn)動(dòng)能力均有明顯下降，證明了Survivin抑制措施用于膀胱腫瘤治療的有效性和可行性。

YM155具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，并能增加多種腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉酚、順鉑、依托泊甙等化療藥物和γ輻照、免疫療法的敏感性〔3〕。本研究旨在探討YM155對(duì)T24細(xì)胞體外增殖作用的影響。

1 材料和方法

1.1T24細(xì)胞準(zhǔn)備 T24細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，CCTCC編號(hào)為：GDC078。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、傳代、凍存后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有過程確保為無菌操作。

1.2試劑 YM155，美國Selleck生命科學(xué)，貨號(hào)：S1130，規(guī)格：5 mg/瓶。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞用胰酶消化，加入培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液后接種到96孔培養(yǎng)板(每孔約2×104個(gè)細(xì)胞)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。每96孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞加樣分調(diào)零孔(等體積培養(yǎng)液)、陰性對(duì)照組、不同濃度(0、10、100、1 000 nmol/L)YM155藥物組。

1.3.2噻唑藍(lán)(MTT)法細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 分別將不同濃度YM155(1、5、10、50、100、500、1 000 nmol/L)分別加入貼壁生長的T24細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入藥液100 μl且每種藥物的不同濃度分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔；調(diào)零孔加入等體積的培養(yǎng)液，分別處理24 h、48 h和72 h后吸出培養(yǎng)孔中的上清，加入先前配制的濃度為5%MTT溶液，培養(yǎng)4 h，吸棄MTT，再加入二甲基亞砜(DMSO，每孔150 μl)，震蕩5～10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上570 nm波長測吸光值(OD值)，將所有實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)孔的測值減去調(diào)零孔組平均值，然后將目標(biāo)孔中同一濃度組的4孔取平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR)和存活率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：(實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值)×100%=生存率，1-生存率=抑制率。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù) 對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的T 24細(xì)胞，胰酶消化后用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0×105個(gè)/ml，均勻接種于無菌6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，待其貼壁后進(jìn)行換液，分別加入提前配好不同濃度的YM155藥液(0、10、100、1 000 nmol/L)，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后1 000 r/min離心5 min，棄去藥液，再次胰酶消化，移液器吹打，轉(zhuǎn)入不同的離心管，離心后棄上清液收集細(xì)胞，分別用冷的緩沖液洗滌后各加入1.25 ml膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC,0.5 mg/ml)，室溫黑暗環(huán)境中孵育15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞后各加入10 ml碘化丙啶(PI)染料(0.3 mg/ml)并借助流式細(xì)胞儀(美國Accuri Cytometers公司，型號(hào)：accuri C6)進(jìn)行觀察，以上所有操作按試劑盒(Beijing 4A Biotech Co.，Ltd)說明書進(jìn)行。

1.3.4RT-PCR法檢測不同濃度YM155對(duì)T24細(xì)胞的抑制作用 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用胰酶消化并配成細(xì)胞懸液，均勻種植到①，②，③，④號(hào)培養(yǎng)瓶中；待其貼壁后進(jìn)行換液，分別加入臨用前配好不同濃度的YM155藥液(0、10、100、1 000 nmol/L)，培養(yǎng)48 h后棄藥液，用胰酶消化細(xì)胞，Trizol(賽默飛公司，上海，中國)提取總mRNA，并經(jīng)核酸測定儀測定樣品RNA含量和純度，OD260/OD280值在1.8～2.0提示RNA純度高。根據(jù)RT-PCR試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)說明書將RNA樣品拍照并采用SIM BIO-1D EXPRESS凝膠成像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，將目的基因擴(kuò)增條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin擴(kuò)增條帶的灰度值比值作為目的基因mRNA的半定量指標(biāo)。

1.3.5免疫印跡法檢測不同濃度YM155對(duì)T24細(xì)胞的抑制作用 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用胰酶消化并配成細(xì)胞懸液，待其生長貼壁后加入提前配好不同濃度的YM155藥液置入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后按照BCA試劑盒提取蛋白，并測定蛋白濃度；進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。ECL法顯色后掃描成像，分析相應(yīng)的光密度值，用各目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶光密度值之比表示各蛋白表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)改變 未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞生長良好，呈多角形或梭形，貼壁生長，增長速度快，一般1∶3傳代分瓶，2 d后可以長滿，培養(yǎng)液清亮。用不同濃度的YM155處理后細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，隨著藥物濃度的上升，其抑制程度不斷增加，主要形態(tài)學(xué)改變?yōu)榧?xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，可見凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。見圖1。

2.2YM155抑制體外培養(yǎng)的人膀胱癌T24細(xì)胞生長 同批次的T24細(xì)胞經(jīng)不同濃度的YM155處理24 h，48 h和72 h后呈現(xiàn)出不同的生長抑制狀態(tài)。當(dāng)YM155濃度<5 nmol/L時(shí)，其對(duì)T24細(xì)胞生長影響不明顯，但當(dāng)其濃度>5 nmol/L后則不同程度抑制細(xì)胞生長，最佳作用濃度為5～100 nmol/L，當(dāng)藥物濃度一定即5、10、50、100、500 nmol/L時(shí)，隨著藥物作用時(shí)間的延長，T24細(xì)胞的生存率逐漸下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.26，19.102，19.866，14.526，15.251，P<0.01)，當(dāng)作用時(shí)間一定時(shí)，隨著YM155藥物濃度的不斷增加，T24生存率也呈明顯下降趨勢(F=127.279，204.653，243.229，P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度YM155作用T24細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)生存率的影響

2.3YM155誘導(dǎo)體外培養(yǎng)T24細(xì)胞凋亡 分別用0、10、100、1 000 nmol/L 4種濃度的YM155處理T24細(xì)胞24 h后用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)檢測3次后0、10、100、1 000 nmol/L YM155處理后的細(xì)胞平均凋亡率分別為(3.56±0.44)%、(19.76±1.42)%、(32.18±4.72)%、(47.81±3.57)%。10 nmol/L，100 nmol/L，1 000 nmol/L組細(xì)胞凋亡率明顯高于0 nmol/L組，且隨著YM155藥物濃度升高，T24細(xì)胞凋亡率逐漸升高(F=132.131，P<0.01)。見圖3?？梢婋SYM155藥物濃度的不斷升高，細(xì)胞凋亡比率逐漸上升。

圖3 T24細(xì)胞經(jīng)不同濃度YM155處理后的凋亡發(fā)生情況

2.4YM155可抑制T24細(xì)胞中Survivin mRNA水平的表達(dá) 隨藥物濃度升高，細(xì)胞內(nèi)Survivin mRNA含量不斷降低，與0 nmol/L組(0.84±0.02)相比，10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L藥物處理組Survivin mRNA表達(dá)顯著降低(0.60±0.01，0.39±0.01，0.01±0.00，P<0.05)；且不同濃度藥物處理組間Survivin mRNA表達(dá)也有明顯的差異(P<0.05)。見圖4。

圖4 T24細(xì)胞經(jīng)不同濃度YM155處理后survivin mRNA水平

2.5YM155抑制T 24細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平 與0 nmol/L組(Survivin蛋白表達(dá)為0.95±0.13、Cleaved Caspase-3表達(dá)為0.52±0.07)相比，10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L組Survivin蛋白水平均顯著降低(0.75±0.11、0.78±0.09、0.74±0.12，F(xiàn)=88.450，P<0.01)，Cleaved Caspase-3蛋白水平則顯著上升(0.70±0.09、0.69±0.08、0.78±0.11，F(xiàn)=94.870，P<0.01)；且不同濃度藥物處理組間差異顯著(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western印跡檢測各組Survivin、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

膀胱癌是泌尿外科最常見，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至威脅患者生命的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)有明顯的上升趨勢〔4～7〕。目前膀胱癌的治療多以手術(shù)為主，再輔以膀胱灌注化療，但其復(fù)發(fā)率高，化療副反應(yīng)多，且術(shù)后多需行尿流改道，尿路感染發(fā)生率高，患者生活質(zhì)量普遍較低，期待新型高效、低毒的抗腫瘤藥物或藥物聯(lián)合方案誕生。

YM155作為新型凋亡抑制因子Survivin的靶向抑制劑表現(xiàn)出了尤為強(qiáng)大的抗瘤潛能：在體外細(xì)胞水平，研究發(fā)現(xiàn)其可抑制超過119種人類腫瘤細(xì)胞株，其中包括非霍奇金淋巴瘤、激素治療不敏感前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、白血病和黑素瘤等預(yù)后不良的惡性腫瘤〔8〕。本研究結(jié)果表明，YM155單獨(dú)作用可以顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞的生長，最佳作用濃度范圍為5～100 nmol/L，且該抑制作用在一定程度上呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性，作用機(jī)制可能與YM155特異性抑制Survivin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生相關(guān)。

此外，有研究表明，YM155同順鉑和喜樹堿等化療藥物沒有交叉耐藥性，對(duì)腫瘤細(xì)胞株的作用不受p53基因狀態(tài)限制〔8〕，在同順鉑、碳鉑、伊馬替尼、γ射線等抗瘤措施聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可協(xié)同增加抗瘤活性〔9，10〕。在不同腫瘤動(dòng)物模型試驗(yàn)研究水平，YM155作為抗腫瘤制劑的有效性和安全性均超過了紫杉醇、順鉑等傳統(tǒng)化療藥物，其給藥途徑靈活方便，靜脈注射、皮下注射、瘤內(nèi)注射均可達(dá)到理想的抗瘤效果而無明顯毒副作用出現(xiàn)〔11〕。動(dòng)物腫瘤模型體內(nèi)聯(lián)合用藥時(shí)YM155同樣可以增強(qiáng)常用化療藥物及放療的抗瘤性能，對(duì)H460細(xì)胞和Calu6細(xì)胞腫瘤模型放療敏感性的增強(qiáng)系數(shù)分別達(dá)3.3和3.5〔10〕，且在接受YM155治療的動(dòng)物中并沒有發(fā)現(xiàn)組織損傷或體重顯著丟失等副作用〔12〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)4.8 mg/(m2·d)劑量水平的YM155對(duì)化療耐藥的非霍奇金淋巴瘤患者產(chǎn)生治療作用；多耐藥彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤在接受YM155治療2個(gè)周期后開始出現(xiàn)反應(yīng)，6個(gè)周期后所有癥狀和體征均轉(zhuǎn)為陰性，達(dá)到完全反應(yīng)狀態(tài)，無病生存期達(dá)4年以上；多藥化療和肝細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)的濾泡狀大B細(xì)胞淋巴瘤患者接受YM155治療8個(gè)周期后出現(xiàn)部分反應(yīng)，無病生存期維持到2年以上〔13〕。Ⅱ期臨床試驗(yàn)中37例腫瘤患者有2例(5.4%)呈現(xiàn)出部分治療效果，14例(37.8%)達(dá)到病情穩(wěn)定狀態(tài)，病情控制率達(dá)43.2%，中位無進(jìn)展期時(shí)間為1.7個(gè)月，中位生存時(shí)間為6.6個(gè)月，1年生存率為35.1%〔14〕，且嚴(yán)重的并發(fā)癥罕見。

綜上，作為新型凋亡抑制因子survivin的靶向抑制劑，YM155在納摩爾濃度級(jí)方可抑制眾多腫瘤細(xì)胞株生長，減輕荷瘤動(dòng)物模型的腫瘤負(fù)擔(dān)，改善多藥耐藥或復(fù)發(fā)晚期腫瘤患者的預(yù)后。另有藥理學(xué)分析表明YM155能選擇性高分布于腫瘤組織中而很少有系統(tǒng)毒性反應(yīng)出現(xiàn)，其抗瘤活性呈時(shí)間依賴性，在施藥途徑上以持續(xù)靜脈注射時(shí)活性最高〔12〕，這些數(shù)據(jù)均為其進(jìn)入臨床來改善腫瘤患者預(yù)后奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。