齊曉茹， 孫思語， 程金妞， 趙安妮， 劉曉梅， 劉真真，那 莎， 李 璐,2)*

(1)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院生物科學(xué)系生物化學(xué)教研室， 合肥 230012； 2)安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所， 合肥 230012)

GLOBOCAN 在2020年公布的新數(shù)據(jù)中指出，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的全球新發(fā)病例數(shù)居于惡性腫瘤第6位[1]。我國肝癌也是臨床常見腫瘤致死病因之一，總體預(yù)后較差，對我國人民健康造成了嚴重威脅[2]。阻斷癌前階段可能是降低肝癌發(fā)病率和死亡率有效策略及突破口之一。

白藜蘆醇(resveratrol，RES )是多酚化合物，具有抗氧化、抗炎等藥理學(xué)特性[3]。據(jù)報道，白藜蘆醇在體外可抑制多種癌癥包括肝癌[4]。然而，白藜蘆醇對肝癌癌前階段的影響目前尚不十分清楚。本文研究白藜蘆醇對二乙基亞硝胺(diethylinitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的肝癌大鼠癌前階段的影響。而DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型可有效地模擬人肝癌從肝炎-肝硬化-肝癌的病理過程[5]。最近的研究表明，糖代謝重編程，即從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉(zhuǎn)化，與肝纖維化和肝癌發(fā)生密切相關(guān)[6,7]。Brockmueller等[8]報告，白藜蘆醇具有抑制癌細胞葡萄糖代謝能力，提示RES可能通過調(diào)節(jié)糖代謝發(fā)揮抗癌作用。本文以代謝物組學(xué)分析法(metabolomics)研究RES在肝癌癌前階段作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

從安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(中國安徽省)購買32只SPF級健康Sprague-Dawley雄性大鼠(編號：SCXK 2017-001)。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》(第8023號出版物，1978年修訂版)，將大鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF)環(huán)境中，控制溫度(22±2 ℃)、相對濕度(40%～70 %)，光/暗循環(huán)12 h。所有實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準。大鼠隨即分為4組：正常對照組，RES處理組，DEN處理組和RES-DEN處理組。

1.2 造模方法

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。其中，16只大鼠(體重190～250 g)每周灌胃4次生理鹽水溶液(0.9 %氯化鈉)，共8 周。從第2周開始，它們被隨機分為2組(至少5只大鼠/組)：1組(對照組)給予0.5 %羧甲基纖維素溶液，每日1次，連續(xù)7 周；另一組(RES處理組)給予RES(溶于0.5 %羧甲基纖維素溶液中；0.1 g/kg；上海笛柏生物技術(shù)有限公司，中國上海)每日灌胃1次，共7周。其他16 只大鼠每周連續(xù)灌胃給藥4次DEN(溶解于生理鹽水溶液中；0.002 g/只；Sigma公司產(chǎn)品，其純度為99.9 %)共8周。從第2周開始，隨機分為2組(至少5只大鼠/組)：1組(DEN處理組)給予0.5 %羧甲基纖維素溶液，每日1次，連續(xù)7周；另1組(RES-DEN處理組)給予RES(0.1 g/kg)灌胃，每日1次，連續(xù)7周。

1.3 肝組織非靶向代謝物組學(xué)分析

代謝物組學(xué)分析檢測由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.1 樣品的采集與制備 大鼠處死，稱取80 mg肝組織，加入200 μL純水制備勻漿，渦旋60 s后加入800 μL甲醇乙腈溶液(1∶1，V/V)，渦旋60 s，低溫超聲30 min/次，共2次，并于-20 ℃放置1 h，低溫高速離心機上14 000 g，4 ℃離心20 min，取上清冷凍干燥，并于-80 ℃保存樣本。

1.3.2 色譜條件 樣品或質(zhì)控樣品置于4 ℃自動進樣器中，采用隨機順序進行連續(xù)分析。Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)UPLC HSS T3色譜柱(1.8 μm 2.1 × 100 mm，Waters)進行分離；柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min；二元梯度洗脫系統(tǒng)包括：(A)含有醋酸銨(25 mm)、氨水(25 mm)(B)乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min 95% B 、0.5～7 min 95%～65% B、7～8 min 5%～40%、8～9 min 40 % B、9～9.1 min 40%～95% B、9.1～12 min 95% B 。

1.3.3 Q-TOF質(zhì)譜條件 樣本檢測完畢，采用 AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀采集樣品的一級、二級譜圖。HILIC色譜分離后的ESI源條件如下：霧化氣(ion source gas1，Gas1)：60 psi，輔助加熱氣(ion source gas2，Gas2)：60 psi，氣簾氣(curtain gas，CUR)：30 psi，離子源溫度：600 ℃，離子噴霧壓(ion spray voltage floating，ISVF)：±5 500 V(正負兩種模式)；一級質(zhì)譜母離子掃描范圍：60～1 000 D，子離子掃描范圍：25-1 000 Da，TOF MS母離子掃描速度：0.20 s/spectra，子離子掃描速度：0.05 s/spectra；二級質(zhì)譜采用information 81 dependent acquisition(IDA)獲得，并且采用高靈敏模式，去簇電壓(declustering potential，DP)：±60 V(正負兩種模式)，碰撞能量(collision energy)：(35±15)eV，IDA設(shè)置如下：Exclude isotopes within 4 Da，每個周期監(jiān)測的候選離子：6(candidate ions to monitor per cycle：6)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成mzXML格式，以XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。以精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級譜圖匹配的方式檢索實驗室自建數(shù)據(jù)庫，進行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理，進行無監(jiān)督主成分分析(principal component analysis，PCA)，有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)等多維統(tǒng)計分析。以Student’st-test和變異倍數(shù)分析進行單變量分析。以京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG，http：//www.kegg.jp/)為基礎(chǔ)進行差異代謝物KEGG通路及KEGG通路富集分析，P值越小(P越小于0.05)KEGG通路富集越顯著。

1.4 Western印跡檢測肝組織中的PCNA、 PKM2、 LDHA蛋白質(zhì)表達水平

RIPA裂解液裂解肝組織，并使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所)定量總蛋白質(zhì)。核蛋白質(zhì)通過細胞核和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)提取試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所)提取。通過SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore Corp, Billerica, MA, USA)，該膜在封閉緩沖液中封閉，并與一級抗體一起孵育。應(yīng)用的主要抗體(Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)包括兔抗鼠增殖細胞核抗原(PCNA)(1∶1 600稀釋)、兔抗鼠丙酮酸激酶M2(PKM2)(1∶1 600稀釋)、兔抗鼠L-乳酸脫氫酶(LDHA)(1∶2 000稀釋)、兔抗鼠laminb-1(1∶1 200稀釋)和小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)(1∶4 000稀釋)。第二種抗體為山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)和山羊抗小鼠IgG免疫反應(yīng)(1∶5 000稀釋)用增強化學(xué)發(fā)光法曝光免疫反應(yīng)條帶，并用Image J軟件分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差表示，采用方差分析(ANOVA)和Duncan多范圍檢驗對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌癌前階段細胞增殖的抑制作用

李英等[9]研究表明, 當(dāng)RES濃度高于80 μmol/L時，各組HCC細胞的增殖速度均受到明顯抑制。Bishayee等[10]通過體內(nèi)研究證明，只有高劑量RES可顯著性抑制肝癌的發(fā)生。上述體內(nèi)外結(jié)果均表明，高濃度的RES能夠抑制細胞增殖。同時，由于白藜蘆醇的水溶性差、不穩(wěn)定、首過效應(yīng)強、體內(nèi)代謝迅速、生物利用度低等因素，本文選擇高濃度RES開展后續(xù)研究[11]。

增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是腫瘤細胞惡性增殖的標(biāo)志物, 可協(xié)調(diào)癌細胞DNA合成,是腫瘤細胞增殖所必需的一種蛋白質(zhì),它的表達可有效反映腫瘤細胞的增殖水平[12]。本文檢測了各組大鼠的PCNA水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，DEN處理組大鼠的PCNA的總蛋白質(zhì)水平升高至2倍(P=0.001，F(xiàn)ig.1A)。與DEN處理組大鼠相比，RES-DEN處理組大鼠的PCNA的總蛋白質(zhì)水平降低(P=0.017，F(xiàn)ig.1A)。核內(nèi)PCNA水平更能提供細胞增殖的依據(jù)[13]。本文評估了細胞核中PCNA的蛋白質(zhì)水平。與對照組相比，DEN處理組的細胞核中PCNA的蛋白質(zhì)水平升高至3倍(P<0.001，F(xiàn)ig.1B)。在RES-DEN處理組大鼠中，細胞核中PCNA的蛋白質(zhì)水平與對照組相比未見顯著性差異，但與DEN處理組相比顯著降低(P=0.001)。結(jié)果表明，RES可抑制肝癌癌前階段的細胞增殖。

Fig.1 RES attenuates DEN-induced proliferation (A) Representative images of Western blots of PNCA protein expression and their relative density ratios in liver tissues of multiple groups (n=8 rats per group). (B) Representative images of Western blots of PNCA protein expression in the nucleus and their relative density ratios in liver tissues of multiple groups (n=8 rats per group). Values are given as the mean ± SD of 8 samples, ANOVA followed by Duncan’s multiple range test was used to compare the means of multiple groups

Fig.2 PCA scores of quality control samples, control group, RES treatment group, DEN treatment group and RES-DEN treatment group (A) Positive ion mode;(B) Negative ion mode; t[1] represents principal component 1 and t[2] represents principal component 2

2.2 肝組織多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

為了進一步研究RES在DEN誘導(dǎo)肝癌癌前階段抑制細胞增殖的機制，選擇對照組(N)、RES處理組(NB)、DEN處理組(G)和RES-DEN處理組(GB)進一步開展代謝物組學(xué)分析。在ESI正離子和ESI負離子模式下，通過UHPLC系統(tǒng)分析肝的代謝譜。采用主成分分析(PCA)數(shù)據(jù)分析，將得到以下正、負兩種采集模式下的PCA圖。結(jié)果如Fig.2所示：質(zhì)量控制(QC)顯示出緊密的聚類，表明UHPLC系統(tǒng)具有可接受的重復(fù)性和穩(wěn)定性。N組與G組、GB組之間代謝物存在顯著差異，分離效果較好，單個樣本能夠明顯區(qū)分開，這表明兩組發(fā)生了實質(zhì)性的生化變化。GB與N組之間依然存在明顯差異，單個樣本能區(qū)分。GB組與G組之間雖然能較好區(qū)分，但部分樣本間依存在些許交叉。

為減少組內(nèi)樣本的波動性，進一步分析各組代謝物之間的差異。采用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)對各組隨機選擇的各8個肝樣本的肝組織代謝物譜差異進行分析。研究結(jié)果顯示，對照組vsDEN處理組、對照組vsRES處理組、RES-DEN處理組vs對照組、RES-DEN處理組vsDEN處理組、RES-DEN處理組vsRES處理組5種比較組均能完全區(qū)分開，組內(nèi)樣品較為集中，表明這5組代謝物均存在顯著性差異(Fig.3-7)。

Fig.3 OPLS-DA scores of samples in control group and DEN treatment group (A) Positive ion mode; (B) Negative ion mode; t[1] represents principal component 1 and t[2] represents principal component 2

Fig.4 OPLS-DA scores of samples in control group and RES treatment group (A) Positive ion mode; (B) Negative ion mode; t[1] represents principal component 1 and t[2] represents principal component 2

Fig.5 OPLS-DA scores of samples in control group and RES-DEN treatment group (A) Positive ion mode; (B) Negative ion mode; t[1] represents principal component 1 and t[2] represents principal component 2

Fig.6 OPLS-DA scores of samples in DEN treatment group and RES-DEN treatment group (A) Positive ion mode; (B) Negative ion mode; t[1] represents principal component 1 and t[2] represents principal component 2

Fig.7 OPLS-DA scores of samples in RES treatment group and RES-DEN treatment group (A) Positive ion mode; (B) Negative ion mode; t[1] represents principal component 1 and t[2] represents principal component 2

2.3 差異性代謝物鑒定與代謝通路分析

采用以上OPLS-DA模型所得到的變量權(quán)重值(variable importance for the projection, VIP) ，VIP值(閾值>1)結(jié)合單變量檢驗的P值(閾值<0.05)尋找差異性表達代謝物。然后，將篩選出的代謝物輸入KEGG網(wǎng)站，確定代謝物通路。

研究結(jié)果顯示，在N組和G組之間，有107種潛在的生物標(biāo)志物代謝物。根據(jù)代謝通路富集分析結(jié)果，其中有11種與糖代謝相關(guān)的潛在生物標(biāo)志代謝物(見Table 1)。KEGG途徑富集分析表明，其中，糖酵解、丙酮酸代謝、氨基酸生物合成和癌癥中心碳代謝是受DEN影響的重要途徑(Fig.8)。其中，DL-2磷酸甘油酸脂、磷酸烯醇式丙酮酸在G組中顯著降低(P<0.05)，糖酵解的最終產(chǎn)物乳酸水平顯著增高(P<0.05), TCA循環(huán)中重要的中間體檸檬酸在G組中顯著降低(P<0.05，F(xiàn)ig.9B)。

上述研究結(jié)果表明，G組中有氧氧化被抑制，糖酵解途徑被增強，預(yù)示在DEN處理組中有氧糖酵解的發(fā)生。這種糖代謝重編程也稱“瓦伯格效應(yīng)”，是癌細胞生長、增殖和侵襲的先決過程。抑制這種糖代謝重編程可以抑制肝癌細胞的惡性增殖。

在N組和NB組之間，有52種潛在的生物標(biāo)志物代謝物，其中有4種與氨基酸生物合成有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物代謝物(見Table 2)。此結(jié)果表明，RES處理未對大鼠的糖代謝產(chǎn)生影響。

在N組和GB組之間，有107種潛在的生物標(biāo)志物代謝物，根據(jù)KEGG結(jié)果，其中有13種與糖代謝相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物代謝物(見Table 3)。

葡萄糖除可通過糖酵解進行代謝，也可進入磷酸戊糖途徑 (PPP) 代謝。經(jīng)磷酸戊糖途徑生成5-磷酸核糖和核糖后，通過基團轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)變成6-磷酸果糖和三磷酸甘油醛進入糖酵解途徑[14,15]。因此，磷酸戊糖途徑又被稱為糖酵解旁路。本文的結(jié)果表明，相較于對照組，RES-DEN處理的大鼠中，5-磷酸核糖和核糖的水平受到抑制(P<0.05)，乳酸水平顯著升高(P<0.05),說明葡萄糖進入磷酸戊糖途徑的旁路被抑制(Fig.9C)，糖酵解被增強。

Table 1 Metabolites of potential biomarkers related to glucose metabolism in the liver tissue of rats in the normal control group and the DEN treating group

Fig.8 Pathway enrichment analysis of potential biomarkers in DEN treatment group compared with control group Each bubble in the bubble chart represents a metabolic pathway (select the top 20 most significant according to VIP>1 and 0.05

Fig.9 The effects of RES on the precancerous stage of DEN-inducing hepatocarcinogenesis in rats (A) Red arrows indicate the effects of DEN, and green arrows indicate the effects of RES. Arrows with solid lines indicate evident effects, and dotted arrows indicate slight effects. 2-PGA, Glyceraldehyde 2-phosphate; PEP, Phosphoenol pyuvate; PKM2, Pyruvate Kinase M2; LDHA, L-lactate dehydrogenase. By non-targeted metabolomics analysis Glucose metabolism pathway change in the livers of (B) DEN-treated rats compared to control rats and (C) RES-DEN treated rats compared to the control rats. (D) Glucose metabolism pathway change between the DEN treated rats and the RES-DEN treated rats. Values are given as the mean ± SD of 8 samples

Table 2 Potential biomarker metabolites related to amino acid biosynthesis in the liver tissues of rats in the normal control group and the RES treating group

在G組和GB組之間，有31種潛在的生物標(biāo)志物代謝物，根據(jù)KEGG結(jié)果，其中有4種與糖代謝相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物代謝物(見Table 4)。KEGG途徑富集分析表明，與DEN處理組大鼠相比，RES-DEN處理組大鼠的磷酸戊糖途徑、癌癥中心碳代謝和氨基酸生物合成發(fā)生了顯著變化(Fig.10)。結(jié)果提示，與DEN處理組大鼠相比，RES-DEN處理組大鼠磷酸戊糖途徑受到抑制，糖酵解的水平增強，但其乳酸生成水平與DEN處理組大鼠的水平相近，未見顯著性區(qū)別(P>0.05)，表明RES-DEN處理組大鼠的乳酸生成水平受到抑制(Fig.9D)。這些結(jié)果提示，RES可以調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑的通量，從而抑制惡性腫瘤細胞增殖。

在NB組和GB組之間，有39種潛在的生物標(biāo)志物代謝物，根據(jù)KEGG結(jié)果，其中有3種與糖代謝相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物代謝物(見Table 5)。結(jié)果表明，在RES-DEN處理的大鼠和RES處理的大鼠之間，糖代謝未見變化，提示DEN誘導(dǎo)的有氧糖酵解受到RES的抑制。

Table 3 Metabolites of potential biomarkers related to glucose metabolism in the liver tissues of rats in the normal control group and the RES-DEN treating group

Table 4 Potential biomarker metabolites related to glucose metabolism in the liver tissue of the DEN treating group and RES-DEN treating group

Fig.10 Pathway enrichment analysis of potential biomarkers in RES-DEN treatment group compared with DEN treatment group Each bubble in the bubble chart represents a metabolic pathway (select the top 20 most significant according to VIP>1 and 0.05

Table 5 Potential biomarker metabolites related to glucose metabolism in the liver tissue of rats in the RES RES-DEN-treating group and RES-DEN-treating group

2.4 白藜蘆醇對二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的M2型丙酮酸激酶的抑制作用

根據(jù)上述代謝物組學(xué)分析，RES-DEN處理的大鼠中磷酸烯醇式丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化可能受到一定程度的抑制。據(jù)熊璟等[16]報告，RES通過抑制PK酶活性、下調(diào)PKM2蛋白表達來抑制口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)細胞糖酵解作用，但RES對HK酶活性及HK2蛋白的表達無顯著影響。磷酸化的PKM2二聚體刺激高速率的核苷酸和氨基酸生物合成，同時間接維持瓦伯格效應(yīng)，為腫瘤細胞提供物質(zhì)能量的基礎(chǔ)。在乳腺癌小鼠異種移植模型中，PKM2缺失逆轉(zhuǎn)了瓦伯格效應(yīng)從而抑制腫瘤生長和侵襲[17]。這些研究均提示，RES可能是通過抑制PKM2表達而對癌細胞的糖酵解產(chǎn)生抑制作用。因此，本文檢測了磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸-乳酸這條代謝途徑中關(guān)鍵酶PKM2的水平。結(jié)果顯示如Fig.11A所示，DEN處理組大鼠PKM2蛋白質(zhì)水平顯著高于對照組(P=0.039)。RES-DEN處理組大鼠PKM2蛋白質(zhì)水平顯著低于DEN處理組大鼠(P=0.029)。

LDHA通過PKM2易位進入細胞核催化乳酸的生成[18]。乳酸的大量積累可以重塑腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本文檢測了LDHA蛋白水平。結(jié)果如Fig.11B所示，與對照組相比，DEN處理組大鼠的LDHA蛋白水平顯著增高(P<0.001)，與DEN處理組大鼠相比，RES-DEN處理組大鼠LDHA蛋白水平顯著降低(P=0.001)。這些結(jié)果提示，RES對DEN誘導(dǎo)的PKM2具有抑制作用。表明DEN可在肝癌發(fā)生的癌前階段誘導(dǎo)肝細胞過度增殖和糖代謝重編程。然而，RES可以通過調(diào)節(jié)糖代謝重編程抑制過度增殖(Fig.9A)。

Fig.11 Resveratrol inhibits the expression of PKM2 and LDHA, the key enzymes of glucose metabolism reprogramming (A) Representative images of Western blots of PKM2 protein expression and their relative density ratios in liver tissues of multiple groups (n=8 rats per group); (B) Representative images of Western blots of LDHA protein expression and their relative density ratios in liver tissues of multiple groups (n=8 rats per group). Values are given as the mean ± SD of 8 samples, ANOVA followed by Duncan’s multiple range test was used to compare the means of multiple groups

3 討論

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、保護心血管和抗腫瘤等作用[19]。盡管研究表明，RES可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段發(fā)揮抑制作用，還可誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[20]。但體內(nèi)研究的證據(jù)表明，RES在癌癥預(yù)防方面的潛在作用大于癌癥治療[21]。目前，對RES預(yù)防肝癌的作用機制研究尚不足。為了揭示其機制，本文評估了RES在DEN誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的癌前階段的作用和機制。

Dai 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在異種移植瘤模型中，不同濃度梯度的白藜蘆醇處理的小鼠顯示出對腫瘤體積和腫瘤重量的顯著抑制，并且呈劑量依賴性。Chai等[23](2017年)報告，當(dāng)RES的濃度高于80 μmol/L時，會抑制HCC細胞的增殖。因此，本文進一步研究了高劑量RES對DEN處理大鼠癌前階段細胞增殖的影響。

本文采用DEN誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型，該模型操作簡單而且成功率高。DEN誘導(dǎo)肝癌模型的過程中主要分為3個階段即：炎癥階段(第2～6周)、纖維化階段(第8～12周)和肝癌階段(第14～20周)[24]。因此，本文建立了8周大鼠癌前階段模型。PCNA是一種細胞增殖標(biāo)志物, 可協(xié)調(diào)癌細胞DNA合成, 是腫瘤細胞增殖所必需的一種蛋白質(zhì), 它的表達情況可有效反映腫瘤細胞的增殖水平,尤其在肝癌等組織分化較差的惡性腫瘤,該蛋白質(zhì)的表達水平較高[25]。它為細胞增殖提供了直接與可辨別的證據(jù)[26]。本文的結(jié)果表明，雖然腫瘤出現(xiàn)在HCC階段，但肝細胞過度增殖出現(xiàn)在DEN誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的癌前階段，經(jīng)DEN處理8周，PCNA蛋白水平顯著升高。根據(jù)本文的研究結(jié)果反饋，相比于DEN處理組大鼠，RES-DEN處理組大鼠過度增殖減少。這表明，RES可以抑制肝癌癌前階段的細胞增殖。這為RES預(yù)防肝癌的發(fā)生提供了有力的證據(jù)。

本文進一步研究了在DEN誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的癌前階段，RES抑制細胞增殖的機制。非靶向代謝物組學(xué)分析結(jié)果表明，與對照組大鼠相比，RES-DEN處理組的大鼠5-磷酸核糖和核糖水平受到抑制，從磷酸戊糖途徑到糖酵解的轉(zhuǎn)化水平增加。進一步分析表明，RES-DEN處理組大鼠從磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為糖酵解的水平高于DEN處理組的大鼠。眾所周知，磷酸戊糖途徑通過核苷酸前體提供不受控制增殖[27]。據(jù)報道，磷酸戊糖途徑在癌細胞中的通量非常高，可以滿足惡性增殖的需求[27]。本文的結(jié)果表明，RES可以調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑的通量，從而抑制細胞增殖。

此外，本文的結(jié)果表明，在DEN處理組大鼠中，TCA循環(huán)水平降低。從DL-2-磷酸甘油酯和磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的水平增加，表明DEN誘導(dǎo)糖代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為有氧糖酵解。這種糖代謝重編程，也就是有氧糖酵解被認為是癌癥發(fā)展和進展的先決過程[28]。它滿足細胞異常增殖期間對三磷酸腺苷(ATP)的快速供應(yīng)需求[29]。它還允許代謝中間產(chǎn)物參與各種生物合成途徑，最終有利于大分子和新細胞器的合成，從而滿足不受控制的增殖需求，增加生物量以維持子細胞的生產(chǎn)[30,31]。抑制糖代謝重編程可以減弱惡性肝細胞的增殖[32]。

然而，本文的結(jié)果表明，RES對上述糖代謝重編程的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜。在RES-DEN處理大鼠中，與對照組大鼠相比，TCA循環(huán)水平未見顯著變化，表明RES在一定程度上減弱了DEN對TCA循環(huán)的抑制作用。此外，RES-DEN處理組大鼠的乳酸水平仍高于對照組大鼠，但有趣的是，與DEN處理組大鼠的乳酸水平相似。這些結(jié)果表明，在RES-DEN處理的大鼠中，雖然磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為糖酵解的水平增加，但最終并未提高DEN誘導(dǎo)的乳酸水平。事實上，在DEN處理的大鼠中，乳酸水平的提高是由于DL-2-磷酸甘油酯和磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的水平增加。但在RES-DEN處理的大鼠中，乳酸水平的提高是由于從磷酸戊糖途徑到糖酵解的水平轉(zhuǎn)換增加。因此，在RES-DEN處理的大鼠中，磷酸烯醇式丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化可能受到一定程度的抑制。

本文進一步的研究證實，在RES-DEN處理的大鼠中，從磷酸烯醇式丙酮酸到乳酸的轉(zhuǎn)化受到抑制。某些癌細胞代謝的轉(zhuǎn)變可能是由于磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的改變，這是由癌細胞中過表達的PKM2催化形成的[17]。眾所周知，有氧糖酵解需要3種重要的限速酶：磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)[30]。特別是，PK被認為是糖代謝重編程的中心激酶，它調(diào)節(jié)糖酵解的最后一步[33]。PK有4種亞型，包括PKR、PKL、PKM1和PKM2。其中，PKM2在正常細胞中很少存在，但在惡性肝細胞中高水平存在[34]。研究表明，盡管PKM2的糖酵解活性低于PKM1[17]，但它允許葡萄糖中間體在丙酮酸上游的通道中產(chǎn)生抗氧化劑、脂肪酸和核苷酸[34]。用其他PK亞型替換PKM2可顯著抑制有氧糖酵解和腫瘤生長[17]。據(jù)報道，抑制PKM2的表達可破壞PKM2/熱休克蛋白90(HSP90)/缺氧誘導(dǎo)因子1α(human hypoxia inducible factor-1a, HIF-1α)之間的相互作用，從而抑制有氧糖酵解和增殖[28]。在本文的研究中，DEN處理組大鼠的PKM2蛋白水平顯著升高。而在RES-DEN處理組的大鼠中，PKM2的蛋白質(zhì)水平顯著降低。通過這種獨特的酶機制在癌細胞中生成丙酮酸，與生成的ATP不耦合，主要轉(zhuǎn)化為乳酸而不是轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)[35]。糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進入氧磷的TCA循環(huán)，但在缺氧時，丙酮酸通過乳酸脫氫酶(LDHA)轉(zhuǎn)化為乳酸。LDHA在腫瘤細胞中過度表達，從而維持較高的糖酵解通量[36]。此外，據(jù)報道，PKM2可以易位到細胞核中，并與HIF-1α形成復(fù)合物，作為HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活因子，促進許多基因的轉(zhuǎn)錄，包括LDHA、c-Myc、PCNA[37]。在本研究中，LDHA和PCNA水平的升高表明，在癌前階段，DEN可能誘導(dǎo)PKM2移位到細胞核中。然而，在RES-DEN處理的大鼠中，LDHA和PCNA水平顯著降低，表明RES可能阻斷PKM2向細胞核的移位。

綜上所述，本研究表明，DEN可在肝癌發(fā)生的癌前階段誘導(dǎo)肝細胞過度增殖和糖代謝的重編程。然而，RES可以通過調(diào)節(jié)糖代謝重編程抑制過度增殖。這些發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用RES預(yù)防肝癌的發(fā)生提供了更好的證據(jù)?？紤]到化療藥物和肝切除治療效果不佳，預(yù)防肝癌發(fā)生可能是降低肝癌發(fā)病率和死亡率的一個有吸引力的策略。盡管RES在預(yù)防HCC發(fā)生方面顯示出潛在的抗癌特性，但由于快速結(jié)合和低生物利用度，RES在體內(nèi)的特性減弱。因此，糖代謝重編程可能是一個有吸引力的靶點，可為提高RES的抗癌特性和開發(fā)新的靶向抗癌藥物的研究提供有效途徑。