董 瑋， 宋晨陽， 張婷婷， 武麗仙， 張徐波

(1)山西大學應用生物學研究所， 太原 030032； 2)廣東省科學院動物研究所， 廣州 510260)

以幾丁質和蛋白質為主要成分的表皮，在昆蟲的生態(tài)適應和進化中發(fā)揮重要作用[1]。幾丁質參與昆蟲的外部和內部結構組成，形成堅硬的外骨骼，參與多個生理過程[2-4]。在昆蟲體表，幾丁質可以做為其抵抗外界環(huán)境的物理屏障，同時參與形成運動跗肢器官的骨架(腿和翅)。在昆蟲體內，幾丁質可以作為肌肉的附著點，支撐昆蟲肌肉爆發(fā)出驚人的力量和速度[5]，也參與前腸、后腸和氣管系統(tǒng)的形成[6]。此外，昆蟲中腸分泌的幾丁質還參與昆蟲消化和免疫過程[7]。通過新一代轉錄物組RNA測序技術，發(fā)現大量未知功能的基因在幾丁質沉積過程中表達，可能參與表皮的形成，其中包括Osiris基因家族[8-10]。

在黑腹果蠅(Drosophliamelanogaster)基因組中共鑒定獲得24個Osiris基因，其中20個基因成簇分布于3號染色體83E的168 kb長的區(qū)域中[11-13]。Osiris基因的序列和時空表達在昆蟲中高度保守。典型的Osiris蛋白具有特定特征，在N-端具有信號肽、具有4個保守結構域，依次為2個Cys區(qū)域，duf1676結構域(Pfam family: PF07898)[14]，疏水跨膜結構域和AQXLAY motif區(qū)域[15]。目前，僅有Osiris21的功能研究的較為清楚，Lee 等人[16]報道，Osiris21參與調控果蠅眼的視紫紅質的再循環(huán)。與Osiris家族其他基因相比，Osiris24(Osi24)基因被發(fā)現的較晚，其缺失Cys區(qū)域和duf1676結構域。Schmitt-Engel等人[17]研究發(fā)現，在甲蟲幼蟲晚期注射dsRNA干擾Osiris24 的表達會導致100%致死的表型。然而，其生物學功能和作用機制有待進一步研究。

實驗誘導模式生物基因組突變是深入理解生物體作用機制的基礎。然而，傳統(tǒng)的誘變工具有明顯的缺點。化學誘變法缺乏特異性，導致基因組中許多位點發(fā)生不必要的突變。而傳統(tǒng)的反向遺傳方法，例如基因靶向同源重組效率低，勞動強度大。近年來，出現II型成簇規(guī)則穿插短回文CRISPR-repeat(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系統(tǒng)，是一種非常有效的基因編輯方法，用于誘導多種生物基因組中的位點特異性雙鏈斷裂[18,19]。其原理是利用RNA引導的核酸內切酶Cas9，專一性識別crisprRNA中20 nt間隔序列編碼的位點，與轉位RNA配對，將內切酶導向DNA中的互補靶點[20-22]。2014年，Port等人[23]篩選了多種CRISPR/Cas工具組合，系統(tǒng)地評估了轉基因Cas9果蠅品系和gRNA表達質粒的效率。報道了Cas9和gRNA來源的優(yōu)化組合，優(yōu)化的轉基因工具可以有效地應用于果蠅的各種體細胞組織，允許直接在Cas9/ gRNA表達動物中鑒定突變表型。

最近的研究發(fā)現，黑腹果蠅Osiris24基因的表達和表皮沉積過程中關鍵基因的表達模式一致[24,25]。這些表皮形成的相關基因主要包括“幾丁質綁定”和“絲氨酸肽鏈內切酶”。Osiris24是否影響昆蟲表皮的發(fā)育？其在不同組織中表達是否存在差異？這些問題尚待進一步研究。本研究擬利用 CRISPR/Cas9 技術對黑腹果蠅中的Osiris24進行編輯突變和插入酵母Gal4蛋白，通過PCR以及遺傳學方法鑒定果蠅的轉基因編輯效率，觀察Osiris24突變體的發(fā)育情況，檢測Osiris24-Gal4的表達情況，以期檢測Osiris24的組織表達特性和探究Osiris24突變對昆蟲生長發(fā)育的影響，為Osiris基因功能的進一步研究提供模型。

1 材料與方法

1.1 材料

以nos-Cas9果蠅胚胎為材料，通過顯微注射，將表達載體Gal4片段插入到果蠅基因組中。轉基因品系飼養(yǎng)采用標準玉米酵母培養(yǎng)基，飼養(yǎng)溫度為25 ℃±1℃，光照周期為16 L:8D，相對濕度50% ～ 60%。

pCFD4骨架載體訂購于addgene(https://www.addgene.org/)，為劍橋大學Bullock實驗室構建[23]，Gal4骨架載體購自addgene(https://www.addgene.org/)，實驗中所有引物合成以及核酸序列測序服務均由生工生物工程股份有限公司提供，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、pEASY?-T3 Cloning Kit、2× Taq Master Mix (Dye Plus)、ClonExpress II One Step Cloning Kit、2xPfu MasterMix、DNA提取試劑盒、Bbs1內切酶分別從北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司、南京諾唯贊生物科技股份有限公司、北京康為世紀生物科技有限公司、NEB(北京)有限公司購買。

1.2 靶點設計和載體構建

果蠅Osiris24序列從Flybase網站獲得(http://flybase.org/)，Gene ID: CG15589，Location:LOC- 83E1-83E1; 3-47.5 cM，根據Osiris24基因序列特征，利用http://crispr.mit.edu/在線分析工具，將第1外顯子序列作為設計編輯靶點范圍，并結合脫靶等因素篩選獲得2個gRNA 靶位點。

根據Port 等人[23]方法構建雙靶位點sgRNA載體。先利用Bbs1內切酶對pCFD4載體進行酶切線性化。利用引物O24-sg-F和O24-sg-R通過PCR擴增獲得含2個靶點序列，并分別加入pCFD4載體的5′-端和3′-端的同源序列，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，通過同源重組的方法將目的片段與載體連接，構建好的重組載體轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，平板培養(yǎng)后挑單克隆菌落，經PCR驗證并送公司測序。測序結果正確的菌落擴大培養(yǎng)并提取質粒，獲得pCFD4-Osi24-sgRNA載體。

Donor-Osiris 24-Gal4載體制備：使用DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取野生型果蠅基因組，在2個sgRNA靶位點上下游分別設計同源臂序列引物O24-F和O24-R，通過PCR方法獲取序列片段。PCR產物回收純化，連接T3載體并轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞后涂布在篩選平板上，挑取單克隆菌落進行PCR驗證，其中的陽性克隆送公司測序，選擇正確序列的菌落擴大培養(yǎng)，提取同源臂T-HA質粒，將質粒通過反向PCR方法斷開成線性載體，以便使T2A-Gal4片段插入并使其正常表達。以T2A-Gal4質粒為模板，使用引物Gal4-F和Gal4-R擴增Gal4序列，同時分別在5′-端和3′-端連入15 bp T-HA載體的同源序列，將獲得的Gal4全長序列和T-HA線性載體通過同源重組連接成完整質粒。通過測序驗證，篩選獲得Donor-Osiris 24-Gal4載體。將pCFD4-Osi24-sgRNA和Donor-Osiris 24-Gal4兩個質粒以濃度1∶5混合注射至400個nos-Cas9果蠅胚胎。

1.3 基因編輯品系的靶點分析與鑒定

為檢測Osiris24基因突變及Osiris24-Gal4插入情況，在Osiris24基因組sgRNA靶位點上游和Gal4序列中間分別設計引物J-O24-F和J-O24-R(見Table 1)，擴增產物長度為650 bp (Fig.3A)，在插入的Gal4序列內部設計引物J-Gal4-F和J-Gal4-R，擴增產物長度為496 bp (Fig.3B)對轉基因果蠅子一代進行單頭基因組提取和PCR擴增檢測，擴增片段送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。根據測序結果，篩選獲得陽性突變果蠅親本。為了進一步確認Osiris24-Gal4的插入，采用遺傳學方法與UAS-GFP果蠅進行雜交，通過檢測GFP信號表達判斷插入的Gal4是否能正常工作。

1.4 Osi24突變體果蠅性狀檢測

將篩選獲得的Osi24突變體果蠅親本與平衡子果蠅(BC/Cyo;Tm6B/MKRS)雜交，通過遺傳學重組方法，移除Cas9蛋白，引入平衡子，觀察其子代是否能夠純合，觀察純合Osi24突變體果蠅的活力。

1.5 Osi24基因表達位置的檢測

將篩選獲得的Osiris24-Gal4雄蟲與UAS-GFP雌蟲雜交，檢測子一代果蠅不同齡期和不同組織GFP信號，熒光顯微鏡拍照記錄表達位置。

Table 1 Primer information

2 結果

2.1 基因編輯表達載體的構建

Osiris24位于果蠅第3條染色體內，DNA序列編碼區(qū)全長為8 868 bp，由5個外顯子和4個內含子組成，以第 1 外顯子作為突變區(qū)域設計靶點，選取第1 外顯子的+275 到+277 bp 處的CGG 為 PAM(protospacer-adjacent motif)序列，+255 到+274 bp之間的 20 bp 堿基作為靶點1 序列，+383 到+385 bp 處的 AGG 堿基為 PAM 序列，+363 到+382 bp 區(qū)間的 20 bp 堿基作為靶點2的編輯序列(Fig.1A)，基因編輯載體進入果蠅胚胎后產生2條sgRNA，進行目的片段的切割。切割目的片段后由Donor-Osiris24-Gal4提供模板，通過果蠅自身同源重組修復(homologous recombination，HR)機制，進行Gal4插入。為使重組CRISPR/Cas9 載體中的 2 個靶點序列分別由 U6-1 和 U6-3啟動子驅動，通過酶切、同源重組將2個靶點序列串聯(lián)至pCFD4載體，獲得pCFD4-Osi24-sgRNA重組表達載體(Fig.1B)。經測序分析表明，重組載體中的 2 個靶點序列與設計序列一致(Table 1，Fig.2)，靶點準確連接到pCFD4載體中。

Fig.1 Target sites of the gRNA in the Osi24 gene locus and constructing style of the pCFD4-Osi24-sgRNA and Donor-Osiris24-Gal4 vectors (A) Position of two gRNA targets in the Osi24 gene locus; (B) pCFD4-Osi24-sgRNA and Donor-Osiris24-Gal4 vectors. UTRs are shown in black box, and exons are shown in white box. LB: Left border; RB: Right border

Fig.2 Diagram of the Gal4 insert on the exon1 of Osiris24 gene The words with the underline represented primer sequence. The gray words indicated the insertion base

2.2 突變基因果蠅的鑒定

通過顯微注射法將100 ng/μL pCFD4-Osi24-sgRNA質粒和500 ng/ μL Donor-Osi24-Gal4質粒同時注射到400個nos-Cas9果蠅胚胎中，共孵化獲得G0代83頭雄蟲和62頭雌蟲。

隨機選取14頭G0代雄蟲成蟲，分別與平衡子果蠅雌蟲1對1雜交產生T1代，選取14組T1代幼蟲進行DNA提取，進行PCR對插入效率進行檢測(Fig.2，Fig.3)。由Fig.3結果顯示，共有13組T1代幼蟲可以擴增出650 bp長度的條帶，為陽性插入果蠅，有1組T1代幼蟲擴增出微弱的條帶，該條帶可能是由于果蠅飼料中酵母導致的DNA污染，進一步通過測序驗證其為陰性果蠅，基因編輯陽性率約達92.8%。PCR檢測正確的品系與UAS-GFP果蠅進行雜交，子一代均可檢測到綠色熒光。

Fig.3 PCR detection of Gal4 sequence in the gene-editing flies of T1 generation The insertion of Gal4 sequence was detected by PCR. (A) The sequence from homology arm to Gal4 region. H1-H14: different samples for Gal4 insertion detection. (B) The part sequence of Gal4. G1-G14: different samples for Gal4 sequence detection. M: 2 000 bp DNA marker

2.3 突變體性狀

將篩選獲得陽性的T1代果蠅對應的親本G0代的雄蟲與平衡子果蠅的雌蟲雜交，子代篩選移除Cas9蛋白，由此獲得Osi24-Gal4/Tm6B和Osi24-Gal4/MKRS兩個Gal4插入品系。觀察發(fā)現，Osi24純合突變體在胚胎或1齡幼蟲期致死，雜合突變體未觀察到可見的表型。

2.4 Gal4的表達部位檢測

將篩選獲得的Osi24-Gal4果蠅與UAS-GFP果蠅進行雜交，檢測子一代幼蟲Osiris24的表達部位。結果正如Fig.4所示，Osiris24在不同齡期幼蟲中均有表達，幼蟲期主要在腸道和體壁表達(Fig.4A)。進一步解剖3齡幼蟲不同組織進行觀察，發(fā)現Osiris24在前腸和后腸高表達(Fig.4A)。對蛹期Osiris24的表達部位進行檢測，發(fā)現在蛹期Osiris24主要在翅上表達(Fig.4B)。

Fig.4 The expression pattern of Osiris24 in different tissues and different stages of Drosophila Osiris24 is expressed throughout larval and pupal stages. At the larval stage, Osiris24 is mainly expressed in the integument, foregut and hindgut (A). At the pupal stage, Osiris24 is expressed in the integument and wings (B). L1-L3: First to three instar larvae, fg:Foregut, mg: Midgut; hg: Hindgut

3 討論

昆蟲體壁具有重要的保護作用和生理功能，殺蟲劑穿過表皮需要經過上表皮(富含脂質)及原表皮(富含幾丁質和蛋白質)才能到達體內發(fā)揮毒殺作用[26, 27]。昆蟲表皮發(fā)育的主要途徑和關鍵基因是害蟲防治的重要靶標。黑腹果蠅是重要的模式昆蟲，具有清晰的遺傳背景和強大的遺傳學工具，在昆蟲學研究中占據重要地位。以黑腹果蠅為對象開展表皮發(fā)育研究，對農業(yè)昆蟲的相關研究和害蟲防治靶標的篩選具有重要的借鑒意義。

II型成簇規(guī)則穿插短回文(CRISPR)/(Cas)相關系統(tǒng)是近年來出現的一種操縱生物基因組的有效方法[18,19]。2014年，Port等人[23]報道了一種黑腹果蠅高效基因組編輯工具，由轉基因Cas9品系和通用引導RNA(gRNA)表達質粒構成。相同的gRNA在不同的U6啟動子控制下表達不同活性。gRNA表達質粒與寡核苷酸或長雙鏈供體模板結合，通過同源定向修復可以實現精確的基因組編輯。前人研究發(fā)現，Osiris基因在幾丁質沉積過程中表達，可能參與表皮的形成[24,25]。為進一步研究Osiris基因的功能，本研究利用Port等人[23]構建的pCFD4敲除載體骨架對Osiris24基因進行編輯。將Osiris24的2個靶向sgRNA序列插入Bbs1酶切位點中獲得目的基因的敲除載體，同時將酵母的Gal4蛋白序列和Osiris24靶向sgRNA的2段同源臂相連接，插入T3載體中獲得了用于基因插入編輯的供體載體。插入位點的測序結果和Gal4功能驗證均證實，目的基因被有效地敲除和Gal4的正確插入。

Osi24雜合突變體未觀察到可見的表型，純合突變體在胚胎期或1齡幼蟲期致死，揭示了其在果蠅早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Osi24在不同齡期幼蟲中均有表達，幼蟲期主要在體壁、前腸和后腸高表達，蛹期主要在翅上高表達。幾丁質是昆蟲體壁和翅的主要成分，也參與前腸和后腸的形成[6]。前人通過轉錄物組學分析，報道了Osiris家族基因在昆蟲幾丁質沉積過程中表達[8,25]。根據Osi24基因的表達特征，我們推測，其參與果蠅體壁、前后腸的發(fā)育和蛹期翅的發(fā)育，并且很可能與幾丁質的合成和沉積過程有關，其具體的生物學功能和作用機制尚有待進一步研究。