潘明明 馮燕 李青梅

丁香脂素(Syr)是一種從各種谷物和藥用植物的皮質(zhì)部、籽等分離出來的藥理木脂素，具有抗炎和抗氧化特性[1]。有研究表明，Syr可通過激活RAW 264.7細(xì)胞中的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)，下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB來減弱炎癥反應(yīng)[2]。本研究主要探討Syr在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠中的作用及相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

1.材料：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只(周齡8～10周，體重200～250 g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雞Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；Syr(純度≥99%，CAS號(hào)：1177-14-6)購(gòu)自南京普怡生物科技有限公司；大鼠谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；兔抗大鼠IL-6抗體、兔抗大鼠IL-1β抗體、兔抗大鼠TNF-α抗體、兔抗大鼠TLR4抗體、兔抗大鼠NF-κB p65抗體、兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Trizol、Prime ScriptTMRT與TB Green?Premix EX TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

2.方法

(1)造模與分組：將70只Wistar大鼠安置在干凈整潔、光照充足(光照周期12 h)、溫度為(24±2)℃的飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)選擇12只大鼠不做任何處理，每日正常飼養(yǎng)，作為Normal組。剩余58只大鼠進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)，將CⅡ溶解后，加入弗氏完全佐劑，并在冰浴條件下乳化完全，配成終濃度為2 mg/ml的溶液，取0.2 ml溶液于大鼠皮下、尾根部位進(jìn)行多點(diǎn)注射，并在第8 d將佐劑換成不完全佐劑后采用同樣方法再次注射大鼠，完成加強(qiáng)免疫。再觀察14 d，將其中造模成功且關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)接近的48只CIA大鼠隨機(jī)分為Control組、Syr20組、Syr50組和Syr100組，每組12只。其中Syr20組、Syr50組和Syr100組CIA大鼠分別接受Syr 20、50、100 mg·kg-1·d-1連續(xù)灌胃36 d，其中Control組和Normal組大鼠接受等體積的生理鹽水連續(xù)灌胃36 d。

(2)大鼠AI評(píng)定：在Syr或生理鹽水給藥前1 d及給藥后第6、12、18、24、30、36 d，根據(jù)文獻(xiàn)[3]中的方法，觀察大鼠四肢病變程度、關(guān)節(jié)紅腫程度，并進(jìn)行AI評(píng)定，AI為四肢關(guān)節(jié)炎評(píng)分之和，AI>4為造模成功。

(3)大鼠血清細(xì)胞因子水平檢測(cè)：在Syr或生理鹽水給藥后第36 d，將5組大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后，迅速進(jìn)行心臟采血，收集各組血清標(biāo)本，在-80 ℃條件下保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠血清GSH、CAT、SOD、IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

(4)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：在Syr或生理鹽水給藥后第36 d，5組大鼠經(jīng)方法(3)心臟采血后進(jìn)行脫頸處理，收集各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織，采用Trizol試劑從大鼠踝關(guān)節(jié)組織勻漿中提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，使用Prime ScriptTMRT合成每種待檢測(cè)因子的cDNA。以上述制備得到的cDNA為模板，通過RT-PCR試劑盒定量分析待測(cè)目的基因的表達(dá)。采用2-△△ct法計(jì)算IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參基因，按照試劑盒說明書設(shè)置RT-PCR反應(yīng)條件為：95.0 ℃，30 s預(yù)變性；95.0 ℃，10 s；60.0 ℃，30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中的引物序列如下：β-actin上游：TGCTGTCCCTGTATGCCTCT,下游：GGTCTTTACGGATGTCAACG；TNF-α上游：CGATGAGGTCAATCTGCCCA,下游：CCAGGTCACTGTCCCAGC；IL-1β上游：TGAAATGCCACCTTTTGACAG,下游：CCACAGCCACAATGAGTGATAC；IL-6上游：TGCCTTCTTGGGACTGAT,下游：CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT。

(5)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)：同方法(4)收集5組大鼠踝關(guān)節(jié)組織并提取蛋白質(zhì)，采用Western blot檢測(cè)TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平。

結(jié) 果

1.5組大鼠不同時(shí)間AI比較：5組大鼠Syr或生理鹽水給藥后第6、12、18、24、30、36 d的AI比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Control組大鼠生理鹽水給藥后第6、12、18、24、30、36 d的AI均高于Normal組(P<0.01)。Syr20組、Syr50組及Syr100組大鼠Syr給藥后第6、12、18、24、30、36 d的AI均低于Control組(P<0.05或P<0.01)。Syr50組大鼠Syr給藥后第12、30 d及Syr100組大鼠Syr給藥后第6、12、30 d的AI均低于Syr20組(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.5組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較：5組大鼠血清GSH、CAT、SOD、IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Control組大鼠血清GSH、CAT、SOD水平均低于Normal組，IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于Normal組(P<0.01)。Syr20組、Syr50組及Syr100組大鼠血清GSH、CAT、SOD水平均高于Control組，Syr50組及Syr100組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于Control組(P<0.05或P<0.01)。見表2。

3.5組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較：5組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Control組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平均高于Normal組(P<0.01)。Syr20組大鼠關(guān)節(jié)組織TNF-α mRNA及Syr50組、Syr100組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平均低于Control組(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 5組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

4.5組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及MMP-3水平比較：5組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、NF-κB p65及MMP-3水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Control組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均高于Normal組(P<0.01)。Syr20組、Syr50組、Syr100組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均低于Control組(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 5組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及MMP-3水平比較

討 論

關(guān)節(jié)炎指一處或多處關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)痛和炎癥，隨著年齡增長(zhǎng)而不斷加重[4-5]。本研究通過構(gòu)建CIA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)Syr能顯著改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀。

活性氧(ROS)在各種炎癥和免疫疾病中具有重要地位[6]。在機(jī)體中，內(nèi)源性抗氧化劑(GSH、SOD和CAT)可作為自由基清除劑和酶，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[7]。已有研究表明，Syr能夠降低氧化應(yīng)激水平，達(dá)到保護(hù)組織和細(xì)胞的目的[8-9]。本研究結(jié)果顯示，CIA大鼠血清抗氧化酶GSH、SOD和CAT水平較低，而Syr通過提高血清GSH、SOD和CAT水平，使CIA大鼠的氧化還原狀態(tài)趨于正常。表明Syr可通過抑制氧化應(yīng)激，減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)破壞程度。

促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β及TNF-α在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)中大量表達(dá)。TNF-α在啟動(dòng)炎癥和破壞滑膜、軟骨中起重要作用[10]。多項(xiàng)體外研究表明，促炎細(xì)胞因子能刺激滑膜細(xì)胞，促進(jìn)滑膜增生、調(diào)控細(xì)胞因子、產(chǎn)生降解酶，從而進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)破壞[11]。既往研究表明，Syr能夠通過抑制NF-κB信號(hào)通路，降低促炎細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α水平以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果顯示，Control組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于Normal組，Syr50組及Syr100組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于Control組。Control組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平均高于Normal組，Syr20組大鼠關(guān)節(jié)組織TNF-α mRNA及Syr50組、Syr100組大鼠關(guān)節(jié)組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平均低于Control組，提示Syr可能通過抑制IL-6、IL-1β、TNF-α來實(shí)現(xiàn)改善CIA大鼠的炎癥反應(yīng)。

NF-κB蛋白通常為異源二聚體(p50和p65)形式存在，在刺激下，NF-κB的p65亞基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，從而促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，正向調(diào)控炎癥反應(yīng)。本研究中，Control組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均高于Normal組，Syr20組、Syr50組、Syr100組大鼠關(guān)節(jié)組織TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均低于Control組，表明CIA大鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較高，而Syr顯著抑制NF-κB p65的表達(dá)，Syr抗關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制至少部分是通過抑制NF-κB信號(hào)通路，從而達(dá)到抗關(guān)節(jié)炎目的。研究表明，TLR4能激活NF-κB通路[12]，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子的上調(diào)。本研究中，給予CIA大鼠Syr治療后，其關(guān)節(jié)組織TLR4蛋白水平顯著下降，進(jìn)一步表明Syr可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路達(dá)到治療關(guān)節(jié)炎的目的。

MMP-3屬于蛋白水解酶，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白導(dǎo)致韌帶或軟骨損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，Control組大鼠關(guān)節(jié)組織MMP-3水平高于Normal組，而Syr20組、Syr50組、Syr100組大鼠關(guān)節(jié)組織MMP-3水平均低于Control組，表明Syr作為治療關(guān)節(jié)炎的藥物存在較大的研究前景。

綜上所述，Syr可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀。