劉石琳 彭棟 陳鵬 逯霞 石雨薇

急性髓系白血病(AML)發(fā)病機制與遺傳基因突變密切相關。目前AML治療仍以規(guī)范化化療為主，但臨床實踐發(fā)現(xiàn)AML患者化療療效與預后復發(fā)存在較大差異[1-2]。相關臨床研究結果證實，AML發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)與某些基因突變緊密相關，其中核磷蛋白1(NPM1)與Runt相關轉錄因子1(RUNX1)等基因受到關注[1-3]。目前已證實，包括AML在內的多種血液系統(tǒng)腫瘤與NPM1及RUNX1基因突變相關，但臨床研究多為探討單基因突變與AML患者預后的相關性。近年研究發(fā)現(xiàn)，非急性早幼粒細胞白血病(M3)型AML患者存在NPM1與RUNX1基因共突變現(xiàn)象[4]。本研究主要探討NPM1與RUNX1基因共突變與非M3型AML患者化療療效及預后的相關性，為臨床對非M3型AML進行靶向性治療、改善療效及預后提供依據。

對象與方法

1.對象：納入2017年1月～2018年12月我院收治的120例初診非M3型AML患者，其中男68例，女52例，年齡14～66歲，中位年齡42歲。納入標準：(1)AML診斷依據法、美、英分型系統(tǒng)(FAB)分型及WHO急性白血病分類及診斷標準(2016年)[4]；(2)接受骨髓細胞學檢查；(3)無糖皮質激素使用史。排除標準：(1)合并肝癌、胃癌、肺癌等惡性實體腫瘤；(2)合并心、肺、肝、腎等臟器嚴重功能不全。根據FAB國際分型，120例患者中M1型9例、M2型58例、M4型19例、M5型27例、M6型7例。本研究已通過我院倫理委員會審核批準，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)一般臨床資料和實驗室檢查結果收集：包括性別、年齡、AML類型、骨髓幼稚細胞數量、初診時的血常規(guī)結果[WBC計數、中性粒細胞 (NEU)計數、淋巴細胞(LYM)計數]。

(2)NPM1與RUNX1基因檢測：①分離骨髓單個核細胞：抽取所有患者骨髓后立即放入抗凝試管中，分離白細胞，加入紅細胞裂解液，混勻靜置10 min，離心后吸除上清液，洗滌沉淀。②RNA提取及cDNA合成：分離的骨髓單核細胞Trizol提取液，加入氯仿150 μl，混勻，4 ℃靜置5 min，離心取上清液；上清液加入異丙醇，混勻，冰浴10 min，離心洗滌3遍，保留沉淀；加75%乙醇，振蕩離心2次，65 ℃烘干；加入RNase-free水溶解沉淀；紫外分光光度計對吸光度值檢測，測定總RAN濃度；合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。NPM1與RUNX1基因表達水平通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測，結果采用2-ΔCt表示。

(3)基因突變檢測：應用基因測序儀(型號：Applied Biosystems 3130，購自美國應用生物系統(tǒng)公司)，通過毛細管電泳對陽性PCR產物和測序引物進行測序，運用Chromas軟件分析測序結果，對NPM1與RUNX1基因的陽性PCR產物行反向引物測序進行驗證。分別檢測NPMI基因第12外顯子基因的插入、RUNX1基因第7外顯子基因的插入突變情況。根據基因突變結果將120例AML患者分為NPM1基因突變型組(33例)和NPM1基因野生型組(87例)、RUNX1基因突變型組(26例)和RUNX1基因野生型組(94例)、NPM1與RUNX1基因共突變型組(23例)和NPM1與RUNX1基因野生型組(97例)。

(4)臨床化療方案：本研究臨床化療方案為柔紅霉素(DNR)+阿糖胞苷(Ara-c，DA)方案或高三尖杉酯堿(HHT )+Ara-c(HA)方案。DA方案：DNR 45 mg·m-2·d-1，連續(xù)靜脈滴注3 d；Ara-c 150 mg·m-2·d-1，連續(xù)靜脈滴注7 d。HA方案：HHT 2.5 mg·m-2·d-1，連續(xù)靜脈滴注7 d；Ara-c 150 mg·m-2·d-1，連續(xù)靜脈滴注7 d。所有患者均治療3個療程。

(5)療效判斷：AML患者接受3個化療療程后療效判斷標準[5]：①完全緩解(CR)：無貧血、出血、感染或白血病細胞浸潤性表現(xiàn)；Hb>90 g/L，WBC計數正常或減少，無未成熟細胞，PLT計數>100×109/L；原始細胞和早期細胞骨髓中的幼稚細胞(或未成熟細胞)<5%，紅細胞和巨核系正常。②部分緩解(PR)：臨床、血液和骨髓三個方面中的一個或兩個方面不符合CR標準；骨髓原始細胞和早期幼稚細胞< 20%。③無緩解(NR)：臨床、血液和骨髓方面均未能滿足CR，骨髓中原始細胞和早期幼稚細胞>20%。有效率(%)=(CR+PR)/總例數×100%。

(6)染色體核型分析：應用短期培養(yǎng)0.01%胰酶消化染色體G顯帶技術，在顯微鏡下觀察染色體G顯帶核型，進行染色體分析。染色體核型按照《人類細胞遺傳學國際命名體制》判定。

(7)隨訪：患者出院后予以門診或電話隨訪，間隔時間為2個月，隨訪終點為出院后2年或患者死亡。記錄所有患者的總生存期(OS)及并發(fā)癥發(fā)生情況。

結 果

1.基因突變檢測結果：120例非M3型AML患者成功完成染色體核型分析113例(正常核型51例，異常核型69例)，失敗7例。共檢測出NPM1基因突變33例，發(fā)生率為27.5%(33/120)； RUNX1基因突變26例，發(fā)生率為21.7%(26/120)；NPM1與RUNX1基因共突變23例，發(fā)生率為19.2%(23/120)。與正常核型患者相比，異常核型患者NPM1基因突變[15.7%(8/51) 比36.2%(25/69) ，P=0.013]與RUNX1基因突變[9.8%(5/51) 比30.4%(21/69) ，P=0.007]比例均較高。

2.不同基因表達型組非M3型AML患者一般臨床資料及實驗室檢查結果比較：NPM1基因野生型組與NPM1基因突變型組、RUNX1基因野生型組與RUNX1基因突變型組、NPM1與RUNX1基因野生型組與NPM1與RUNX1基因突變型組患者性別、年齡、AML類型及初診血常規(guī)中WBC、NEU、LYM計數比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、2、3。

3.不同基因表達型組非M3型AML患者療效比較：

120例患者隨訪時間8～24個月，中位隨訪時間為19個月。NPM1基因野生型組患者CR 35例，PR 33例，NR 19例，治療有效率為78.2%(68/87)；NPM1基因突變型組患者CR 21例，PR 10例，NR 2例，治療有效率為93.9%(31/33)；NPM1基因突變型組患者治療有效率顯著高于NPM1基因野生型組 (χ2=4.126，P=0.042)。RUNX1基因野生型組CR 30例，PR 30例，NR 37例，治療有效率為61.9%(60/97)；RUNX1基因突變型組患者CR 14例，PR 11例，NR 1例，治療有效率為96.1%(25/26)；兩組患者治療有效率比較差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=3.475，P=0.062)。NPM1與RUNX1基因野生型組患者CR 30例，PR 30例，NR 37例，治療有效率為61.9%(60/97)；NPM1與RUNX1基因共突變組患者CR 13例，PR 8例，NR 2例，治療有效率為91.3%(21/23)；NPM1與RUNX1基因共突變組治療有效率顯著高于NPM1與RUNX1基因野生型組 (χ2=7.350，P=0.007)。

4.不同NPM1與RUNX1基因表達型非M3型AML患者生存分析：Kaplan-Meier生存分析結果顯示，隨訪2年NPM1與RUNX1基因共突變患者OS長于NPM1與RUNX1基因野生型，而NPM1或RUNX1基因單突變患者OS介于前兩者之間(P<0.05)。見圖1。

5.影響非M3型AML患者化療預后的因素分析：多因素logistic分析結果顯示，骨髓幼稚細胞數量是非M3型AML患者化療后2年生存率的危險因素(OR=2.017，P=0.018)，而NPM1與RUNX1基因共突變是其保護因素(OR=0.621，P=0.026)。

6.不同NPM1與RUNX1基因表達型非M3型AML患者并發(fā)癥比較:NPM1與RUNX1基因共突變組與NPM1與RUNX1基因野生型組患者化療后感染發(fā)生率[17.4%(4/23)比29.9%(29/97)，P=0.227]、復發(fā)率[13.0%(3/23) 比10.3%(10/97)，P=0.704]及髓外浸潤發(fā)生率[8.7%(2/23) 比12.4%(12/97)，P=0.622]比較差異均無統(tǒng)計學意義。

討 論

AML發(fā)生、發(fā)展和轉歸與癌基因的激活、抑癌基因的失活密切相關。相關研究證實，AML常見的分子遺傳學改變是NPM1、RUNX1、FLT3、C-KIT等基因突變[6]，然而這些基因在國內外不同AML患者中總突變率存在較大差異，這也提示AML基因突變具有異質性，可能與民族、種族、地區(qū)等因素有關[7]。近年來臨床認為單一基因突變可能不足以導致AML的發(fā)生、發(fā)展，患者體內應存在2個或以上基因共同突變，互相起到協(xié)同效應[8]。僅探討單一基因突變對AML患者治療敏感性及預后評估的臨床意義有限，因此探尋能較好評估AML患者療效及預后的常見基因共突變已成為研究熱點。

NPM1基因編碼的多功能磷蛋白參與核質間物質轉運，促進核糖體合成，能有效保持細胞的遺傳穩(wěn)定性及基因組的穩(wěn)定性。而攜帶NPM1基因突變的AML細胞多具有遺傳學不穩(wěn)定性，能調控AML細胞增殖和凋亡過程，同時也會伴隨其他基因突變[9]。一項國外研究報道結果顯示，正常核型AML患者NPM1基因突變發(fā)生率為47.4%，而在初診AML患者中的發(fā)生率僅為20.5%～25.8%[10]，這與本研究非M3型AML患者NPM1基因突變發(fā)生率為27.5%結果一致。RUNX1基因編碼蛋白具有調節(jié)造血功能作用，被認為是造血干細胞的關鍵調節(jié)因子之一。RUNX1基因突變會干擾造血細胞的正常分化，造成髓細胞分化延緩及造血干細胞生長發(fā)育阻滯，這也被認為是白血病前期狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)RUNX1基因在非M3型AML患者中的總突變率為21.7%，顯著高于國外研究報道[11]，其原因可能與研究人群種族差異存在一定相關性。

由于M3型AML患者的臨床治療措施與其他類型AML患者存在顯著差異[12]，因此不能和其他類型AML混為一談，故本研究納入的研究對象排除M3型患者。本研究結果顯示，非M3型AML患者的NPM1與RUNX1基因共突變發(fā)生率為19.2%，這與既往研究結果一致[3,10]?？紤]本研究樣本量較小，需要大樣本臨床研究予以驗證。本研究結果表明，NPM1基因突變型組患者治療有效率顯著高于NPM1基因野生型組，提示NPM1基因突變預示非M3型AML患者化療效果理想，較易達到CR，這與國外既往研究結果一致[13]。但本研究中RUNX1基因野生型組與RUNX1基因突變型組患者治療有效率比較差異無統(tǒng)計學意義，而國外研究結果認為急性T淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征及AML等患者中，RUNX1基因突變會降低化療耐藥發(fā)生率[14]，其不同的原因還需進一步研究分析。但NPM1與RUNX1基因共突變組患者治療有效率顯著高于NPM1與RUNX1基因野生型組，且生存分析結果也證實NPM1與RUNX1基因共突變非M3型AML患者的2年預后更好。多因素logistic分析顯示，NPM1與RUNX1基因共突變是非M3型AML患者預后的保護因素。在對患者化療后隨訪發(fā)現(xiàn)，NPM1與RUNX1基因共突變組與NPM1與RUNX1基因野生型組患者的化療后感染、復發(fā)及髓外浸潤發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計學意義，提示臨床可通過干預NPM1與RUNX1基因共突變，可能會對非M3型AML患者化療療效及預后起到改善效果。

綜上所述，NPM1與RUNX1基因共突變與非M3型AML患者化療療效及預后均顯著相關，這也為該病的診治提供了新思路。但本研究也有不足之處，如尚未對其他常見靶基因與相關信號通路進行研究，NPM1與RUNX1基因共突變的AML患者長期預后尚不能確定，還有待進一步探討分析NPM1與RUNX1基因共突變與其他預后因素的相關性。