皮國(guó)良 李明 嚴(yán)龍君 金軍

2020年全球因食管癌死亡的病例共54萬(wàn)，中國(guó)因食管癌死亡人數(shù)則多達(dá)30萬(wàn)[1]。目前因食管癌早期診斷方法有限，內(nèi)鏡下活檢是明確診斷的主要方法。雖術(shù)后5年生存率超過95%，但是并非所有患者都能接受手術(shù)治療[2]。食管癌主要病理類型為鱗癌和腺癌，其中食管鱗狀細(xì)胞癌是我國(guó)最主要的病理類型，占90%以上。因此，研究食管癌的潛在腫瘤標(biāo)志物非常重要，尤其是對(duì)于中晚期食管鱗癌患者。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路參與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，阻止腫瘤細(xì)胞的凋亡，可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放化療的耐受性。腫瘤組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)上調(diào)會(huì)增加Nrf2轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)增加，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐受能力。本文探討Nrf2、HIF-1α在食管鱗癌中的表達(dá)，以期提高臨床對(duì)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為食管鱗癌治療提供新的靶點(diǎn)依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2010年6月～2020年8月湖北省腫瘤醫(yī)院病理科食管鱗癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織切片各34例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)切片來(lái)源患者符合食管鱗狀細(xì)胞癌病理診斷，需兩名高年資病理科醫(yī)生確認(rèn)；(2)切片為完整的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織；(3)切片來(lái)源患者均行食管癌根治術(shù)且未接受術(shù)前放化療、免疫治療或靶向治療；(4)切片來(lái)源患者未合并其他惡性腫瘤；(5)患者術(shù)后均未接受進(jìn)一步抗腫瘤治療。本研究是以術(shù)后病情復(fù)發(fā)作為研究的終點(diǎn)，所有患者均按照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)食管癌臨床指南2020版進(jìn)行腫瘤的TNM分期。本研究已通過湖北省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

2.方法

(1)臨床資料：收集切片來(lái)源患者的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤部位(距離上門齒約24cm定義為上段食管癌，25～32cm定義為中段食管癌，>32cm定義為下段食管癌)、病變長(zhǎng)度、是否侵及食管黏膜下層或固有肌層、腫瘤浸潤(rùn)深度(T1～T4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期(Ⅰ期～Ⅳ期)及預(yù)后情況。

(2)免疫組化染色及陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)：采用免疫組化方法同時(shí)對(duì)食管鱗癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織切片進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈淺黃色或棕褐色顆粒，即視為陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)所有切片利用賽維爾圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)讀取組織測(cè)量區(qū)域，先進(jìn)行染色強(qiáng)度值評(píng)分：無(wú)著色為陰性，計(jì)0分；淡黃色為弱陽(yáng)性，計(jì)1分；棕黃色為中陽(yáng)性，計(jì)2分；棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性，計(jì)3分。每張切片于鏡下(×40)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比率計(jì)分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。陽(yáng)性細(xì)胞比率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè))/細(xì)胞總數(shù)(個(gè))×100%。綜合陽(yáng)性評(píng)分(分)=染色強(qiáng)度值分值(分)×陽(yáng)性細(xì)胞比率分值(分)。0～3分為陰性，≥4分為陽(yáng)性，數(shù)值越大說明綜合陽(yáng)性強(qiáng)度越強(qiáng)。

(3)分組：根據(jù)食管鱗癌組織組中Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2綜合陽(yáng)性評(píng)分結(jié)果，將34例切片分為陽(yáng)性組和陰性組。根據(jù)Nrf2、HIF-1α在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，分別對(duì)兩者表達(dá)陽(yáng)性和陰性患者的預(yù)后進(jìn)行分組比較。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)價(jià)HIF-1α、E-cadherin和mdm2與Nrf2的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2免疫組化染色結(jié)果：Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2在食管鱗癌組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)，在對(duì)應(yīng)癌旁組織中均呈陰性表達(dá)。見圖1。

圖1 食管鱗癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2免疫組化染色結(jié)果[A、B、C、D：癌組織，E、F、G、H：癌旁組織； A、E：Nrf2陽(yáng)性及陰性表達(dá)；B、F：HIF-1α陽(yáng)性及陰性表達(dá)；C、G：E-cadherin陽(yáng)性及陰性表達(dá)；D、H：mdm2陽(yáng)性及陰性表達(dá)；×40]

2.食管鱗癌組織Nrf2和HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組臨床資料比較：根據(jù)Nrf2表達(dá)情況，將食管鱗癌組織切片34例分為Nrf2表達(dá)陽(yáng)性組22例和陰性組12例；根據(jù)HIF-1α表達(dá)情況，將食管鱗癌組織切片34例分為HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性組25例和陰性組9例。Nrf2表達(dá)陽(yáng)性組侵及食管黏膜下層或固有肌層、腫瘤浸潤(rùn)深度T3～T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅱ期、Ⅲ期/Ⅳ期患者比例均高于Nrf2表達(dá)陰性組(P<0.05)，兩組其余臨床資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性組腫瘤浸潤(rùn)深度T3～T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅱ期、Ⅲ期/Ⅳ期患者比例均高于HIF-1α表達(dá)陰性組(P<0.05)，兩組其余臨床資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 食管鱗癌組織Nrf2表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組患者臨床資料比較[例(%)]

表2 食管鱗癌組織HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組患者臨床資料比較[例(%)]

3.食管鱗癌組織組及癌旁組織組中Nrf2、HIF-1α、E-cadherin、mdm2表達(dá)陽(yáng)性率比較：Nrf2、HIF-1α及mdm2在食管鱗癌組織組中表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于癌旁組織組(P<0.05)，E-cadherin在食管鱗癌組織組中表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于癌旁組織組(P<0.05)。見表3。

表3 食管鱗癌組織組及癌旁組織組中Nrf2、HIF-1α、E-cadherin、mdm2表達(dá)的陽(yáng)性率比較[例，(%)]

4.Nrf2與HIF-1α、E-cadherin及mdm2表達(dá)的相關(guān)性：Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，Nrf2在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平與HIF-1α的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.435，P=0.007)，與E-cadherin(r=0.235，P=0.042)及mdm2(r=0.331，P=0.007)均呈負(fù)相關(guān)。

5.食管鱗癌不同組別患者預(yù)后比較：Nrf2陽(yáng)性組患者術(shù)后無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)與陰性組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(36±3.9)個(gè)月比(38±3.3)個(gè)月,P>0.05]。HIF-1α陽(yáng)性組患者術(shù)后PFS與陰性組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(36±2.3)個(gè)月比(43±1.8)個(gè)月，P>0.05]。Nrf2和HIF-1α全陽(yáng)組患者術(shù)后PFS與非Nrf2和HIF-1α全陽(yáng)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(38±3.2)個(gè)月比(41±4.2)個(gè)月，P>0.05]。

討 論

有研究顯示，Ⅲ期食管癌患者經(jīng)手術(shù)及術(shù)后放化療等綜合治療后5年生存率較前有所提高，但若食管癌早期及時(shí)干預(yù)，5年生存率可達(dá)90%左右[3]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療才是食管癌防治及提高食管癌生存率的有效手段。腫瘤異質(zhì)性通常是由多種病理機(jī)制誘發(fā)而成，不同的病理機(jī)制中總有某一個(gè)或幾個(gè)因子起著關(guān)鍵作用。這些關(guān)鍵因子一旦功能失衡，則將通過信號(hào)通路產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，最終通過細(xì)胞異常的生物功能表現(xiàn)出來(lái)[4]。

Nrf2是Capncollar(CNC)轉(zhuǎn)錄因子的成員，分子量為66 kDa并由7個(gè)Neh域組成[5]。Nrf2的正常生理功能是維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)進(jìn)而發(fā)揮抗炎及抗癌活性，正常情況下呈低表達(dá)狀態(tài)。但多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中Nrf2異常高表達(dá)，Nrf2的異常表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，介導(dǎo)癌細(xì)胞對(duì)放化療的抗性，保護(hù)腫瘤細(xì)胞使其免于凋亡和衰老等[6]。Nrf2在多種腫瘤組織中均有研究，大多數(shù)呈高表達(dá)狀態(tài)，但尚未得到統(tǒng)一的結(jié)論。Nrf2在人舌鱗癌和胃癌組織中高表達(dá)，致使Nrf2-Keap1結(jié)合不穩(wěn)定，Nrf2游離出來(lái)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，通過結(jié)合ARE激活下游轉(zhuǎn)錄基因，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展[7-8]。既往研究結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中Nrf2信號(hào)通路與Wnt信號(hào)通路之間存在某種平衡關(guān)系[9]。Nrf2在腫瘤組織中的表達(dá)并非總是上調(diào)，在皮膚鱗癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)或無(wú)表達(dá)的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2在食管鱗癌組織中高表達(dá)并與食管鱗癌浸潤(rùn)的深度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，但是生存曲線提示Nrf2表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)后的影響不大，可能需要大樣本臨床試驗(yàn)證實(shí)。

HIF-1是細(xì)胞在缺氧狀態(tài)進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)利用RNA沉默HIF-1α?xí)?dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達(dá)下調(diào)并抑制胃癌細(xì)胞的局部浸潤(rùn)[12-13]。本試驗(yàn)中HIF-1α在食管鱗癌組織中高表達(dá)，其陽(yáng)性率(73.53%)顯著高于癌旁組織(44.12%)。結(jié)合HIF-1α與臨床病理因素的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中HIF-1α的表達(dá)與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。隨著食管癌患者病情進(jìn)展、局部浸潤(rùn)及淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的增加，HIF-1α呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，這也符合腫瘤組織過度生長(zhǎng)引發(fā)局部缺氧的生物學(xué)特性。結(jié)合HIF-1α對(duì)預(yù)后的影響，進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與既往研究結(jié)果一致[14]。

本研究中，E-cadherin在食管鱗癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率明顯低于癌旁組織，mdm2與之相反，與既往研究結(jié)果一致[15-16]。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，Nrf2在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平與HIF-1α的表達(dá)水平呈正相關(guān)，與E-cadherin及mdm2均呈負(fù)相關(guān)。因此，我們推測(cè)食管鱗癌的進(jìn)展與Nrf2/HIF-1α信號(hào)通路密切相關(guān)，活化的Nrf2/HIF-1α信號(hào)通路可能通過抑制E-cadherin并同時(shí)促進(jìn)mdm2的表達(dá)參與食管鱗癌的進(jìn)展。在接下來(lái)的研究中，我們將繼續(xù)完善Nrf2和HIF-1α相關(guān)食管鱗癌細(xì)胞系生物學(xué)活性的檢測(cè)，以探究Nrf2和HIF-1α在食管鱗癌進(jìn)展過程中的作用機(jī)制。本研究樣本量較小，期待循證醫(yī)學(xué)大樣本數(shù)據(jù)以獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，Nrf2/HIF-1α信號(hào)通路在食管鱗癌中呈活化的狀態(tài)并可能通過下調(diào)E-cad-herin和上調(diào)mdm2的表達(dá)參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，Nrf2可能為食管鱗癌治療提供新的靶點(diǎn)。