姚孝林

（上海朗沁生物科技有限公司，上海 200235）

銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)多為鱗屑性紅斑。銀屑病具有發(fā)病率高、病程長、病情反復(fù)且難以治愈等特點(diǎn)，再加上瘙癢和疼痛等問題，給患者的身心帶來了極大的傷害[1]。目前臨床上治療銀屑病的常用療法有局部治療、光療、生物制劑等，但均有明顯的不良反應(yīng)。中醫(yī)復(fù)方治療具有療效確切、副作用小等臨床優(yōu)勢，在銀屑病治療領(lǐng)域日益受到重視。本研究通過建立銀屑病動物模型，研究莪術(shù)醇提物乳膏通過Janus 激酶/ 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT3）通路對銀屑病大鼠皮膚病理改變的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇SD 健康大鼠48 只，雌雄各半，由基爾頓生物科技有限公司提供。鼠齡3 ～6 個月，平均（3.81±1.53）個月；體重200 ～250g，平均體重（220.21±7.86）g；飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，室內(nèi)濕度35% ～40%。動物室均經(jīng)過定時紫外線照射消毒。所有動物均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)時間均為1 周。動物可以自由飲水及活動。

1.2 試驗(yàn)藥物

莪術(shù)來源于四川新荷花中藥飲片有限公司。莪術(shù)醇提取乳膏的制備：取50g 莪術(shù)粉放置于錐形瓶中，加入250mL 甲醇，超聲攪拌10 min×3 次，取上清液離心（1500rpm，10 min），再向錐形瓶中加入250mL甲醇，超聲攪拌10 min，靜置4h，取上清液離心，將2 次離心液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收甲醇，水浴溫度45℃。50% 乙醇洗出，水浴蒸發(fā)除去乙醇，得到棕紅色黏稠液體，即得到莪術(shù)醇提取物5.6g[1]。乳膏基質(zhì)的制備：取單硬脂酸甘油酯70g、硬脂酸140g、白凡士林85g、十六醇20g、羥苯乙酯1g、乙醇8mL，混合加熱至70℃，制成油相。將甘油85g、十二烷基硫酸鈉10g 溶解于適量的純化水中，加熱至70℃，制成水相，然后將油相緩慢加入水相中，不停攪拌，制成乳膏基質(zhì)[1]。莪術(shù)醇提物乳膏的制備：分多次在莪術(shù)醇提物中加入乳膏基質(zhì)，并攪拌均勻，得到黃色乳膏。然后分別制成兩種莪術(shù)醇提取乳膏。每克乳膏相當(dāng)于莪術(shù)生藥1.0g、2.0g，劑量按原生藥g/kg 計(jì)算[1]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分組及制造模型 將48 只大鼠隨機(jī)分成空白對照組、銀屑病組、莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組、莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組，每組12 只。參照魏榮等[2]的研究方法建立銀屑病大鼠模型，將所有大鼠背部中間2cm×4cm 區(qū)域的毛發(fā)全部剔除，然后按照0.05g/cm2的標(biāo)準(zhǔn)將藥膏均勻涂抹至已經(jīng)剔除毛發(fā)的區(qū)域，空白對照組大鼠毛發(fā)剔除區(qū)均勻涂抹凡士林乳膏，銀屑病組、莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組、莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠剃除的毛發(fā)區(qū)域均勻涂抹咪喹莫特乳膏（生產(chǎn)廠家：天方藥業(yè)有限公司；批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20031230），每天1 次，連續(xù)涂抹14 d，使其產(chǎn)生銀屑病皮損樣病理改變。如果在建模過程中大鼠背部的毛發(fā)重新長出，則重復(fù)進(jìn)行剃毛處理[1-3]。

1.3.2 給藥 建模成功后，空白對照組、銀屑病組不作處理，莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組、莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組每天涂抹給藥1 次，以覆蓋創(chuàng)面為宜。

1.3.3 收集標(biāo)本 各組大鼠飼養(yǎng)到既定時間，均以頸椎脫位法處死。將大鼠背部皮膚組織分成2 份，其中一份標(biāo)本在10% 的甲醛溶液中進(jìn)行固定，經(jīng)過修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等操作后制備成石蠟切片，測定大鼠背部皮膚損傷表皮厚度、Baker 病理評分、炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過蘇木素- 伊紅（HE）染色觀察病理組織的病變情況；另一份標(biāo)本置于液氮中冷凍保存，用以后續(xù)的指標(biāo)檢測[4]。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 HE 染色及背部皮膚損傷表皮厚度的檢測 將制備的大鼠背部皮損組織在10% 甲醛溶液中進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟包埋、脫蠟、HE 染色，然后在顯微鏡下觀察大鼠背部皮膚損傷組織的病理學(xué)表現(xiàn)，使用IPP6.0 軟件測量表皮厚度[2,5]。

1.4.2 Baker 病理評分 Baker 病理評分標(biāo)準(zhǔn)：角質(zhì)層：出現(xiàn)小膿瘍：2 分；角化不完全：1 分；過度角化：0.5分。表層：表層中有顆粒細(xì)胞層消失：1 分；棘層肥厚：1 分。真皮層： 毛細(xì)血管擴(kuò)張：1.5 分；出現(xiàn)單一多核細(xì)胞浸潤，根據(jù)嚴(yán)重程度分為重度、中度、輕度，分別計(jì)2 分、1 分、0.5 分[1,6]。

1.4.3 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) Baker 病理評分完成后，使用光學(xué)顯微鏡對大鼠背部皮膚組織進(jìn)行攝片，采用Imagepro-plus6.0 圖像分析系統(tǒng)對所選視野中的炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[1,7]。

1.4.4 背部皮膚組織中白細(xì)胞介素-17（IL-17）、IL-22、IL-23、γ- 干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)水平的檢測 取液氮冷凍保存的皮膚組織，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，將標(biāo)本用胞被液〔 PH9.5，0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液（CB）〕適當(dāng)稀釋至30mL，添加至聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，溫度4℃，反應(yīng)24h。第二日使用洗滌劑洗滌3 次，甩干，在各孔中加入稀釋液（PH7.4，0.02mol/L，Tris-HCI 緩沖液）稀釋的待測標(biāo)本0.1mL，同時加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，置于43℃下1h。液體除去后洗滌3 次，甩干。在各個孔中加入底物液〔 0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4·12H2O35.8 g/L） 〕 5.14 mL、0.05 mol/L 枸櫞酸（10.5 g/L）4.86 mL 混勻，加入鄰苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，臨用時加30%H2O24.0μL，混勻 0.1 mL，黑暗環(huán)境下放置20 min，在各孔中加入 2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值，分析IL-17、IL-22、IL-23 、IFN-γ、TNF-α 的表達(dá)水平[2,8]。

1.4.5 背部皮膚組織IL-6 受體/JAK/STAT3（IL-6R/JAK/STAT3）通路因子mRNA 表達(dá)量檢測 取液氮冷凍保存的大鼠背部皮膚組織，加入 1 mL Trizol 研磨為粉末狀，按照制備試劑盒說明書提取大鼠背部皮膚組織中的總RNA，之后對RNA 純度、含量進(jìn)行檢測，使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得c DNA，之后使用Prim-er5.0 軟件對引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，使用逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測的IL-6R、JAK1、STAT3、CD80、CCL5 mRNA 表達(dá)量[2,9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以Graph Pad Prim 6.0 及SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析作圖，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布者采用t檢驗(yàn)或方差分析，非正態(tài)分布者采用Spearman 秩相關(guān)分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠表皮厚度、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量、Baker評分的比較

由表1 可見，銀屑病組、莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠的表皮厚度、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量、Baker 評分均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述三項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)均明顯高于兩個莪術(shù)醇提物乳膏組。此外，莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述三項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)均明顯低于莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。

表1 各組大鼠表皮厚度、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量、Baker 評分的比較（± s，n=12）

表1 各組大鼠表皮厚度、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量、Baker 評分的比較（± s，n=12）

組別 表皮厚度（μmol） 炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)（個） Baker 病理評分（分）空白對照組 8.31±0.24 31.01±1.23 1.29±0.02銀屑病組 78.12±3.24 98.23±24.14 6.55±1.23莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組 52.21±2.34 62.34±6.20 4.63±1.01莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組 45.23±2.08 52.93±4.23 3.25±1.09 t/P 值 54.231/0.001 25.345/0.001 5.136/0.001

2.2 各組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達(dá)水平的比較

由表2 可見，銀屑病組、莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 的 表 達(dá)水平均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述評價(jià)指標(biāo)均明顯高于兩個莪術(shù)醇提物乳膏組。此外，莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述評價(jià)指標(biāo)均明顯低于莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。

表2 各組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達(dá)水平的比較（pg/g，± s ，n=12）

表2 各組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達(dá)水平的比較（pg/g，± s ，n=12）

組別 IL-17 IL-22 IL-23 IFN-γ TNF-α空白對照組 1.72±0.01 3.12±0.26 5.68±0.25 17.23±4.23 69.02±12.34銀屑病組 2.98±0.27 5.31±0.26 8.23±1.02 38.82±6.82 182.16±20.12莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組 2.56±1.04 4.01±0.59 7.23±0.92 30.32±4.23 140.24±21.01莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組 2.01±0.19 3.31±0.13 6.99±0.78 27.72±4.21 131.01±10.23 t/P 值 1.023/0.001 2.047/0.001 3.245/0.001 13.931/0.001 56.234/0.001

2.3 各組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3通路因子mRNA 表達(dá)水平的比較

由表3 可見，銀屑病組、莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 的表達(dá)水平均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述評價(jià)指標(biāo)均明顯高于兩個莪術(shù)醇提物乳膏組。此外，莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述評價(jià)指標(biāo)均明顯低于莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。

表3 各組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達(dá)水平的比較（± s，n=12）

表3 各組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達(dá)水平的比較（± s，n=12）

組別 IL-6R JAK1 STAT3 CD80 CCL5空白對照組 0.21±0.02 0.15±0.02 0.18±0.02 0.01±0.01 0.34±0.06銀屑病組 0.34±0.12 0.31±0.07 0.31±0.07 0.22±0.04 0.59±0.13莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組 0.31±0.14 0.28±0.02 0.28±0.03 0.18±0.02 0.52±0.17莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組 0.27±0.02 0.24±0.03 0.25±0.01 0.13±0.03 0.46±0.01 t/P 值 0.025/0.001 0.027/0.001 0.019/0.001 0.124/0.001 0.863/0.001

3 討論

銀屑病是在遺傳或環(huán)境等因素的刺激下，由免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，其病程長，易復(fù)發(fā)，難根治。此病患者的臨床表現(xiàn)多以鱗屑、紅斑為主，病變多發(fā)生于頭皮、四肢伸側(cè)，嚴(yán)重影響患者的身心健康。目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制還不明確，但發(fā)病群體多為人類。因此理想的動物模型對研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制及治療方案至為重要。本文通過建立大鼠銀屑病模型，探索莪術(shù)醇提物乳膏對銀屑病皮膚病理改變的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀屑病組、莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠的表皮厚度、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量、Baker 評分、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達(dá)水平、IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達(dá)水平均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述評價(jià)指標(biāo)均明顯高于兩個莪術(shù)醇提物乳膏組。此外，莪術(shù)醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述評價(jià)指標(biāo)均明顯低于莪術(shù)醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，銀屑病典型的組織病理學(xué)表現(xiàn)主要為角化過度或不全，炎癥細(xì)胞浸潤。有研究表明，銀屑病患者的相關(guān)因子，如IL-17A、IL-17F 及IL-23R都是受到STAT3 轉(zhuǎn)錄激活，STAT3 是銀屑病治療中的重要靶點(diǎn)之一[11]。莪術(shù)醇提物乳膏可能通過激活JAK/STAT3 信號傳導(dǎo)通路來發(fā)揮降低相關(guān)炎性因子表達(dá)水平的作用。

綜上所述，莪術(shù)醇提物乳膏對銀屑病皮膚病理改變有明顯改善作用，其作用機(jī)制可能與細(xì)胞因子以及免疫表達(dá)相關(guān)。