陸 腱，李 宏，劉桂連，吳琪琳，華英匯，費(fèi) 翔*，朱美芳

(1.東華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 纖維材料改性國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201600；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，上海 200040)

人工韌帶是韌帶重建手術(shù)中重要的醫(yī)療器械，其市售產(chǎn)品主要由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維編織制成。PET不可生物降解的特性使得PET人工韌帶在植入后會(huì)因材料蠕變、與天然組織應(yīng)力傳遞方式不匹配等原因失效[1-3]，需二次手術(shù)取出。因此，開發(fā)可生物降解纖維組成的人工韌帶成為韌帶修復(fù)器械研究的熱點(diǎn)。

通過熔融紡絲法制備的聚乳酸(PLA)纖維拉伸強(qiáng)度接近PET纖維，同時(shí)可生物降解，有望取代PET纖維成為人工韌帶的基體。從1996年開始，研究者們開始采用PLA纖維制備人工韌帶，并用于動(dòng)物韌帶功能的重建[2, 4-8]。上述工作多通過編織結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)人工韌帶力學(xué)性能和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在纖維材料的功能化方面有待深入研究。作者擬在PLA纖維的熔紡制備過程中，借助熔融加工技術(shù)雜化引入廣泛用于促進(jìn)骨組織修復(fù)的活性物質(zhì)羥基磷灰石(HAp)[9-12]，以增強(qiáng)PLA纖維基人工韌帶與骨細(xì)胞的相容性。首先借助熔融共混將納米級(jí)的HAp分散于PLA，制成與PLA切片尺寸相近的毫米級(jí)雜化樹脂；然后將雜化樹脂與PLA切片復(fù)配進(jìn)行熔融紡絲，制成含有HAp的PLA雜化纖維；最后通過編織技術(shù)將雜化纖維集成為人工韌帶材料；從形貌、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、細(xì)胞相容性方面研究了HAp的引入對(duì)PLA-HAp雜化纖維、人工韌帶的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要原料與試劑

PLA：牌號(hào)FY601，安徽豐原集團(tuán)有限公司產(chǎn)；HAp：針狀，南京埃普瑞納米材料有限公司產(chǎn)；去離子水、無水乙醇：上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)；PBS緩沖液、胰酶細(xì)胞消化液、Calcein-AM試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒：日本Dojindo研究所產(chǎn)；αMEM完全培養(yǎng)基、小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3)：上海中喬新舟生物科技有限公司產(chǎn)。

1.2 主要設(shè)備及儀器

CTE 20-48雙螺桿共混擠出機(jī)：南京科倍隆機(jī)械有限公司制；納米雜化纖維熔紡成形試驗(yàn)專用設(shè)備：上海金緯化纖機(jī)械制造有限公司制；YG086縷紗測(cè)長儀：常州市中纖檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司制；DZF-2018B捻繩機(jī)：東莞德至豐科技有限公司制；DT-01表面等離子處理儀：蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司制；Ni-U光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司制；Hitachi SU8010掃描電子顯微鏡：日本日立公司制；Prodigy-ICP等離子體光譜儀：美國利曼公司制；204F1差示掃描量熱儀：德國耐馳公司制；D/max-2550VB+/PC型X射線衍射儀：日本理學(xué)公司制；YG029全自動(dòng)單紗強(qiáng)力機(jī)：常州市中纖檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司制；INSTRON 5969電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)：美國英斯特朗公司制；熒光顯微鏡：德國Leica公司制。

1.3 PLA-HAp纖維及其人工韌帶的制備

1.3.1 PLA-HAp雜化樹脂的制備

將HAp置于真空烘箱中，于100 ℃下干燥12 h；對(duì)于PLA切片，先將切片置于真空轉(zhuǎn)鼓烘箱中在80 ℃下真空干燥4 h以除去水分，再于100 ℃真空干燥4 h對(duì)PLA進(jìn)行預(yù)結(jié)晶。按一定質(zhì)量比機(jī)械混合干燥后的HAp與PLA切片，借助雙螺桿共混擠出機(jī)進(jìn)行熔融共混、擠出、造粒，制備HAp質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PLA-HAp雜化樹脂。其中，熔融共混工藝如下：雙螺桿共混擠出機(jī)一區(qū)30 ℃、二區(qū)180 ℃、三區(qū)190 ℃、四區(qū)至機(jī)頭210 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速為300 r/min。

1.3.2 PLA-HAp雜化纖維的制備

首先按一定質(zhì)量比機(jī)械混合PLA-HAp雜化樹脂與PLA切片，并采用1.3.1中干燥PLA切片的方法進(jìn)行干燥；然后進(jìn)行熔融紡絲，采用36孔常規(guī)圓形噴絲板制備PLA-HAp初生纖維；再通過自主設(shè)計(jì)的拉伸設(shè)備將初生纖維在60 ℃下進(jìn)行2倍拉伸，然后在100 ℃下熱定型，得到線密度約60 dtex的PLA-HAp雜化纖維。其中，PLA-HAp雜化樹脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、5%、10%、15%(即HAp質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別0、0.5%、1.0%、1.5%)的PLA-HAp纖維試樣分別標(biāo)記為PLA-HAp0、PLA-HAp0.5、PLA-HAp1.0、PLA-HAp1.5。

1.3.3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的制備

PLA-HAp纖維基人工韌帶的制備參考蠶絲基人工韌帶的編織方法[13-15]。采用縷紗測(cè)長儀量取12束長為1 m的PLA-HAp纖維并將其捋成一股，采用捻繩機(jī)以100 圈/min的轉(zhuǎn)速，先對(duì)纖維束順時(shí)針加捻69 s，再在伸直狀態(tài)下對(duì)折纖維束并逆時(shí)針加捻33 s，然后如上對(duì)折并順時(shí)針加捻10～11 s，最后對(duì)其末端進(jìn)行打結(jié)，編織得到PLA-HAp纖維基人工韌帶材料。

將該材料置于100 ℃真空烘箱中處理1 h以消除編織過程中產(chǎn)生的內(nèi)應(yīng)力；再將材料浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇水溶液中以除去纖維中的紡絲油劑；然后將材料在室溫下真空干燥，采用表面等離子處理儀在200 W下處理10 min，以提高材料表面親水性。

1.4 分析與測(cè)試

微觀形貌：采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察雜化樹脂、纖維截面的微觀形貌，其中雜化樹脂的放大倍數(shù)為10 000，纖維截面的放大倍數(shù)為20 000。

元素組成：借助強(qiáng)酸溶解纖維，采用等離子體光譜儀(ICP-OES)測(cè)試PLA-HAp雜化纖維中無機(jī)元素鈣(Ca)、磷(P)的含量。

結(jié)晶結(jié)構(gòu)：采用差示掃描量熱儀對(duì)PLA-HAp雜化纖維進(jìn)行測(cè)試。從40 ℃開始，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃。對(duì)于獲得的差示掃描量熱(DSC)升溫曲線，先分別對(duì)160～180 ℃的結(jié)晶熔融峰和110 ℃附近的冷結(jié)晶峰積分，計(jì)算試樣的結(jié)晶熔融焓(?Hf)與冷結(jié)晶焓(?Hc)，按照式(1)計(jì)算試樣的結(jié)晶度(Xc)。

Xc=(?Hf-?Hc)/93.0 ×100%

(1)

取向結(jié)構(gòu)：將多束纖維制成單絲平行排列、長度為10 cm以上的試樣，固定于X射線衍射儀靶臺(tái)進(jìn)行測(cè)試，對(duì)獲得的X射線衍射(XRD)曲線進(jìn)行積分分析，計(jì)算半高寬之和(HFWHM)，然后通過式(2)計(jì)算試樣的結(jié)晶擇優(yōu)取向度。

f=(360-HFWHM)/360 ×100%

(2)

式中：f為取向因子，f為100%時(shí)說明材料各向異性，f為0時(shí)說明材料各向同性。

力學(xué)性能：采用全自動(dòng)單紗強(qiáng)力機(jī)對(duì)PLA-HAp纖維進(jìn)行測(cè)試，夾持距離為500 mm，拉伸速度為500 mm/min；采用電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)PLA-HAp纖維基人工韌帶進(jìn)行測(cè)試，夾持距離為30 mm，拉伸速度為15 mm/min。

骨細(xì)胞活性：將MC3T3細(xì)胞種植于裝有滅菌人工韌帶材料的24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基用量為0.5 mL/孔，細(xì)胞種植密度為5×104個(gè)/孔；然后分別在培養(yǎng)1，3，5 d后將人工韌帶材料取出置于空白24孔板，借助CCK8試劑盒對(duì)材料上存活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行測(cè)試，試樣中活細(xì)胞數(shù)量采用酶標(biāo)儀測(cè)得的活細(xì)胞指示物強(qiáng)度(OD值)來表征，所有試樣均平行重復(fù)測(cè)試不少于3次。

骨細(xì)胞形態(tài)：采用鈣黃綠素(Calcein-AM)試劑盒對(duì)人工韌帶材料上的骨細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色，細(xì)胞形態(tài)通過熒光顯微鏡觀測(cè)骨細(xì)胞在人工韌帶材料的存活情況。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用Origin 8.5軟件中的單因素方差分析進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，選擇0.05作為顯著性水平值。顯著性差異水平(p)標(biāo)記如下：p小于0.05為*，p小于0.01為**，p小于0.001為***。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLA-HAp雜化樹脂及纖維的微觀形貌

從圖1a中可發(fā)現(xiàn)，PLA-HAp雜化樹脂有明顯區(qū)別于周邊基體的白色顆粒，這些顆粒與HAp納米粒子尺寸相近，可推斷為分散于PLA中的HAp納米粒子，且HAp在樹脂中分布較均勻，將該雜化樹脂用于熔融紡絲可實(shí)現(xiàn)HAp均勻分散于纖維中，但與PLA基體邊界較清晰，即兩者相容性不是很好，可能會(huì)影響纖維的加工和性能。從圖1b和圖1c可看出：相對(duì)于PLA-HAp0的截面，PLA-HAp1.0的截面中可以觀測(cè)到納米級(jí)的粒子聚集體，這證實(shí)了納米HAp在PLA纖維中的有效負(fù)載；同時(shí)，PLA-HAp纖維中的納米聚集體結(jié)構(gòu)與周圍的PLA存在明顯的邊界，可能會(huì)成為纖維受力時(shí)的應(yīng)力集中點(diǎn)，導(dǎo)致纖維更易破壞。

圖1 PLA-HAp樹脂及纖維的微觀形貌

2.2 PLA-HAp雜化材料的熔融紡絲工藝

將PLA-HAp雜化樹脂與PLA切片按一定比例混合，再進(jìn)行熔融紡絲，以制備雜化纖維及梯度調(diào)控纖維中HAp含量。從表1可知，在熔融紡絲過程中，PLA-HAp1.5的紡絲成形溫度高于HAp含量更低的其他試樣，這是因?yàn)殡S著PLA-HAp體系中與PLA相容性差的HAp含量增大，體系流變性能會(huì)變差，需提升溫度改善熔體流動(dòng)速率以滿足成纖加工需求。

表1 PLA-HAp纖維的熔融紡絲工藝參數(shù)

2.3 HAp含量對(duì)PLA-HAp纖維結(jié)構(gòu)與性能的影響

相對(duì)于PLA，HAp含有Ca、P兩種元素，采用ICP-OES測(cè)試?yán)w維中的Ca、P元素含量以表征HAp負(fù)載量。從表2可知：隨著HAp添加量增加，雜化纖維中Ca、P元素含量梯度上升，與預(yù)期一致；纖維斷裂強(qiáng)度都大于3 cN/dtex，滿足編織加工的需求；隨著HAp的加入，纖維的斷裂強(qiáng)度由3.87 cN/dtex降低至3.16 cN/dtex，斷裂伸長率也由28.2%降低至25.9%，這歸因于HAp與PLA的相容性較差，在受力時(shí)易使纖維內(nèi)部形成缺陷導(dǎo)致斷裂。

表2 PLA-HAp纖維的結(jié)構(gòu)與性能

對(duì)于聚合物纖維材料，聚集態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)其力學(xué)性能有著重要的影響。從各纖維試樣的DSC曲線(圖2a)可以看出，在110 ℃附近均無結(jié)晶峰，在160～180 ℃均有結(jié)晶熔融峰，說明纖維經(jīng)拉伸后均已結(jié)晶完善。從表2也可知，纖維的Xc隨著加入HAp含量的增加而增大，這是因?yàn)镻LA是半結(jié)晶聚合物，HAp的納米尺度結(jié)構(gòu)可以誘導(dǎo)PLA異相成核，加速結(jié)晶，Xc由47.1%提升至49.1%及以上。對(duì)于纖維的取向結(jié)構(gòu)，從圖2b和表2可知，隨著PLA-HAp纖維中HAp含量升高，纖維的f先增大后減小，這是因?yàn)镠Ap呈針狀，其作為PLA的成核劑利于PLA沿取向方向結(jié)晶，因此纖維引入HAp后，晶區(qū)f由93.1%提升至96.1%；但HAp含量過多時(shí)，會(huì)阻礙晶區(qū)的取向運(yùn)動(dòng)，因此PLA-HAp纖維的f會(huì)隨HAp含量的增加而降低，從96.1%降低至93.7%。

圖2 PLA-HAp纖維試樣的DSC曲線和XRD曲線

2.4 PLA-HAp纖維基人工韌帶的形貌與力學(xué)性能

通過SEM分析PLA-HAp纖維基人工韌帶的微觀形貌，如圖3所示，由于各纖維試樣的線密度相近、截面形狀相同，PLA-HAp纖維基人工韌帶在徑向尺寸上差異較小，直徑均為1 mm左右。

圖3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的SEM照片

從表3可知：各PLA-HAp纖維試樣所制人工韌帶的拉伸強(qiáng)度都在87 MPa以上，約為人體前交叉韌帶(38.70 MPa[16])的2.2倍，可用于重建前交叉韌帶功能；負(fù)載有HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶在直徑上較細(xì)；含有HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶具有較低的最大載荷和斷裂伸長率；由于直徑上的差異，在拉伸強(qiáng)度方面，含HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶與純PLA纖維基人工韌帶差異較小。

表3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的直徑和力學(xué)性能

2.5 PLA-HAp纖維基人工韌帶的骨細(xì)胞活性

采用MC3T3骨細(xì)胞來研究PLA-HAp纖維基人工韌帶對(duì)骨細(xì)胞性能的影響。從圖4可知，種植在人工韌帶上的MC3T3細(xì)胞，其細(xì)胞活性隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長而增大。其中，共培養(yǎng)1 d后各組韌帶上的活細(xì)胞數(shù)量無明顯差異；此后，含HAp的纖維基人工韌帶上的細(xì)胞活性開始明顯高于無HAp的PLA-HAp0人工韌帶，尤其是HAp負(fù)載量最高的PLA-HAp1.5人工韌帶，其在培養(yǎng)3，5 d后與PLA-HAp組都表現(xiàn)出顯著性差異(3 d后p小于0.001，5 d后p小于0.01)。上述CCK8測(cè)試結(jié)果表明了HAp的引入可有效改善PLA纖維基人工韌帶與MC3T3細(xì)胞的相容性。

圖4 PLA-HAp纖維基人工韌帶與骨細(xì)胞相容性的CCK8表征

基于上述分析，以無HAp的PLA-HAp0人工韌帶和HAp負(fù)載量最高的PLA-HAp1.5人工韌帶為研究對(duì)象，研究HAp的負(fù)載對(duì)人工韌帶骨細(xì)胞活性的影響。借助Calcein-AM對(duì)韌帶上存活的骨細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。從圖5可以看出：在共培養(yǎng)1 d后，PLA-HAp0和PLA-HAp1.5兩組人工韌帶上都黏附著少量Calcein-AM標(biāo)記的活細(xì)胞(圖5a和圖5d)；隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，被標(biāo)記活細(xì)胞的數(shù)量開始增多，且PLA-HAp1.5人工韌帶上細(xì)胞數(shù)量多于PLA-HAp0人工韌帶上細(xì)胞數(shù)量(圖5 b和圖5e, 圖5c和圖5f)，這與上述CCK8測(cè)試的結(jié)果相一致。

圖5 PLA-HAp纖維基人工韌帶上骨細(xì)胞的Calcein-AM染色圖示意

從圖6可以看出：人工韌帶上細(xì)胞外基質(zhì)和黏附細(xì)胞隨共培養(yǎng)時(shí)間而增加；培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞黏附于人工韌帶的組成纖維上，同時(shí)大部分纖維還可看出原有輪廓(圖6a和圖6d所示)；培養(yǎng)3 d后，隨著細(xì)胞在人工韌帶上的增殖、遷移，人工韌帶上部分纖維的輪廓隨黏附細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生改變，其中PLA-HAp1.5人工韌帶上纖維開始被細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)黏結(jié)(圖6b和圖6e所示)；培養(yǎng)5 d后，在PLA-HAp1.5人工韌帶中，開始有部分纖維上黏附的細(xì)胞發(fā)生匯聚，形成2～4倍纖維直徑的聚集體(圖6c和圖6f所示)。因此，上述SEM圖像表明了MC3T3細(xì)胞在PLA-HAp1.5人工韌帶上的生長速度快于PLA-HAp0人工韌帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了人工韌帶中HAp的加入對(duì)MC3T3細(xì)胞增殖行為的促進(jìn)作用；同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的發(fā)展和細(xì)胞的生長都是沿著纖維方向進(jìn)行的，而人工韌帶中的纖維主要是沿韌帶軸向方向排布的，因此該纖維組成的人工韌帶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)細(xì)胞沿韌帶軸向取向生長，利于重構(gòu)結(jié)構(gòu)上沿韌帶軸向取向的韌帶組織。

圖6 PLA-HAp纖維基人工韌帶上骨細(xì)胞的SEM照片

綜上所述，HAp的負(fù)載有效提高了PLA纖維基人工韌帶的骨細(xì)胞活性，有利于骨細(xì)胞在材料表面的增殖，可加速人工韌帶與周圍骨組織的整合。

3 結(jié)論

a.通過熔融共混技術(shù)將納米HAp均勻分散于PLA樹脂中，再與尺寸相近的PLA切片復(fù)配混合，經(jīng)熔融紡絲獲得斷裂強(qiáng)度高達(dá)3.16～3.27 cN/dtex的PLA-HAp雜化纖維。在聚集態(tài)結(jié)構(gòu)方面，HAp的加入可提高PLA纖維的結(jié)晶度和取向度，但其與PLA相容性較差，使得纖維在受力條件下易因結(jié)構(gòu)缺陷導(dǎo)致斷裂，以致整體的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率稍低。

b.將PLA-HAp雜化纖維編織成人工韌帶，PLA-HAp纖維基人工韌帶的拉伸強(qiáng)度達(dá)87.1～94.2 MPa，滿足重建韌帶功能的需求。

c.在生物功能方面，HAp的加入可有效在人工韌帶表面引入Ca、P元素，從而顯著提升人工韌帶與骨細(xì)胞(MC3T3)的相容性，證實(shí)了通過負(fù)載HAp提高PLA纖維基人工韌帶骨細(xì)胞活性的有效性。