陸 腱，李 宏，劉桂連，吳琪琳，華英匯，費 翔*，朱美芳

(1.東華大學 材料科學與工程學院 纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201600；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學科，上海 200040)

人工韌帶是韌帶重建手術(shù)中重要的醫(yī)療器械，其市售產(chǎn)品主要由聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維編織制成。PET不可生物降解的特性使得PET人工韌帶在植入后會因材料蠕變、與天然組織應力傳遞方式不匹配等原因失效[1-3]，需二次手術(shù)取出。因此，開發(fā)可生物降解纖維組成的人工韌帶成為韌帶修復器械研究的熱點。

通過熔融紡絲法制備的聚乳酸(PLA)纖維拉伸強度接近PET纖維，同時可生物降解，有望取代PET纖維成為人工韌帶的基體。從1996年開始，研究者們開始采用PLA纖維制備人工韌帶，并用于動物韌帶功能的重建[2, 4-8]。上述工作多通過編織結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)人工韌帶力學性能和拓撲結(jié)構(gòu)，在纖維材料的功能化方面有待深入研究。作者擬在PLA纖維的熔紡制備過程中，借助熔融加工技術(shù)雜化引入廣泛用于促進骨組織修復的活性物質(zhì)羥基磷灰石(HAp)[9-12]，以增強PLA纖維基人工韌帶與骨細胞的相容性。首先借助熔融共混將納米級的HAp分散于PLA，制成與PLA切片尺寸相近的毫米級雜化樹脂；然后將雜化樹脂與PLA切片復配進行熔融紡絲，制成含有HAp的PLA雜化纖維；最后通過編織技術(shù)將雜化纖維集成為人工韌帶材料；從形貌、結(jié)構(gòu)、力學性能、細胞相容性方面研究了HAp的引入對PLA-HAp雜化纖維、人工韌帶的影響。

1 實驗

1.1 主要原料與試劑

PLA：牌號FY601，安徽豐原集團有限公司產(chǎn)；HAp：針狀，南京埃普瑞納米材料有限公司產(chǎn)；去離子水、無水乙醇：上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)；PBS緩沖液、胰酶細胞消化液、Calcein-AM試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；CCK8細胞計數(shù)試劑盒：日本Dojindo研究所產(chǎn)；αMEM完全培養(yǎng)基、小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3)：上海中喬新舟生物科技有限公司產(chǎn)。

1.2 主要設(shè)備及儀器

CTE 20-48雙螺桿共混擠出機：南京科倍隆機械有限公司制；納米雜化纖維熔紡成形試驗專用設(shè)備：上海金緯化纖機械制造有限公司制；YG086縷紗測長儀：常州市中纖檢測儀器設(shè)備有限公司制；DZF-2018B捻繩機：東莞德至豐科技有限公司制；DT-01表面等離子處理儀：蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司制；Ni-U光學顯微鏡：日本尼康公司制；Hitachi SU8010掃描電子顯微鏡：日本日立公司制；Prodigy-ICP等離子體光譜儀：美國利曼公司制；204F1差示掃描量熱儀：德國耐馳公司制；D/max-2550VB+/PC型X射線衍射儀：日本理學公司制；YG029全自動單紗強力機：常州市中纖檢測儀器設(shè)備有限公司制；INSTRON 5969電子萬能材料試驗機：美國英斯特朗公司制；熒光顯微鏡：德國Leica公司制。

1.3 PLA-HAp纖維及其人工韌帶的制備

1.3.1 PLA-HAp雜化樹脂的制備

將HAp置于真空烘箱中，于100 ℃下干燥12 h；對于PLA切片，先將切片置于真空轉(zhuǎn)鼓烘箱中在80 ℃下真空干燥4 h以除去水分，再于100 ℃真空干燥4 h對PLA進行預結(jié)晶。按一定質(zhì)量比機械混合干燥后的HAp與PLA切片，借助雙螺桿共混擠出機進行熔融共混、擠出、造粒，制備HAp質(zhì)量分數(shù)為10%的PLA-HAp雜化樹脂。其中，熔融共混工藝如下：雙螺桿共混擠出機一區(qū)30 ℃、二區(qū)180 ℃、三區(qū)190 ℃、四區(qū)至機頭210 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速為300 r/min。

1.3.2 PLA-HAp雜化纖維的制備

首先按一定質(zhì)量比機械混合PLA-HAp雜化樹脂與PLA切片，并采用1.3.1中干燥PLA切片的方法進行干燥；然后進行熔融紡絲，采用36孔常規(guī)圓形噴絲板制備PLA-HAp初生纖維；再通過自主設(shè)計的拉伸設(shè)備將初生纖維在60 ℃下進行2倍拉伸，然后在100 ℃下熱定型，得到線密度約60 dtex的PLA-HAp雜化纖維。其中，PLA-HAp雜化樹脂質(zhì)量分數(shù)為0、5%、10%、15%(即HAp質(zhì)量分數(shù)分別0、0.5%、1.0%、1.5%)的PLA-HAp纖維試樣分別標記為PLA-HAp0、PLA-HAp0.5、PLA-HAp1.0、PLA-HAp1.5。

1.3.3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的制備

PLA-HAp纖維基人工韌帶的制備參考蠶絲基人工韌帶的編織方法[13-15]。采用縷紗測長儀量取12束長為1 m的PLA-HAp纖維并將其捋成一股，采用捻繩機以100 圈/min的轉(zhuǎn)速，先對纖維束順時針加捻69 s，再在伸直狀態(tài)下對折纖維束并逆時針加捻33 s，然后如上對折并順時針加捻10～11 s，最后對其末端進行打結(jié)，編織得到PLA-HAp纖維基人工韌帶材料。

將該材料置于100 ℃真空烘箱中處理1 h以消除編織過程中產(chǎn)生的內(nèi)應力；再將材料浸泡于體積分數(shù)75%的乙醇水溶液中以除去纖維中的紡絲油劑；然后將材料在室溫下真空干燥，采用表面等離子處理儀在200 W下處理10 min，以提高材料表面親水性。

1.4 分析與測試

微觀形貌：采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察雜化樹脂、纖維截面的微觀形貌，其中雜化樹脂的放大倍數(shù)為10 000，纖維截面的放大倍數(shù)為20 000。

元素組成：借助強酸溶解纖維，采用等離子體光譜儀(ICP-OES)測試PLA-HAp雜化纖維中無機元素鈣(Ca)、磷(P)的含量。

結(jié)晶結(jié)構(gòu)：采用差示掃描量熱儀對PLA-HAp雜化纖維進行測試。從40 ℃開始，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃。對于獲得的差示掃描量熱(DSC)升溫曲線，先分別對160～180 ℃的結(jié)晶熔融峰和110 ℃附近的冷結(jié)晶峰積分，計算試樣的結(jié)晶熔融焓(?Hf)與冷結(jié)晶焓(?Hc)，按照式(1)計算試樣的結(jié)晶度(Xc)。

Xc=(?Hf-?Hc)/93.0 ×100%

(1)

取向結(jié)構(gòu)：將多束纖維制成單絲平行排列、長度為10 cm以上的試樣，固定于X射線衍射儀靶臺進行測試，對獲得的X射線衍射(XRD)曲線進行積分分析，計算半高寬之和(HFWHM)，然后通過式(2)計算試樣的結(jié)晶擇優(yōu)取向度。

f=(360-HFWHM)/360 ×100%

(2)

式中：f為取向因子，f為100%時說明材料各向異性，f為0時說明材料各向同性。

力學性能：采用全自動單紗強力機對PLA-HAp纖維進行測試，夾持距離為500 mm，拉伸速度為500 mm/min；采用電子萬能材料試驗機對PLA-HAp纖維基人工韌帶進行測試，夾持距離為30 mm，拉伸速度為15 mm/min。

骨細胞活性：將MC3T3細胞種植于裝有滅菌人工韌帶材料的24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基用量為0.5 mL/孔，細胞種植密度為5×104個/孔；然后分別在培養(yǎng)1，3，5 d后將人工韌帶材料取出置于空白24孔板，借助CCK8試劑盒對材料上存活細胞數(shù)量進行測試，試樣中活細胞數(shù)量采用酶標儀測得的活細胞指示物強度(OD值)來表征，所有試樣均平行重復測試不少于3次。

骨細胞形態(tài)：采用鈣黃綠素(Calcein-AM)試劑盒對人工韌帶材料上的骨細胞進行活細胞染色，細胞形態(tài)通過熒光顯微鏡觀測骨細胞在人工韌帶材料的存活情況。

細胞實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析：使用Origin 8.5軟件中的單因素方差分析進行試驗數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，選擇0.05作為顯著性水平值。顯著性差異水平(p)標記如下：p小于0.05為*，p小于0.01為**，p小于0.001為***。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLA-HAp雜化樹脂及纖維的微觀形貌

從圖1a中可發(fā)現(xiàn)，PLA-HAp雜化樹脂有明顯區(qū)別于周邊基體的白色顆粒，這些顆粒與HAp納米粒子尺寸相近，可推斷為分散于PLA中的HAp納米粒子，且HAp在樹脂中分布較均勻，將該雜化樹脂用于熔融紡絲可實現(xiàn)HAp均勻分散于纖維中，但與PLA基體邊界較清晰，即兩者相容性不是很好，可能會影響纖維的加工和性能。從圖1b和圖1c可看出：相對于PLA-HAp0的截面，PLA-HAp1.0的截面中可以觀測到納米級的粒子聚集體，這證實了納米HAp在PLA纖維中的有效負載；同時，PLA-HAp纖維中的納米聚集體結(jié)構(gòu)與周圍的PLA存在明顯的邊界，可能會成為纖維受力時的應力集中點，導致纖維更易破壞。

圖1 PLA-HAp樹脂及纖維的微觀形貌

2.2 PLA-HAp雜化材料的熔融紡絲工藝

將PLA-HAp雜化樹脂與PLA切片按一定比例混合，再進行熔融紡絲，以制備雜化纖維及梯度調(diào)控纖維中HAp含量。從表1可知，在熔融紡絲過程中，PLA-HAp1.5的紡絲成形溫度高于HAp含量更低的其他試樣，這是因為隨著PLA-HAp體系中與PLA相容性差的HAp含量增大，體系流變性能會變差，需提升溫度改善熔體流動速率以滿足成纖加工需求。

表1 PLA-HAp纖維的熔融紡絲工藝參數(shù)

2.3 HAp含量對PLA-HAp纖維結(jié)構(gòu)與性能的影響

相對于PLA，HAp含有Ca、P兩種元素，采用ICP-OES測試纖維中的Ca、P元素含量以表征HAp負載量。從表2可知：隨著HAp添加量增加，雜化纖維中Ca、P元素含量梯度上升，與預期一致；纖維斷裂強度都大于3 cN/dtex，滿足編織加工的需求；隨著HAp的加入，纖維的斷裂強度由3.87 cN/dtex降低至3.16 cN/dtex，斷裂伸長率也由28.2%降低至25.9%，這歸因于HAp與PLA的相容性較差，在受力時易使纖維內(nèi)部形成缺陷導致斷裂。

表2 PLA-HAp纖維的結(jié)構(gòu)與性能

對于聚合物纖維材料，聚集態(tài)結(jié)構(gòu)對其力學性能有著重要的影響。從各纖維試樣的DSC曲線(圖2a)可以看出，在110 ℃附近均無結(jié)晶峰，在160～180 ℃均有結(jié)晶熔融峰，說明纖維經(jīng)拉伸后均已結(jié)晶完善。從表2也可知，纖維的Xc隨著加入HAp含量的增加而增大，這是因為PLA是半結(jié)晶聚合物，HAp的納米尺度結(jié)構(gòu)可以誘導PLA異相成核，加速結(jié)晶，Xc由47.1%提升至49.1%及以上。對于纖維的取向結(jié)構(gòu)，從圖2b和表2可知，隨著PLA-HAp纖維中HAp含量升高，纖維的f先增大后減小，這是因為HAp呈針狀，其作為PLA的成核劑利于PLA沿取向方向結(jié)晶，因此纖維引入HAp后，晶區(qū)f由93.1%提升至96.1%；但HAp含量過多時，會阻礙晶區(qū)的取向運動，因此PLA-HAp纖維的f會隨HAp含量的增加而降低，從96.1%降低至93.7%。

圖2 PLA-HAp纖維試樣的DSC曲線和XRD曲線

2.4 PLA-HAp纖維基人工韌帶的形貌與力學性能

通過SEM分析PLA-HAp纖維基人工韌帶的微觀形貌，如圖3所示，由于各纖維試樣的線密度相近、截面形狀相同，PLA-HAp纖維基人工韌帶在徑向尺寸上差異較小，直徑均為1 mm左右。

圖3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的SEM照片

從表3可知：各PLA-HAp纖維試樣所制人工韌帶的拉伸強度都在87 MPa以上，約為人體前交叉韌帶(38.70 MPa[16])的2.2倍，可用于重建前交叉韌帶功能；負載有HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶在直徑上較細；含有HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶具有較低的最大載荷和斷裂伸長率；由于直徑上的差異，在拉伸強度方面，含HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶與純PLA纖維基人工韌帶差異較小。

表3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的直徑和力學性能

2.5 PLA-HAp纖維基人工韌帶的骨細胞活性

采用MC3T3骨細胞來研究PLA-HAp纖維基人工韌帶對骨細胞性能的影響。從圖4可知，種植在人工韌帶上的MC3T3細胞，其細胞活性隨共培養(yǎng)時間的延長而增大。其中，共培養(yǎng)1 d后各組韌帶上的活細胞數(shù)量無明顯差異；此后，含HAp的纖維基人工韌帶上的細胞活性開始明顯高于無HAp的PLA-HAp0人工韌帶，尤其是HAp負載量最高的PLA-HAp1.5人工韌帶，其在培養(yǎng)3，5 d后與PLA-HAp組都表現(xiàn)出顯著性差異(3 d后p小于0.001，5 d后p小于0.01)。上述CCK8測試結(jié)果表明了HAp的引入可有效改善PLA纖維基人工韌帶與MC3T3細胞的相容性。

圖4 PLA-HAp纖維基人工韌帶與骨細胞相容性的CCK8表征

基于上述分析，以無HAp的PLA-HAp0人工韌帶和HAp負載量最高的PLA-HAp1.5人工韌帶為研究對象，研究HAp的負載對人工韌帶骨細胞活性的影響。借助Calcein-AM對韌帶上存活的骨細胞進行染色，并通過熒光顯微鏡進行觀測。從圖5可以看出：在共培養(yǎng)1 d后，PLA-HAp0和PLA-HAp1.5兩組人工韌帶上都黏附著少量Calcein-AM標記的活細胞(圖5a和圖5d)；隨著共培養(yǎng)時間的延長，被標記活細胞的數(shù)量開始增多，且PLA-HAp1.5人工韌帶上細胞數(shù)量多于PLA-HAp0人工韌帶上細胞數(shù)量(圖5 b和圖5e, 圖5c和圖5f)，這與上述CCK8測試的結(jié)果相一致。

圖5 PLA-HAp纖維基人工韌帶上骨細胞的Calcein-AM染色圖示意

從圖6可以看出：人工韌帶上細胞外基質(zhì)和黏附細胞隨共培養(yǎng)時間而增加；培養(yǎng)1 d后，細胞黏附于人工韌帶的組成纖維上，同時大部分纖維還可看出原有輪廓(圖6a和圖6d所示)；培養(yǎng)3 d后，隨著細胞在人工韌帶上的增殖、遷移，人工韌帶上部分纖維的輪廓隨黏附細胞及細胞外基質(zhì)發(fā)生改變，其中PLA-HAp1.5人工韌帶上纖維開始被細胞和細胞外基質(zhì)黏結(jié)(圖6b和圖6e所示)；培養(yǎng)5 d后，在PLA-HAp1.5人工韌帶中，開始有部分纖維上黏附的細胞發(fā)生匯聚，形成2～4倍纖維直徑的聚集體(圖6c和圖6f所示)。因此，上述SEM圖像表明了MC3T3細胞在PLA-HAp1.5人工韌帶上的生長速度快于PLA-HAp0人工韌帶，進一步驗證了人工韌帶中HAp的加入對MC3T3細胞增殖行為的促進作用；同時細胞外基質(zhì)的發(fā)展和細胞的生長都是沿著纖維方向進行的，而人工韌帶中的纖維主要是沿韌帶軸向方向排布的，因此該纖維組成的人工韌帶拓撲結(jié)構(gòu)可誘導細胞沿韌帶軸向取向生長，利于重構(gòu)結(jié)構(gòu)上沿韌帶軸向取向的韌帶組織。

圖6 PLA-HAp纖維基人工韌帶上骨細胞的SEM照片

綜上所述，HAp的負載有效提高了PLA纖維基人工韌帶的骨細胞活性，有利于骨細胞在材料表面的增殖，可加速人工韌帶與周圍骨組織的整合。

3 結(jié)論

a.通過熔融共混技術(shù)將納米HAp均勻分散于PLA樹脂中，再與尺寸相近的PLA切片復配混合，經(jīng)熔融紡絲獲得斷裂強度高達3.16～3.27 cN/dtex的PLA-HAp雜化纖維。在聚集態(tài)結(jié)構(gòu)方面，HAp的加入可提高PLA纖維的結(jié)晶度和取向度，但其與PLA相容性較差，使得纖維在受力條件下易因結(jié)構(gòu)缺陷導致斷裂，以致整體的斷裂強度和斷裂伸長率稍低。

b.將PLA-HAp雜化纖維編織成人工韌帶，PLA-HAp纖維基人工韌帶的拉伸強度達87.1～94.2 MPa，滿足重建韌帶功能的需求。

c.在生物功能方面，HAp的加入可有效在人工韌帶表面引入Ca、P元素，從而顯著提升人工韌帶與骨細胞(MC3T3)的相容性，證實了通過負載HAp提高PLA纖維基人工韌帶骨細胞活性的有效性。