張 強, 王冬偉,2, 蔣建功, 劉雪科,劉東暉*,, 周志強

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，北京 100193；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

食品安全與人類健康息息相關(guān)，受到全世界廣泛關(guān)注[1-2]。農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致其在環(huán)境與農(nóng)作物中多有檢出，所造成的農(nóng)藥殘留問題不容忽視[3]。草甘膦是一種有機膦類除草劑，具有非選擇性和廣譜特性，作為世界上生產(chǎn)和使用最多的除草劑之一[4-6]，在130 多個國家和100 多種作物中生產(chǎn)使用。然而，草甘膦的大量使用帶來了環(huán)境問題，在許多國家的地表水中有所檢出[7-8]。同時，有研究表明，土壤和飲用水中存在的草甘膦殘留會對人體健康造成影響[9-10]，可使乙酰膽堿酯酶不可逆失活，產(chǎn)生各種健康風(fēng)險，如呼吸、心肌和神經(jīng)肌肉功能障礙[4,11-12]。

由于草甘膦會給環(huán)境與人類健康帶來潛在風(fēng)險，因而研究其準確快速的檢測方法顯得十分必要。目前，包括高效液相色譜法 (HPLC)[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC-MS)[14]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[5]、離子色譜 (IC)[15]、毛細管電泳(CE)[16]和酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)[17-18]在內(nèi)的多種方法在草甘膦的檢測中有所應(yīng)用。盡管這些方法可以實現(xiàn)草甘膦的準確檢測，但也存在局限之處，例如樣品預(yù)處理費時費力、實驗成本高等[11]，無法滿足原位、實時、快速檢測的需要。在使用GC-MS 檢測草甘膦時，還需要加入三氟乙酸酐-七氟丁醇等衍生化試劑與其反應(yīng)才能進行檢測[14]。因此，迫切需要開發(fā)出簡單、快速的草甘膦檢測方法。雖然靈敏度高、儀器簡單、操作方便的熒光分析法可以較好地解決這一問題，然而，由于草甘膦分子中缺乏發(fā)色團和熒光團，從而限制了草甘膦熒光傳感器的發(fā)展與應(yīng)用[5]。

鑭系元素離子，因具有特殊的電子結(jié)構(gòu)而具備優(yōu)異的光學(xué)性能[19]。當(dāng)其處于溶劑中時，其發(fā)光會受到溶劑影響被猝滅[20-21]。為提高鑭系元素離子的發(fā)光穩(wěn)定性，可引入配體與其自組裝形成鑭系配位聚合物[22-23]。其中，有機配體常用于鑭系金屬配位聚合物的合成，通過天線效應(yīng)增強鑭系金屬離子的熒光。Ma 等通過兩步反應(yīng)，用時5 d 合成出了三羧酸酯官能化環(huán)三萜配體，該配體可與鑭系金屬離子形成配位聚合物，通過天線效應(yīng)增強鑭系金屬離子熒光[24]。與有機配體相比，小分子配體簡單易得，合成方法簡單，商品化試劑價格低廉、即買即用，且在水溶液中通過簡單的自組裝便可與鑭系金屬離子配位形成聚合物，省時省力，同時避免了實驗過程中有機溶劑的使用。Qu 等以2,6-吡啶二羧酸 (DPA) 和鳥苷酸 (GMP)為配體，與Eu3+和Tb3+形成配位聚合物網(wǎng)絡(luò) (CPNs)，實現(xiàn)了對草甘膦的熒光檢測[25]。焦磷酸根離子(PPi) 是堿性磷酸酶的底物之一，具有較強的螯合能力[26]。有研究表明，與單磷酸根離子和磷酸生物分子 (如ATP) 相比，只有焦磷酸根離子 (PPi)可以與鈰離子 (Ce3+) 配位提高其熒光強度。如圖1所示：通過配體場效應(yīng)，使得 2d5/2和 2d3/2激發(fā)態(tài)能量差增加，導(dǎo)致 2f5/2和 2d3/2之間的能量差減小，2f5/2和 2d5/2之間的能量差增加，從而促進了電偶極子向低激發(fā)態(tài) (2d3/2) 的躍遷，而電偶極子到高激發(fā)態(tài) (2d5/2) 的躍遷受阻。因此，從 2d5/2到2d3/2的非輻射躍遷的能量損失減少，相應(yīng)地從2d3/2到基態(tài) (2f7/2和 2f5/2) 的輻射躍遷增加，從而顯著增強 Ce3+的熒光[27]，合成出的Ce-PPi CPNs 具備優(yōu)異的熒光性質(zhì)。

圖1 Ce3+與Ce-PPi CPNs 能級和能量轉(zhuǎn)移過程示意圖[27]Fig. 1 Schematic diagram of energy levels and energy transfer process of Ce3+ and Ce-PPi CPNs[27]

本研究基于Ce3+與PPi 之間的配位作用，自組裝合成出Ce-PPi CPNs，并通過熒光光譜、掃描電子顯微鏡 (SEM) 和X 射線光電子能譜 (XPS) 對其結(jié)構(gòu)及性能進行表征。草甘膦可與Ce3+配位，干擾 Ce3+和PPi 之間的配體場效應(yīng)，導(dǎo)致Ce-PPi CPNs 的熒光強度降低，檢測示意圖如圖2 所示。該方法還可用于自來水和蘋果樣品中草甘膦的檢測，具備實際應(yīng)用的潛力。

圖2 Ce-PPi CPNs 用于草甘膦熒光檢測示意圖Fig. 2 Principle of the fluorometric glyphosate assay based on Ce-PPi CPNs

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥劑與儀器

硝酸鈰六水合物 ( (Ce(NO3)3· 6H2O，99.5%)，購自易恩 (上海) 化學(xué)技術(shù)有限公司；焦磷酸鈉(99%)、磷酸 (分析純) 和葡萄糖 (99%)，購自麥克林 (上海) 生化科技有限公司；實驗用水均為Milli-Q 超純水。草甘膦 (glyphosate) 標準品 (99.5%)、甘氨酸 (99%)、抗壞血酸 (99%)，購自阿拉丁 (上海) 生化科技有限公司。毒死蜱 (chlorpyrifos，95%)、滅多威 (methomyl，92%)、莠去津 (atrazine，94%)、異丙甲草胺 (metolachlor，95%)、戊唑醇(tebuconazole，93%)、嘧菌酯 (azoxystrobin，93%)、馬拉硫磷 (malathion，92%)、殺螟硫磷(fenitrothion，94%)、草銨膦 (glufosinate ammonium，95%)、辛硫磷 (phoxim，91%)、乙酰甲胺磷 (acephate，93%)和百草枯 (paraquat，90%)原藥，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系農(nóng)藥綜合分析室提供。N-丙基乙二胺 (PSA)，購自吳橋 (河北)津楊過濾器材廠。磷酸鹽緩沖液 (PBS，0.1 mol/L，pH=7.4)，購自索萊寶 (北京) 科技有限公司。其余試劑均為分析純，購自國藥集團 (上海) 化學(xué)試劑有限公司。

RF-6000 熒光分光光度計 (日本Shimadzu 公司)；UV2600 紫外可見 (UV-Vis) 分光光度計 (日本Shimadzu 公司)；SU8020 場發(fā)射掃描電子顯微鏡 (日本Hitachi 公司)；Escalab 250Xi X 射線光電子能譜儀 (美國Thermo Scientific 公司)。

1.2 Ce-PPi CPNs 的制備

參考Zhou 等的方法制備[27]。與Zhou 等使用DNA 聚合反應(yīng)的副產(chǎn)物PPi 不同，本研究中直接通過PPi 和Ce3+的自組裝制備。使用超純水配制硝酸鈰六水合物和焦磷酸鈉水溶液 (50 mmol/L)。先后吸取2 mL 硝酸鈰六水合物和焦磷酸鈉水溶液，加入到10 mL 塑料離心管中，在轉(zhuǎn)速1 500 r/min下渦旋混合5 min，再以15 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。去除上清液，加入5 mL 超純水充分洗滌沉淀物。重復(fù)3 次后冷凍干燥得到材料Ce-PPi CPNs。

1.3 Ce-PPi CPNs 的形貌特性及結(jié)構(gòu)表征

分別使用掃描電子顯微鏡與X 射線光電子能譜儀對Ce-PPi CPNs 的形貌特征與元素組成進行表征。

1.4 草甘膦的熒光檢測

以水為溶劑配制10 mmol/L 草甘膦母液，再逐步稀釋成不同濃度的草甘膦溶液。

條件優(yōu)化：包括Ce3+濃度 (0.25～1 mmol/L)、PPi 的添加量 (2～8 μL，1 mmol/L)、PPi 和Ce3+的結(jié)合時間 (0～20 min)、草甘膦和Ce3+的作用時間(0～20 min)。

檢測流程：在最佳條件下，將6 μL 不同濃度的草甘膦溶液 (0～5 μmol/L)、20 μL Ce3+溶液(0.5 mmol/L) 與4 μL PPi 溶液先后加入到2 mL 離心管中混合，加入570 μL 超純水，最終體積為600 μL，在室溫下保持轉(zhuǎn)速600 r/min，振蕩5 min。在300 nm 激發(fā)下記錄熒光光譜。

草甘膦定量檢測：以346 nm 處的熒光強度對草甘膦的濃度對數(shù) (0.1～5 μmol/L) 作圖，獲得標準曲線，檢出限 (LOD) 使用 3σ 規(guī)則計算得到。

1.5 選擇性試驗

為研究所提出方法的選擇性，在檢測系統(tǒng)中引入多種潛在干擾物質(zhì) (濃度均為5 μmol/L)，包括Na+、Ca2+、Zn2+、抗壞血酸、葡萄糖、甘氨酸、毒死蜱、滅多威、莠去津、異丙甲草胺、戊唑醇、嘧菌酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷、草銨膦、辛硫磷、乙酰甲胺磷、H2PO4-、HPO42-、PO43-、百草枯和PBS 緩沖液 (pH=7.4)。檢測流程如1.4 節(jié)中所述，在最佳條件下試驗并測量熒光光譜。

1.6 實際樣品分析

選擇自來水和蘋果樣品，結(jié)合標準加入法驗證該方法的實際應(yīng)用潛力。

水樣采自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，將草甘膦添加到自來水樣品中，并采用1.4 節(jié)中所述方法測定，計算獲得回收率。

蘋果購自當(dāng)?shù)厥袌觯】墒巢糠智兴椴⒂媒M織搗碎機粉碎。稱取處理后的蘋果樣品5 g 于50 mL 離心管中，加入草甘膦溶液，靜置30 min。加入5 mL 純凈水，渦旋10 min 及離心10 min。取1 mL 上清液于2 mL 離心管中，加入30 mg PSA，渦旋5 min，離心5 min 后經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾得到提取液。取300 μL 提取液進行試驗，其余檢測流程同1.4 節(jié)中所述。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ce-PPi CPNs 結(jié)構(gòu)表征與分析

使用掃描電子顯微鏡觀察Ce-PPi CPNs 的具體形貌及微觀結(jié)構(gòu)。如圖3 所示，Ce-PPi CPNs 呈現(xiàn)納米顆粒形態(tài)分布，尺寸約為10 至25 nm。結(jié)合X 射線能譜儀 (EDS) 分析其元素成分，SEMEDS 結(jié)果 (圖4) 表明，鈰和磷元素均勻分布在Ce-PPi CPNs 中，證明Ce3+和PPi 通過配位交聯(lián)形成了納米尺寸聚合物。

圖3 Ce- PPi CPNs 的SEM 譜圖Fig. 3 SEM image of Ce-PPi CPNs

圖4 Ce- PPi CPNs SEM (A)、EDS (B)和 (C)(磷：紅色，鈰：綠色)譜圖Fig. 4 (A) SEM image of Ce-PPi CPNs; EDS mapping images of (B) P in red and (C) Ce in green

對Ce-PPi CPNs 進行X 射線光電子能譜 (XPS)分析，進一步確定其具體元素成分。在圖5 中，Ce3d3/2(904.4 eV)、Ce3d5/2(885.5 eV)、O1s (531.3 eV) 和 P2p (133.8 eV) 的特征峰在圖中清晰可見。鈰、磷和氧的XPS 數(shù)據(jù)與標準數(shù)據(jù)庫 (美國國家標準與技術(shù)研究院，表1) 相似，進一步證明 Ce-PPi CPNs 已被成功制備。

圖5 Ce-PPi CPNs 的XPS 譜圖Fig. 5 XPS image of Ce-PPi CPNs

表1 Ce-PPi CPNs 和NIST 數(shù)據(jù)庫中被測元素的結(jié)合能Table 1 Binding energies of tested elements in Ce-PPi and NIST database

如圖6 所示，所制備的Ce-PPi CPNs，在300 nm 激發(fā)下最大發(fā)射峰位于346 nm，這與Zhou等研究結(jié)果相似[27]。

圖6 Ce-PPi CPNs 的激發(fā)和發(fā)射光譜Fig. 6 The excitation and emission spectra of Ce-PPi CPNs

2.2 草甘膦檢測機理

通過紫外-可見吸收光譜探究了熒光猝滅效應(yīng)的可能機制。已有研究表明：PPi 可以與Ce3+配位，產(chǎn)生配體場效應(yīng)，從而提高其熒光強度；單磷酸根離子也可與Ce3+配位，但不能產(chǎn)生熒光增強效應(yīng)[27]；而草甘膦中含有單磷酸基團和羧基，可與金屬離子配位[28]。基于這一結(jié)論，可以推測：草甘膦、PPi 可以與Ce3+配位形成草甘膦-Ce3+-PPi配合物，由于草甘膦的介入，PPi 與Ce3+之間的配體場效應(yīng)被干擾而減弱，從而造成熒光猝滅。

如圖7 所示，在掃描范圍內(nèi)，草甘膦和PPi均沒有紫外吸收峰，Ce3+的吸收峰分別在252 和298 nm。當(dāng)PPi 與Ce3+混合后，298 nm 處的吸收峰紅移至300 nm，且峰強度顯著增加。如引言中所述，PPi 的配體場效應(yīng)使得 2f5/2和 2d3/2之間能量差減小，298 nm 處峰的紅移可視為配體場效應(yīng)的特征表現(xiàn)，峰位置及強度的變化再次證明了PPi和 Ce3+的結(jié)合[27]。Ce3+與草甘膦混合后，Ce3+的吸光度有所下降，但峰的位置保持在252 和298 nm不變，說明Ce3+可以與草甘膦結(jié)合，但不會改變其光學(xué)性質(zhì)。從圖7 中還可以看出，當(dāng)PPi、草甘膦和Ce3+三者同時存在時，Ce-PPi CPNs 的特征吸收峰從300 nm 藍移至299 nm，峰強度進一步顯著增加。配體場效應(yīng)特征峰藍移說明草甘膦可以削弱PPi 的配體場效應(yīng)，導(dǎo)致 2f5/2和 2d3/2之間的能量差增大，從而產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。

圖7 不同物質(zhì)的紫外-吸收光譜 (濃度均為1 mmol/L)Fig. 7 UV-Vis absorption spectra of different substances(the concentration of all substances was 1 mmol/L)

2.3 草甘膦熒光檢測結(jié)果

在條件優(yōu)化過程中，首先保持其他條件不變(1 mmol/L PPi 添加量4 μL，結(jié)合時間15 min，作用時間15 min，草甘膦濃度5 μmol/L)，優(yōu)化Ce3+的濃度 (0.25～1 mmol/L)。從圖8A 中可以看出，相對熒光強度最大時所對應(yīng)的Ce3+濃度為0.5 mmol/L，因此，選擇0.5 mmol/L 為檢測時Ce3+的濃度。其次，由于PPi 的添加量為4 μL 時相對熒光強度達到峰值 (圖8B)，因此PPi 的添加量確定為4 μL，其他條件為Ce3+濃度0.5 mmol/L，結(jié)合時間15 min，作用時間15 min，草甘膦濃度5 μmol/L。最后，優(yōu)化了PPi 與Ce3+的結(jié)合時間以及草甘膦與Ce3+的作用時間，以使熒光猝滅完全。在圖8C 中，PPi 與Ce3+結(jié)合5 min 時，相對熒光強度達到峰值，且之后基本不隨時間的增加而變化，據(jù)此確定5 min為最佳結(jié)合時間。如圖8D 所示，草甘膦與Ce3+、PPi 混勻后立即測定，此時相對熒光強度最大，且時間延長后基本不變，說明草甘膦與Ce3+作用速度快，在混勻后即可作用完全，無需振蕩。因此，為提高檢測速度，將PPi、Ce3+的結(jié)合與草甘膦、Ce3+的作用兩步驟合并，檢測流程簡化為草甘膦、Ce3+和PPi 三者共同混合振蕩5 min 后進行測定。按 (1) 式計算相對熒光強度。

圖8 Ce3+濃度(A)、PPi 添加量(B)、 PPi 與Ce3+結(jié)合時間 (C)以及草甘膦與 Ce3+ 作用時間(D)對Ce-PPi CPNs 相對熒光強度的影響Fig. 8 Effects of the concentration of Ce3+ (A) , the addition amount of PPi (B) , the combination time between PPi with Ce3+ (C) and reaction time of glyphosate and Ce3+ (D) on relative fluorescence intensities of Ce-PPi CPNs

式中：FR為相對熒光強度；F0為不含有草甘膦時體系的熒光強度；F為含有草甘膦時體系的熒光強度。

草甘膦的檢測是基于其對Ce-PPi CPNs 熒光猝滅作用實現(xiàn)的。如圖9 所示，隨著草甘膦濃度的增加，Ce-PPi CPNs 的熒光強度逐漸降低。以熒光強度對草甘膦的濃度對數(shù) (濃度范圍0.1～5 μmol/L)作圖，得到的標準曲線方程為F= -4 097.888 logc+9 356.104 (c為草甘膦濃度)，R2= 0.997 2。檢出限(LOD) 根據(jù)3σ 規(guī)則計算得到，為0.014 μmol/L。檢測速度。

圖9 Ce-PPi CPNs 在不同濃度草甘膦存在下的熒光光譜Fig. 9 Fluorescence spectra of Ce-PPi with various concentration of glyphosate

2.4 檢測方法的選擇性

為探究所建立方法在實際樣品中的應(yīng)用可能性，對方法的選擇性進行了測定。如圖10 所示，選擇包括使用量較大的農(nóng)藥、有機磷類農(nóng)藥、草甘膦結(jié)構(gòu)類似物及離子型化合物等在內(nèi)的多種非目標物作為測試對象。結(jié)果表明，多種非目標物對Ce-PPi CPNs 的熒光信號均未產(chǎn)生顯著影響，表明該方法對草甘膦具有良好的選擇性。

圖10 草甘膦和潛在干擾物質(zhì)存在時的相對熒光強度Fig. 10 The relative fluorescence intensity change rate of glyphosate and potential interfering substances towards detection

2.5 實際樣品分析

根據(jù)GB 2763—2021《食品安全標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定，草甘膦在蘋果中的最大農(nóng)藥殘留限量 (MRL) 值為0.5 mg/kg[35]，因此，選擇自來水和蘋果樣品，將3 種濃度水平的草甘膦添加到基質(zhì)中，測定熒光強度，驗證檢測方法的實際可行性。線性方程、回收率和相對標準偏差 (RSD) 測定結(jié)果 (表3) 表明：在實際樣品檢測中，回收率 (77%～87%) 和RSD (6.1%～8.8%) 均能滿足實際檢測的要求。在NY/T 1096—2006《食品中草甘膦殘留量測定》與SN/T 4655—2016《出口食品中草甘膦及其代謝物殘留量測定方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中，草甘膦的定量限(LOQ) 分別為0.02 mg/kg 和0.05 mg/kg[36-37]，本方法的LOQ 為0.05 mg/kg，滿足殘留分析要求。因此，該方法具備實際樣品檢測應(yīng)用的潛力。

表2 不同草甘膦檢測方法的檢出限和檢測時間對比Table 2 Comparison of limit of detection (LOD) and detection time of glyphosate by different analytical methods

表3 自來水和蘋果樣品中草甘膦的添加回收率和相對標準偏差(n=5)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of glyphosate in tap water and apple samples(n=5)

3 結(jié)論

將鈰離子與焦磷酸根離子在常溫下混合攪拌，通過簡單的自組裝制備出Ce-PPi CPNs，草甘膦可以通過減弱PPi 與Ce3+之間的配體場效應(yīng)猝滅Ce-PPi CPNs 的熒光，且Ce-PPi CPNs 熒光強度與草甘膦濃度具有良好的線性關(guān)系 (線性范圍0.1～5 μmol/L)。據(jù)此，建立了一種草甘膦熒光檢測方法，過程簡便易操作，具備較低的檢出限(0.014 μmol/L) 與超快的檢測速度 (5 min)，可應(yīng)用于自來水與蘋果樣品中草甘膦的快速檢測，所建立的方法滿足殘留分析的要求，為實際樣品中草甘膦的快速、靈敏、現(xiàn)場和實時檢測提供了新的選擇。

謹以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

張強，男，2019.9—2022.6 在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品安全專業(yè)攻讀碩士研究生，獲得碩士學(xué)位。在讀期間，獲得一等獎學(xué)金、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)“三好學(xué)生”及“優(yōu)秀共青團員”等多項榮譽。研究方向為農(nóng)藥快速熒光檢測方法開發(fā)。

劉東暉，女，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。2008 年畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，獲理學(xué)博士學(xué)位。2014—2015 年作為訪問學(xué)者在賓夕法尼亞大學(xué)開展合作研究。主要研究方向為農(nóng)藥分析與環(huán)境安全，重點圍繞手性農(nóng)藥分離分析、農(nóng)藥殘留分析方法開發(fā)、農(nóng)藥及關(guān)鍵代謝產(chǎn)物環(huán)境風(fēng)險及污染修復(fù)等開展研究。獲教育部自然科學(xué)二等獎、北京市科學(xué)技術(shù)二等獎、中國植物保護學(xué)會科學(xué)技術(shù)獎二等獎、北京市科學(xué)技術(shù)三等獎、北京市教育教學(xué)成果二等獎等省部級以上獎勵 5 項。2013 年入選“北京高等學(xué)校青年英才支持計劃”，2019 年入選中國農(nóng)業(yè)大學(xué)“人才培育發(fā)展支持計劃”青年新星A 類。現(xiàn)任《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報》青年編委會主任。