劉西莉, 苗建強(qiáng), 張 燦

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物病理學(xué)系，陜西 楊凌 712100)

植物病害防治過程中，由于殺菌劑的多頻次使用，病原菌在藥劑的選擇壓下通常會(huì)產(chǎn)生抗藥性，從而表現(xiàn)出對藥劑的敏感性下降。具體體現(xiàn)為：一種殺菌劑在開始使用時(shí)對病害的防治效果很好，連續(xù)使用幾年以后，防效降低，甚至無效。如果排除了藥劑質(zhì)量、使用方法和用藥量等問題，藥效下降或無效基本可判斷為病原菌對所用殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，但該現(xiàn)象需要進(jìn)一步通過抗藥性檢測等方法加以確定。病原菌抗藥性的產(chǎn)生不僅使殺菌劑防治效果降低，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來損失，同時(shí)，農(nóng)戶為了提高防效而盲目加大用藥量和施藥次數(shù)，既增加了防治成本，也加重了藥劑對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染以及對非靶標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)等。尤其是隨著現(xiàn)代高活性的選擇性殺菌劑的研發(fā)和廣泛使用，由于其作用靶標(biāo)位點(diǎn)單一，交互抗藥性問題突出，導(dǎo)致病原菌的抗藥性問題日趨嚴(yán)重，生產(chǎn)中面臨著病害防效下降、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、食品安全隱患等重大問題，給作物優(yōu)質(zhì)增產(chǎn)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。目前，植物病原菌的抗藥性已成為植物化學(xué)保護(hù)領(lǐng)域最受關(guān)注的問題之一。為此，本文系統(tǒng)闡釋了抗藥性相關(guān)術(shù)語的定義，綜述了植物病原菌抗藥性研究的相關(guān)內(nèi)容和進(jìn)展，為進(jìn)一步推動(dòng)我國殺菌劑抗性研究及抗性科學(xué)管理提供參考和指導(dǎo)。

1 植物病原菌對殺菌劑的抗藥性研究歷史和現(xiàn)狀

1.1 抗藥性的概念

植物病原菌抗藥性 (fungicide resistance) 是指本來對農(nóng)藥敏感的野生型植物病原菌個(gè)體或群體，由于遺傳變異而對藥劑出現(xiàn)敏感性下降的現(xiàn)象[1]?！翱顾幮浴毙g(shù)語包含兩方面涵義：一是病原菌遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，抗藥性可以穩(wěn)定遺傳；二是抗性菌株對環(huán)境有一定的適合度 (fitness)，與敏感野生群體相比，在越冬、越夏、生長、繁殖和致病力等方面具有較高的生存競爭力。病原菌抗藥性有別于耐藥性 (fungicide tolerance) 和不敏感性 (insensitivity)。前者是指有害生物對某種藥劑的一種暫時(shí)的、不可穩(wěn)定遺傳的適應(yīng)性反應(yīng)，而后者則指有害生物對某種藥劑的一種天然抵抗能力，即天生不敏感。

1.2 植物病原菌抗藥性研究歷史

20 世紀(jì)50 年代中期，美國學(xué)者Horsfall 提出了病原菌對殺菌劑敏感性下降的問題[2]。由于當(dāng)時(shí)長期使用的是非選擇性、多作用靶點(diǎn)的保護(hù)性殺菌劑，病原菌抗藥性未成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要問題，因而并未受到人們重視。直至 60 年代末，隨著高效、內(nèi)吸、選擇性強(qiáng)的苯并咪唑類殺菌劑被開發(fā)和廣泛用于植物病害防治，植物病原菌普遍出現(xiàn)了高水平抗藥性[2]，甚至導(dǎo)致植物病害化學(xué)防治失敗，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)蒙受巨大損失，人們才逐漸認(rèn)識(shí)到病原菌抗藥性問題的嚴(yán)重性。70 年代，荷蘭Dekker 和希臘Georgopoulous 等開展了植物病原菌抗藥性生物學(xué)、遺傳學(xué)、流行學(xué)及其治理等方面的系統(tǒng)研究[3-4]，并于1981 年促進(jìn)國際農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會(huì)成立了殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì) (Fungicide Resistance Action Committee)，開辟了植物病理學(xué)和植物化學(xué)保護(hù)學(xué)新的研究領(lǐng)域。

1.3 植物病原菌抗藥性發(fā)生現(xiàn)狀

隨著學(xué)科發(fā)展，常用于植物真菌和卵菌病害化學(xué)防治的殺菌劑已達(dá)200 余種，且不斷有新藥劑推陳出新。因此，真菌和卵菌的抗藥性是植物病原菌中最常見的，其次為細(xì)菌和線蟲，其他病原如病毒的化學(xué)防治水平還很低，有些甚至還缺乏有效的化學(xué)防治手段，因此尚未出現(xiàn)抗藥性問題。已知產(chǎn)生抗藥性的病原菌有卵菌門霜霉目霜霉屬、假霜霉屬、疫霉屬等卵菌和子囊菌門、擔(dān)子菌門和無性型真菌的數(shù)百種真菌。產(chǎn)生抗藥性的殺菌劑包括苯并咪唑類、苯酰胺類、羥基嘧啶類、苯胺基嘧啶類、三唑類、咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類 (QoI)、琥珀酸脫氫酶抑制劑 (SDHI) 和氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑 (OSBPI)等內(nèi)吸性殺菌劑，以及有機(jī)硫類、取代苯類等保護(hù)性殺菌劑，農(nóng)用硫酸鏈霉素、春雷霉素和多氧霉素等抗菌素類化合物。

目前可用于防治植物細(xì)菌病害和線蟲的藥劑種類較少，用藥水平較低，因此植物病原細(xì)菌和線蟲的抗藥性遠(yuǎn)不如真菌和卵菌抗藥性得到的關(guān)注廣泛。但是病原細(xì)菌繁殖速度快、容易發(fā)生變異，如果生產(chǎn)中頻繁使用單作用位點(diǎn)的殺細(xì)菌劑，也會(huì)導(dǎo)致其逐漸產(chǎn)生抗藥性。例如，農(nóng)用硫酸鏈霉素在田間使用不久，梨火疫病菌就對其產(chǎn)生了抗性[5-6]。在用藥水平較高的地區(qū)，發(fā)現(xiàn)了水稻白葉枯病菌對噻枯唑的田間抗性菌株[7]。近年來也發(fā)現(xiàn)了番茄潰瘍病菌對農(nóng)用硫酸鏈霉素的田間抗性菌株[8]。由于線蟲繁殖速率一般較真菌、卵菌慢，以及傳播方式存在局限性等，至今僅有少數(shù)線蟲產(chǎn)生抗藥性的事例[9]。其他病原如病毒、類菌原體和寄生性種子植物等目前還未見有抗藥性的報(bào)道。

2 病原菌抗藥性產(chǎn)生的兩種觀點(diǎn)

病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因是多方面的。通常認(rèn)為主要有自然選擇和誘導(dǎo)突變兩種觀點(diǎn)：自然選擇學(xué)說認(rèn)為，在自然情況下，病原菌群體中原本就存在極少量的遺傳變異的抗性菌株，在不斷應(yīng)用殺菌劑防治病害過程中，大部分敏感菌株被殺死，原來極少數(shù)的天然抗性菌株個(gè)體在藥劑選擇下仍然可以繼續(xù)生長繁殖、侵染寄主，其在群體中的比例不斷提高，逐年積累，最后形成抗藥性群體，導(dǎo)致藥劑防效下降[10-11]。以上觀點(diǎn)認(rèn)為，引起病原菌抗藥性的遺傳變異是自然突變產(chǎn)生的，病原菌抗藥性的產(chǎn)生是由其自身的遺傳基礎(chǔ)決定的，也就是說在殺菌劑使用之前，在病原菌群體中就存在著抗藥性個(gè)體，這些抗藥性個(gè)體通過遺傳變異對藥劑產(chǎn)生了適應(yīng)性反應(yīng)。殺菌劑只是抗藥性菌株的強(qiáng)選擇劑，而不是抗藥性產(chǎn)生的誘變劑。誘導(dǎo)突變觀點(diǎn)認(rèn)為，病原菌主要是在藥劑或其他外界因子的作用下發(fā)生了可穩(wěn)定遺傳的基因突變或過表達(dá)，導(dǎo)致殺菌劑與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合力變?nèi)趸蛱岣吡司w對藥劑的排泄和解毒代謝[10-11]。繼而在使用常規(guī)劑量的殺菌劑防治植物病害時(shí)，大部分敏感菌株被殺死，抗性突變體則在藥劑選擇下仍然可以繼續(xù)生長繁殖、侵染寄主，保持較高的適合度。

事實(shí)上，以上兩種觀點(diǎn)兼而有之。因此，在一個(gè)新藥劑使用之前，為了獲得抗性突變體來開展相關(guān)研究工作，通常可以通過藥劑篩選，以期篩選出田間自然突變的抗藥性菌株，但由于田間自然突變的頻率很低，往往篩選的難度很大。另外一種方法，則是進(jìn)行室內(nèi)抗性突變體的誘導(dǎo)。通常會(huì)選擇敏感親本菌株，通過不斷提高藥劑濃度的方式進(jìn)行多代馴化，在藥劑選擇壓下病原菌可逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性變異，形成抗藥性突變或耐藥性修飾，前者抗藥性狀可以穩(wěn)定遺傳，后者則在藥劑選擇壓消失后菌體會(huì)逐步恢復(fù)對藥劑的敏感性，不可穩(wěn)定遺傳。

通常將通過自然篩選方式獲得的田間自然突變的抗性病原菌個(gè)體稱為抗性菌株；而將通過藥劑馴化或者紫外照射等方式，在室內(nèi)條件下獲得的抗性病原菌個(gè)體稱為抗性突變體。

3 影響抗藥性群體形成的因素

抗藥性的產(chǎn)生最終是否會(huì)導(dǎo)致植物病害化學(xué)防治失敗，取決于病原菌抗藥性個(gè)體在群體中所占的比例、絕對數(shù)量、抗藥水平和適合度等因素[12]。影響病原菌抗藥性群體形成的主要因素包括以下幾方面。

3.1 病原菌

3.1.1 病原群體中潛在的抗藥性個(gè)體 由于病原群體中的個(gè)體遺傳物質(zhì)存在差異，一些病原群體在藥劑登記使用之前已存在極少數(shù)抗藥性個(gè)體，長期使用同類殺菌劑，會(huì)抑制或殺死病原群體中比較敏感的部分，而抗藥性個(gè)體則能生存和繁殖[11]。隨著藥劑防治效果下降，農(nóng)戶又會(huì)增加施藥劑量和次數(shù)，導(dǎo)致選擇壓力進(jìn)一步增加，加速抗藥性病原群體的形成。

3.1.2 抗藥性遺傳特征 抗性病原群體形成的速度與抗藥性遺傳類型是質(zhì)量遺傳性狀還是數(shù)量遺傳性狀有關(guān)。通常表現(xiàn)為質(zhì)量遺傳性狀的抗藥性是單個(gè)或幾個(gè)主效基因控制的，病原群體對藥劑的敏感性表現(xiàn)為不連續(xù)分布，抗性菌株對藥劑的抗性水平往往比較高[13]。具有這類遺傳特征的抗性菌株，當(dāng)其在群體中的抗性頻率達(dá)到1%～10%時(shí)，如繼續(xù)施藥1～3 次，會(huì)迅速導(dǎo)致抗藥性病原群體形成，導(dǎo)致藥劑防效突然下降或失敗。表現(xiàn)為數(shù)量遺傳性狀的抗藥性是由多基因控制的，病原菌對藥劑的敏感性表現(xiàn)為連續(xù)分布，隨著藥劑使用時(shí)間延長或劑量提高，病原群體敏感性逐漸向低敏感性方向移動(dòng)[13]。停止用藥后，病原群體的抗藥水平逐漸下降。通過比較不同時(shí)間所監(jiān)測到的病原菌群體的敏感性分布情況，可以觀測到群體敏感性逐年降低的動(dòng)態(tài)變化。

3.1.3 抗藥性突變體的適合度 指在自然環(huán)境條件下，抗性突變體與敏感群體在生長、繁殖速率和致病力等方面變化的程度?？顾幮圆≡倪m合度高低對抗藥病原群體的形成具有重要影響[14]。通常，病原菌對大多數(shù)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性變異后，表現(xiàn)不同程度的適合度下降，若停止或減少用藥，降低了藥劑選擇壓力，抗性菌株的比例將會(huì)下降，不易形成抗藥群體[14]。當(dāng)然，也有些病原菌對藥劑產(chǎn)生抗性后，其適合度不會(huì)降低[15]。

3.1.4 病害循環(huán) 植物地上部發(fā)生的病害，通常一個(gè)生長季節(jié)有多次侵染循環(huán)，病部常能產(chǎn)生大量的分生孢子，通過氣流或雨水傳播。病原菌長時(shí)間處于殺菌劑的選擇壓下，容易產(chǎn)生抗性，而抗藥病原菌在藥劑選擇壓下可以繼續(xù)侵染、繁殖，在較短時(shí)間內(nèi)易形成抗藥群體。例如，引起灰霉病、蔬菜霜霉病、白粉病和梨黑星病的病原菌，在甲霜靈、多菌靈和嘧菌酯等藥劑使用2～3年后，即可形成抗藥群體[16]。而立枯病、猝倒病等土傳病害以及銹病等單循環(huán)病害，抗性菌株不能在同一生長季節(jié)得到大量繁殖和篩選，抗藥群體則不易形成或形成較慢。

3.2 殺菌劑類型和作用機(jī)制

殺菌劑種類包括直接作用于病原體和間接作用于病原體兩種作用方式，其中間接作用藥劑較難產(chǎn)生抗藥性。直接作用的藥劑大體又可分為保護(hù)性殺菌劑和內(nèi)吸性殺菌劑兩大類，二者在作用方式、作用機(jī)制和抗藥性產(chǎn)生的難易程度方面具有明顯的差異。作用靶點(diǎn)單一、選擇性強(qiáng)的高效內(nèi)吸性殺菌劑極易因藥劑靶標(biāo)蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，降低藥劑與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的親和性，而表現(xiàn)出抗藥性。而傳統(tǒng)的保護(hù)性殺菌劑，在病原菌中具有多個(gè)作用位點(diǎn)，菌體細(xì)胞難以同時(shí)發(fā)生多基因突變而產(chǎn)生抗藥性。因此，田間內(nèi)吸性殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)通常大于保護(hù)性殺菌劑。另外，在藥劑選擇壓下，病原菌也可能特異性或非特異性地增強(qiáng)對殺菌劑的轉(zhuǎn)運(yùn)排泄、解毒代謝能力，但是這類非靶標(biāo)抗藥群體形成較慢，抗藥水平較低。根據(jù)藥劑選擇壓下病原菌抗藥群體形成的速度和抗藥水平，殺菌劑的固有抗性風(fēng)險(xiǎn)可分為高、中和低3 種。

3.3 其他因素

3.3.1 農(nóng)業(yè)栽培措施和氣候條件 凡是有利于病害發(fā)生和流行的作物栽培措施和氣候條件，均因病原菌群體數(shù)量大，用藥水平高，易導(dǎo)致抗藥群體形成。例如，同一地區(qū)作物品種布局單一、種植感病品種、連作、偏施氮肥和過分密植等都會(huì)導(dǎo)致病害發(fā)生嚴(yán)重，因而病害防治時(shí)藥劑用量和施藥次數(shù)也會(huì)相應(yīng)增加，在不斷增強(qiáng)的藥劑選擇壓下，就會(huì)加速抗藥群體形成。尤其是在溫室或大棚栽培條件下，由于環(huán)境溫濕條件適宜某些病害常年發(fā)生，而且封閉的空間內(nèi)一旦抗藥性菌株出現(xiàn)，也很難與外界交換稀釋，能迅速形成抗藥群體。

3.3.2 是否合理用藥 科學(xué)合理地使用殺菌劑，既可達(dá)到良好的防治效果，又可阻止或延緩抗藥性產(chǎn)生。因此，田間是否科學(xué)合理使用殺菌劑用于植物病害防治，也是影響病原菌抗藥性群體形成的主要因素。建議在病害發(fā)生、流行等關(guān)鍵時(shí)期用藥，減少用藥次數(shù)；避免在較大范圍內(nèi)使用同類或同種藥劑。此外，提倡不同作用機(jī)制的殺菌劑混用或輪用。另外，需關(guān)注藥劑的持效期對于病原菌抗藥性的影響。

4 植物病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估

抗藥性風(fēng)險(xiǎn) (resistance risk) 是指因有害生物群體產(chǎn)生抗藥性而對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成不良后果的可能性。根據(jù)農(nóng)藥的類別、靶標(biāo)生物的特性、產(chǎn)生抗性的概率以及抗性產(chǎn)生可能導(dǎo)致的后果可將抗藥性風(fēng)險(xiǎn)分成高、中、低3 個(gè)級別。

抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估 (resistance risk assessment) 則是預(yù)測一種新的藥劑在田間推廣使用后產(chǎn)生抗藥性的可能性，以及抗性產(chǎn)生對藥劑防治效果和藥劑使用周期的影響。目前，我國已經(jīng)制定了農(nóng)藥抗性風(fēng)險(xiǎn)評估總則和系列病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估標(biāo)準(zhǔn)，在新農(nóng)藥登記之前，在室內(nèi)可通過藥劑馴化或紫外誘變等方法獲得病原菌的抗性突變體。結(jié)合抗性突變頻率、突變體的生物學(xué)性狀及其對不同作用機(jī)制藥劑的交互抗藥性情況，初步評估某種“病原-藥劑”組合發(fā)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估主要包括以下內(nèi)容。

4.1 藥劑特性及敏感基線的建立

明確相關(guān)藥劑的作用方式、作用機(jī)制及其活性和持效期。從未使用相關(guān)藥劑的多個(gè)代表性地區(qū)采集分離100 株以上供試菌株，測定其對該殺菌劑的敏感性 (抑制中濃度EC50值或最小完全抑制濃度MIC 值)。野生敏感群體的敏感性頻率分布一般呈單峰曲線，其對藥劑的EC50值或MIC 值平均值可作為靶標(biāo)菌對該藥劑的敏感基線。

4.2 靶標(biāo)病原菌產(chǎn)生抗藥性的潛能

采用紫外誘變或藥劑馴化的方法在室內(nèi)進(jìn)行抗性突變體的誘導(dǎo)。靶標(biāo)病原菌產(chǎn)生抗藥性的潛能以抗藥性突變頻率 (fungicide resistance mutation frequency) 表示，產(chǎn)生抗藥性的水平以抗性指數(shù)(resistance factor) 表示。抗藥性突變頻率是指供試靶標(biāo)病原菌群體中發(fā)生與抗藥性相關(guān)突變的菌株所占的百分比例?？剐灾笖?shù)是指抗藥性菌株對該藥劑的敏感性 (以EC50或MIC 表示) 與其親本菌株敏感性或與敏感基線的平均EC50或MIC 的比值。

4.3 交互抗藥性

測定相關(guān)藥劑對敏感菌株和抗性菌株的EC50值，分析該藥劑是否與生產(chǎn)上常用藥劑之間具有正交互抗藥性 (positive cross-resistance) 或負(fù)交互抗藥性 (negative cross-resistance)。如果病原菌對某一殺菌劑產(chǎn)生抗藥性時(shí)，也對其他未接觸過的殺菌劑表現(xiàn)抗藥性，則具有正交互抗藥性，也稱交互抗藥性 (cross-resistance)。如果病原菌對某一種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，而對其他未接觸過的殺菌劑表現(xiàn)為更加敏感，則具有負(fù)交互抗藥性。交互抗性分析通常依據(jù)Spearman rank correlation 的分析方法，當(dāng)P＞0.05 時(shí)，表示兩種藥劑無交互抗性；當(dāng)P＜0.05 時(shí)，|ρ|＞0.8 表示兩種藥劑有強(qiáng)的正或負(fù)交互抗性，0.5≤|ρ|＜0.8 表示兩種藥劑有交互抗性，0.3≤|ρ|＜0.5 表示存在交互抗性的概率很低，|ρ|＜0.3 表示兩種藥劑無交互抗藥性。在上述交互抗藥性結(jié)果分析中，還需結(jié)合抗性表型綜合判斷以避免特殊情況。

4.4 抗藥性菌株的適合度和抗性風(fēng)險(xiǎn)級別分析

測定比較抗藥性菌株和敏感菌株 (包括親本菌株) 的生物學(xué)性狀差異，包括菌絲生長速率、溫度敏感性、繁殖能力、孢子萌發(fā)能力及致病力等，分析適合度綜合指數(shù)。如果抗性群體的適合度與敏感群體 (包括親本菌株) 相當(dāng)，則待評估藥劑具有一定的抗性風(fēng)險(xiǎn)，若明顯高于或低于敏感群體(包括親本菌株)，則相關(guān)藥劑田間使用后靶標(biāo)菌對其產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)可能較高或較低。

綜合抗藥性菌株的突變頻率、抗性指數(shù)和生物學(xué)性狀和交互抗藥性測定結(jié)果，并結(jié)合抗藥性遺傳規(guī)律和藥劑特性等，綜合分析藥劑在田間推廣使用后產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，一般分為低等、中等和高等抗性風(fēng)險(xiǎn)。由于抗藥性發(fā)生受到氣候環(huán)境條件、農(nóng)業(yè)栽培措施，以及病原菌自身的擴(kuò)散流行特點(diǎn)的影響[9]，所以對于室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果表現(xiàn)為中、高風(fēng)險(xiǎn)的藥劑，也仍然具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。例如，葡萄霜霉病菌和黃瓜霜霉病菌對羧酸酰胺類(CAA) 殺菌劑氟嗎啉、烯酰嗎啉的室內(nèi)抗性風(fēng)險(xiǎn)評估表現(xiàn)出較高的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，但通過合理用藥，其在田間使用多年后仍可用于霜霉病的防治[19]。同樣，在室內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)評估中表現(xiàn)為中等、高等抗性風(fēng)險(xiǎn)的SDHI 類殺菌劑和QoI 類殺菌劑等，通過制定合理的抗性管理策略，依然在生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，殺菌劑的實(shí)際抗性風(fēng)險(xiǎn)，需在室內(nèi)和田間試驗(yàn)相結(jié)合的基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合評估和科學(xué)管理。

5 植物病原菌抗藥性機(jī)制

病原物只要發(fā)生單基因或少數(shù)寡基因突變就可以導(dǎo)致病原物靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的改變，從而降低其與藥劑的親和性，這是最常見的抗藥性機(jī)制；植物病原真菌對殺菌劑抗藥性還可由靶標(biāo)蛋白編碼基因過表達(dá)引起。另外，有的病原物可通過修飾細(xì)胞壁或生物膜的結(jié)構(gòu)，阻止藥劑到達(dá)靶標(biāo)位點(diǎn)，減少對藥劑的吸收，或者增加對藥劑的排泄或代謝解毒，減少藥劑在細(xì)胞內(nèi)的積累等表現(xiàn)抗藥性[20-21]。

已有研究表明，目前植物病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制主要包括以下幾種。

5.1 靶標(biāo)蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變

靶標(biāo)蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白與藥劑的親和性下降，結(jié)合力減弱。對于單作用位點(diǎn)的選擇性殺菌劑而言，其抗性機(jī)制主要由靶標(biāo)蛋白編碼基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致，其次由靶標(biāo)蛋白編碼基因的過量表達(dá)引起。例如，QoI 類殺菌劑上市兩年后，即在田間檢測到了小麥白粉病菌對其產(chǎn)生抗性的亞群體[22]。研究發(fā)現(xiàn)，與QoI 類殺菌劑抗性產(chǎn)生密切相關(guān)的是藥劑的靶標(biāo)蛋白CYTB上G143A 的點(diǎn)突變[23]。G143A 或G143S 的突變也在水稻稻瘟病菌[24]、黃瓜白粉病菌[25]、小麥白粉病菌[26]、瓜類霜霉病菌[27]、葡萄霜霉病菌[28]、香蕉葉斑病菌[29]和蘋果黑星病菌[30]等多種病原菌的抗藥性菌株中被檢測到，并可引起病原菌對QoI類殺菌劑的高水平抗性。同樣，甾醇脫甲基抑制劑 (DMI)的靶標(biāo)蛋白CYP51 發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致植物病原真菌對DMI 類殺菌劑產(chǎn)生抗性已有廣泛報(bào)道[31]。例如，在小麥白粉菌[32]、赤霉菌[33]、水稻稻瘟菌[34]、惡苗菌[35-36]、蔬菜灰霉菌[37]和桃褐腐菌[38]CYP51 發(fā)生的Y136F 或Y123H 點(diǎn)突變，可以導(dǎo)致病原菌對DMI 類殺菌劑產(chǎn)生抗性。在灰霉病菌中，苯并咪唑類殺菌劑的抗性與β-微管蛋白上的E198A/V/K、F200Y 有關(guān)，與此同時(shí)，E198K 和F200Y 也可以引起灰霉病菌對微管蛋白抑制劑乙霉威的抗性[39-41]。雖然新一代開發(fā)的SDHI 類殺菌劑擴(kuò)展了殺菌譜，但是隨著藥劑的連續(xù)使用，SDHI 類殺菌劑的抗性發(fā)展也隨之發(fā)生?？剐援a(chǎn)生主要與琥珀酸脫氫酶上不同亞基的點(diǎn)突變相關(guān)，根據(jù)已有報(bào)道，多數(shù)病原菌的點(diǎn)突變發(fā)生在SdhB、SdhC 和SdhD 亞基上[42]。水稻紋枯菌[43]、稻瘟菌[44]、小麥赤霉菌[45-47]、瓜菜灰霉菌[48-50]、早疫菌[51-52]、靶斑菌[53-55]等對SDHI 類殺菌劑的高水平抗藥性與SdhB 亞基上P199I、S201L、H248Y突變、SdhC 亞基上A73V、H140R、S141R 和SdhD 亞基上P101T、P109L、H122N、G126V、D133N 的單點(diǎn)突變或多點(diǎn)連鎖突變有關(guān)；其中，SdhB 亞基上H248Y 點(diǎn)突變出現(xiàn)頻率最高。黃瓜霜霉[56]、辣椒疫霉[57-58]、馬鈴薯晚疫[59]、大豆疫霉[60]和瓜類疫霉[61]等病原卵菌對雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、丁吡嗎啉、氟嗎啉等CAA 類殺菌劑的高水平抗藥性與纖維素合酶CesA3 亞基上G1105A/V/W、V1109L、F1073L 點(diǎn)突變有關(guān) (圖1)；對苯酰菌胺、噻唑菌胺的高水平抗藥性與β-微管蛋白上C165Y、C239S/L 點(diǎn)突變有關(guān)[62-63]；對新型焜還原位點(diǎn)抑制劑(QiI)氰霜唑和醌還原位點(diǎn)和氧化位點(diǎn)抑制劑(QioI)唑嘧菌胺的高水平抗性與CYTB 上S33L 或D228N 點(diǎn)突變有關(guān)[64]；對OSBPI 類殺菌劑的高水平抗性與氧化固醇結(jié)合蛋白ORP1 上G770V 等14 種點(diǎn)突變相關(guān) (圖2)[15,65]。

圖1 辣椒疫霉菌PsCesA3 上4 種導(dǎo)致CAA 類殺菌劑抗性的點(diǎn)突變[58]Fig. 1 Four point mutations of PsCesA3 causing resistance to CAA fungicides in Phytophthora capsici [58]

圖2 致病疫霉PiORP1 上的14 種點(diǎn)突變可導(dǎo)致病原菌對OSPBI 類殺菌劑的高水平抗性Fig. 2 A total of 14 point mutations of PiORP1 causing high-level resistance to OSBPI fungicides in Phytophthora infestans

實(shí)際生產(chǎn)中，不同病原菌-殺菌劑組合，其抗藥性進(jìn)化和流行受到了多種遺傳動(dòng)力的影響。例如Chen 等研究表明馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性主要由基因變異引起，其抗性相關(guān)基因 RPA190在進(jìn)化中受到正選擇作用，且在進(jìn)化過程中至少出現(xiàn)了兩種獨(dú)立的進(jìn)化途徑(圖3)[66]；Brunner 等研究表明小麥殼針孢葉枯病菌對三唑類殺菌劑的抗性受到 CYP51 基因變異的作用，且基因重組在近年的歐洲群體抗藥中也發(fā)揮了作用[67]；此外，Cai 等研究表明 大豆疫霉 對 氟嗎啉 的抗性發(fā)展存在微進(jìn)化現(xiàn)象，即 在低劑量藥劑馴化壓力下，疫霉CesA3 蛋白會(huì)產(chǎn)生 I1112V 突變(Type I 型)，如進(jìn)一步增加藥劑選擇壓力， 為適應(yīng)更高劑量CAA類殺菌劑的脅迫，Type I 型低抗突變體將會(huì)向Type II～V 型 的高抗突變體進(jìn)化，發(fā)現(xiàn) 病原菌CesA3 蛋白 上除I1112V 突變外，又分別增加了V1110L、G1105A、G1105S 和Q1077H 突變位點(diǎn)(圖4)[60]。分析表明，田間 若使用低劑量的氟嗎啉防治大豆疫病，病原菌更易產(chǎn)生低抗突變體，進(jìn)而在藥劑的選擇壓下，將會(huì)促進(jìn)多種類型 高抗突變體 產(chǎn)生，最終導(dǎo)致氟嗎啉防效明顯下降或失去防效。因此，基于該研究結(jié)果，建議在田間通過使用有效高劑量的氟嗎啉防治大豆疫病，以有效延緩抗藥性產(chǎn)生的科學(xué)用藥措施。

圖3 馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性進(jìn)化途徑Fig. 3 Evolutionary network of metalaxyl resistance in Phytophthora infestans

圖4 大豆疫霉在氟嗎啉使用壓力下對CAA 類殺菌劑的抗性及其CesA3 點(diǎn)突變的微進(jìn)化過程[60]Fig. 4 Stepwise evolution of the CesA3 protein and CAA resistance in Phytophthora sojae exposed to flumorph[60]

5.2 靶標(biāo)基因的過量表達(dá)

已有的研究發(fā)現(xiàn)植物病原真菌對殺菌劑抗藥性還可由靶標(biāo)蛋白編碼基因過表達(dá)引起，其中由CYP51基因過表達(dá)導(dǎo)致形成過量的14α-脫甲基酶，進(jìn)而引起病原菌對DMI 類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性較為常見。例如，水稻惡苗病菌、番茄灰霉病菌對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇等藥劑的田間抗性菌株中CYP51基因存在過量表達(dá)[34,68-70]。指狀青霉菌對DMI 類殺菌劑的所有抗性菌株的CYP51序列上游存在一個(gè)簡單的126 bp 序列的5 次串聯(lián)重復(fù)，而該序列在所有的敏感菌株中只有一次重復(fù)，并且抗性菌株CYP51基因組成型表達(dá)水平比敏感菌株高100 倍。因此，推測126 bp 序列片段能起到轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的作用，增強(qiáng)了CYP51基因的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致病原菌對DMI 類殺菌劑產(chǎn)生抗性[71]。另外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，蘋果黑星病菌對腈菌唑的田間抗性菌株中，CYP51基因均未發(fā)生點(diǎn)突變，但發(fā)現(xiàn)絕大部分抗性菌株的CYP51基因表達(dá)水平比親本菌株高。其中，少量表達(dá)水平上升的抗性菌株的CYP51基因上游插入一個(gè)553 bp的片段[37]，說明除了片段插入引起表達(dá)量上升可導(dǎo)致抗性產(chǎn)生外，還有其他機(jī)制調(diào)控了病原菌對DMI 類殺菌劑的抗性。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，灰霉病菌等植物病原菌對DMI 類殺菌劑的抗藥性可同時(shí)由靶標(biāo)蛋白點(diǎn)突變和編碼基因的過量表達(dá)引起[36,72]。

5.3 運(yùn)輸體外排機(jī)制

運(yùn)輸體是一類位于病原菌細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)構(gòu)，可以阻止病原菌細(xì)胞內(nèi)的毒性物質(zhì)富集達(dá)到致死濃度[73]。ABC (ATP-binding cassette) 和MFS(major facilitator superfamily) 復(fù)合體蛋白是最具代表性的保護(hù)病原菌免受殺菌劑抑制或殺死的運(yùn)輸體[74-75]。已有大量研究報(bào)道了ABC 運(yùn)輸體在病原菌多藥抗性 (multi-drug resistance) 中發(fā)揮著重要作用。在構(gòu)巢曲霉中第一次檢測到由atrB基因編碼的ABC 運(yùn)輸體與QoI 類殺菌劑抗性存在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該基因過表達(dá)可以保護(hù)病原菌免受幾乎所有供試殺菌劑的抑制作用[75]?；移咸焰咧袌?bào)道了14個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中3 個(gè)蛋白BcatrB、BcatrD、BcatrK 與多藥抗性表型相關(guān)[76-77]。MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在病原菌的多藥抗性中也發(fā)揮著重要作用，在小麥葉枯病菌的多藥抗性相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，Mgmfs1基因的啟動(dòng)子序列可發(fā)生519 bp 的插入突變，致使該基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過量表達(dá)，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥抗性[78]。另外，鑒定到了2 個(gè)MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bcmfs1 和Bcmfs2 在灰葡萄孢的多藥抗性表型中發(fā)揮作用[79-80]。值得注意的是，該運(yùn)輸機(jī)制引起抗性的病原菌往往表現(xiàn)出多藥抗性的現(xiàn)象。

5.4 代謝解毒機(jī)制

有的病原菌能夠?qū)⒕鷦┐x成為沒有殺菌毒性的化合物，從而對藥劑產(chǎn)生抗性。已有研究報(bào)道，立枯絲核菌抗性突變體能夠?qū)⒁置惯虼x成為沒有活性的化合物[81]。有的抗性菌株喪失了將殺菌劑代謝成具有較高活性化合物的能力，如三唑酮在敏感菌株中被代謝成三唑醇才能起到更好的殺菌活性，而在抗性菌株中這種代謝作用被阻止[82]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，以立枯絲核菌和辣椒疫霉為代表的病原真菌和卵菌可通過解毒代謝，對解偶聯(lián)劑氟啶胺和新型殺菌劑雙苯菌胺 (SYP-14288)產(chǎn)生高水平抗性[83-84]。解偶聯(lián)劑雙苯菌胺可通過誘導(dǎo)立枯絲核菌P450和GST基因過表達(dá)來增強(qiáng)病原菌的解毒代謝進(jìn)而引發(fā)多藥抗性；而辣椒疫霉則通過P450 參與的解毒代謝和P-gp基因過表達(dá)介導(dǎo)的藥劑外排，從而表現(xiàn)出對解偶聯(lián)劑雙苯菌胺的抗性[84-85]。另外，水稻稻瘟病菌也可通過上調(diào)表達(dá)P450 基因引起對新型嘧啶胺類殺菌劑的抗性[86]。

5.5 補(bǔ)償作用或旁路氧化途徑

旁路氧化途徑最初發(fā)現(xiàn)于植物體內(nèi)，后來在病原菌中發(fā)現(xiàn)其是病原菌對QoI 類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的原因之一。交替氧化酶 (alternative oxidase，AOX) 是該過程的關(guān)鍵酶，能接受輔酶Q (CoQ)傳來的電子直接傳遞給氧生成水，而不經(jīng)過復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ[87-89]。QoI 類殺菌劑因AOX 酶被誘導(dǎo)表達(dá)而產(chǎn)生抗藥性也有報(bào)道，在室內(nèi)通過紫外誘變獲得的抗嘧菌酯的小麥葉枯病菌，其抗性倍數(shù)約為10，加入2 mmol/L 的AOX 酶抑制劑水楊肟酸 (SHAM) 后可使其恢復(fù)對嘧菌酯的敏感性，表明抗性突變體的AOX 酶被誘導(dǎo)表達(dá)是病原菌對嘧菌酯產(chǎn)生抗性的原因[90]。另外，QoI 類殺菌劑可以誘導(dǎo)水稻稻瘟病菌AOX 酶過量表達(dá)從而啟動(dòng)旁路氧化途徑，病原菌表現(xiàn)出抗藥性。AOX 酶過量表達(dá)不能在后代穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)10 代或加入100 μg/mL 水楊肟酸后，突變體重新表現(xiàn)為敏感[91]。因此，QoI 類殺菌劑誘導(dǎo)AOX 酶的過量表達(dá)也是該類殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因之一。

此外，隨著殺菌劑的大量使用，目前已有雙重或多重抗性的菌株陸續(xù)報(bào)道，該類菌株有別于多藥抗性菌株，其抗性機(jī)制主要是由于兩種或兩種以上不同作用機(jī)制的殺菌劑靶標(biāo)蛋白同時(shí)或先后發(fā)生位點(diǎn)突變而引起的抗性，稱為多重抗藥性(multiple resistance)。例如，已有研究報(bào)道了對MBC 和DMI 類藥劑表現(xiàn)雙重抗性的部分桃褐腐病菌是由β-微管蛋白上E198A 的點(diǎn)突變和CYP51的過量表達(dá)引起[92]?；颐共【鷮? 種不同作用機(jī)制藥劑表現(xiàn)的多重抗性，分別由其靶標(biāo)蛋白的點(diǎn)突變引起[93]。

6 植物病原菌抗藥性檢測和監(jiān)測方法

由于病原菌抗藥性不容易被肉眼識(shí)別，必須通過精密測定才能鑒別和診斷，因此，自1970 年代選擇性殺菌劑被廣泛應(yīng)用以來，快速、靈敏的病原物抗藥性診斷檢測方法和技術(shù)一直是各國植物病理學(xué)領(lǐng)域研究開發(fā)的重點(diǎn)之一。

6.1 病原菌抗藥性檢測和監(jiān)測

抗藥性檢測 (resistance detection) 是指通過常規(guī)的生測手段或分子生物學(xué)技術(shù)判斷病原群體中是否存在抗性菌株及抗藥菌株的出現(xiàn)頻率。通常是對用藥水平較高的地方臨時(shí)采集標(biāo)本進(jìn)行測定?？顾幮员O(jiān)測 (resistance monitoring) 是測定田間植物病原群體對使用藥劑的敏感性變化，主要是在各地定點(diǎn)連年系統(tǒng)測定，觀察抗藥群體的發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)。

6.2 抗性監(jiān)測的目的和意義

1) 明確病原菌抗藥性群體的發(fā)生動(dòng)態(tài)，預(yù)測抗藥性的發(fā)展趨勢。 2) 證實(shí)田間藥劑防治效果下降是否與病原菌抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。 3) 評估抗藥性風(fēng)險(xiǎn)管理措施的有效性。 4) 指導(dǎo)田間科學(xué)交替或輪換用藥，及時(shí)指導(dǎo)抗藥性治理策略的修改和完善。

6.3 常用的抗藥性監(jiān)測方法

目前已經(jīng)建立了多種常規(guī)生測方法和分子檢測技術(shù)，適用于不同場景下病原菌抗藥性監(jiān)測。主要檢測和監(jiān)測方法和技術(shù)介紹如下：

6.3.1 病原菌對藥劑敏感性測定的常規(guī)生測方法

包括離體測定法和活體測定法。離體測定法主要測定病原菌生長量或孢子萌發(fā)率與藥劑的效應(yīng)關(guān)系，包括菌落生長速率抑制法、干重法、孢子萌發(fā)法、濁度法等；但DMIs 等許多內(nèi)吸性殺菌劑并不影響孢子萌發(fā)，這時(shí)應(yīng)該考慮對芽管形態(tài)和菌體發(fā)育的作用[94-95]?；铙w測定方法適合專性寄生菌的抗藥性檢測，是指將病原菌接種到經(jīng)殺菌劑處理過的植株或葉片等植物組織上，評估藥劑處理劑量與發(fā)病程度間的效應(yīng)關(guān)系。

6.3.2 抗性菌株的常規(guī)鑒別方法 在測定某種病原菌不同個(gè)體對不同濃度殺菌劑的敏感性后，如何進(jìn)一步鑒別和評估它們的抗藥性，常用的標(biāo)準(zhǔn)有3 種：

1) 使用同一質(zhì)量濃度測定藥劑對敏感或抗性菌株的菌落生長抑制率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和活體防治效果，劃分抗性菌株的標(biāo)準(zhǔn)[96-97](表1)。

表1 甲霜靈抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Metalaxyl-resistance division criteria

2) 測定最低抑制濃度MIC (minimum inhibition concentration)，采用區(qū)分計(jì)量法，在含有完全能抑制野生敏感菌株生長的殺菌劑濃度的培養(yǎng)基平板上，涂布病原菌混合孢子或接種其他繁殖體，進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng)后，檢查病菌的生長情況，計(jì)算抗藥性菌株的出現(xiàn)頻率% (獲得的抗藥性菌體數(shù)量 ×100/用于抗藥性監(jiān)測的病原菌群體數(shù)量總和)。該方法相對省時(shí)省力，適合在短時(shí)間內(nèi)檢測大量菌株群體。

3) 建立敏感基線方法：通過測定某一地區(qū)用藥前病原群體 (一般需測100 個(gè)菌株) 對藥劑的敏感性分布，建立敏感基線，獲得用藥前病原群體對藥劑的平均EC50值，也稱為病原菌對該藥劑敏感基線的平均EC50值。用藥后再測定病原群體的敏感性，由此可根據(jù)平均EC50之比 (田間抗性菌株的EC50/田間敏感基線的平均EC50) 來評估某一地區(qū)病原群體的抗性水平 (resistance level，RL)。

6.3.3 抗性菌株的分子檢測方法 以上常規(guī)檢測方法簡便易行，但工作量大、消耗的人力資源和材料較多，檢測周期長，從病原菌分離到抗藥性鑒定長達(dá)一周甚至數(shù)周，且在病原菌培養(yǎng)過程中存在雜菌污染，而且這種方法檢測靈敏度低，要求抗藥性菌株的突變頻率在1% 以上。近20 多年來，隨著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的發(fā)展，限制性片段長度多態(tài)性PCR (PCR-RFLP)、等位特異PCR (AS-PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) (LAMP) 和定量PCR 等分子檢測方法被成功用于病原菌抗藥性群體監(jiān)測。分子檢測技術(shù)為植物病原菌的抗藥性監(jiān)測提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，使病原菌的抗藥性早期監(jiān)測和預(yù)警成為可能。例如，研究人員針對多菌靈和乙霉威抗性菌株中β-微管蛋白F200Y 的點(diǎn)突變和E198V/K 的點(diǎn)突變，開發(fā)了AS-PCR 和PCR-RFLP 分子檢測技術(shù)，用于田間抗性菌株的快速檢測鑒定[98]。我國科研工作者也針對因病原菌靶標(biāo)位點(diǎn)突變導(dǎo)致的多種病原菌對內(nèi)吸性殺菌劑的抗藥性，建立了AS-PCR、PCR-RFLP 和LAMP 方法檢測田間抗性菌株的技術(shù)體系，與傳統(tǒng)方法相比，分子檢測方法可縮短檢測時(shí)間、提高工作效率，而且提高了檢測的靈敏度，檢測頻率在10-5～10-4，更適用于檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法[99-103]。因此，分子檢測技術(shù)將在病害的可持續(xù)管理系統(tǒng)中發(fā)揮愈來愈重要的作用。

1) 等位特異PCR (AS-PCR)：由于病原菌靶標(biāo)基因發(fā)生了與抗藥性相關(guān)位點(diǎn)突變，據(jù)此可進(jìn)行等位特異性引物設(shè)計(jì)，即正向引物的最后一位堿基即為在抗性菌株中檢測到的堿基突變位點(diǎn)，在該引物的倒數(shù)第二位處人為引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，以提高引物的特異性，并結(jié)合不同退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增篩選，最終獲得在抗性和敏感菌株之間具有識(shí)別度的最適退火溫度。使用該對引物僅能從抗性菌株中擴(kuò)增到特異性片段。例如，大豆疫霉β-微管蛋白編碼基因第716 位堿基的點(diǎn)突變G716C可導(dǎo)致C239S 的氨基酸突變，這是引起大豆疫霉對苯酰菌胺抗藥性的原因[62]。根據(jù)此突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對錯(cuò)配引物，在67 ℃的退火溫度下，以一對非特異性引物為參照，使用該對引物分別對苯酰菌胺表現(xiàn)抗性和敏感的菌株進(jìn)行擴(kuò)增，在抗性突變體中均可以擴(kuò)增出預(yù)期的條帶，而在敏感菌株中均沒有擴(kuò)增出預(yù)期的條帶 (圖5A)；而使用非特異性引物無論在對苯酰菌胺表現(xiàn)抗性還是敏感的菌株中，均能擴(kuò)增出預(yù)期的條帶 (圖5B)[99]。

圖5 (A) AS-PCR 引物在67 ℃時(shí)檢測大豆疫霉對苯酰菌胺的敏感菌株和抗性突變體情況； (B) 非特異性引物對在敏感菌株和抗性突變體中的擴(kuò)增情況[99]Fig. 5 (A) Amplification results of AS-PCR primers for zoxamide-resistant and -sensitive Phytophthora sojae at 67 ℃; (B) Amplification results of non-specific primers on sensitive strains and resistant mutants[99]

2) 限制性片段長度多態(tài)性PCR (PCR-RFLP)：由于靶標(biāo)蛋白編碼基因上抗藥性相關(guān)的點(diǎn)突變導(dǎo)致了酶切位點(diǎn)的改變，包括增加、減少或位點(diǎn)替換，從而導(dǎo)致抗性和敏感菌株P(guān)CR 擴(kuò)增片段DNA 酶切產(chǎn)物的片段長度多態(tài)性發(fā)生了差異性變化。例如，導(dǎo)致的辣椒疫霉對氟噻唑吡乙酮的抗藥性的氧化固醇結(jié)合蛋白上G769W 的雜合突變，其編碼基因上增加了1 個(gè)Pf1MI 酶切位點(diǎn)，即抗性菌株中靶標(biāo)基因上有3 個(gè)酶切位點(diǎn)，從而導(dǎo)致Pf1MI 酶對抗性菌株和敏感菌株P(guān)CR 產(chǎn)物酶切片段數(shù)量發(fā)生改變 (圖6)[15]。另外，大豆疫霉對苯酰菌胺產(chǎn)生抗藥性后，β-微管蛋白上發(fā)生了C239S的氨基酸位點(diǎn)突變，導(dǎo)致PmlI 酶切位點(diǎn)被替換為BmgBI 酶切位點(diǎn)，便可以使用PmlI 和BmgBI 分別同時(shí)酶切敏感菌株和抗性突變體的β-微管蛋白編碼基因產(chǎn)物。這樣，敏感菌株的β-微管蛋白基因產(chǎn)物只能被PmlI 酶切成兩個(gè)片段，而抗性突變體的β-微管蛋白編碼基因產(chǎn)物只能被BmgBI 酶切成兩個(gè)片段[99]。

圖6 快速鑒定辣椒疫霉PcORP1 基因核苷酸點(diǎn)突變及其對氟噻唑吡乙酮抗藥性的PCR-RFLP 方法[15]Fig. 6 A PCR-RFLP method for rapid identification of nucleotide point mutations in the PcORP1 gene conferring to oxathiapiprolin resistance in Phytophthora capsici [15]

3) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) (LAMP)：該技術(shù)針對靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物，利用一種鏈置換DNA 聚合酶在等溫條件 (65 ℃左右) 保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)[100]。在LAMP的反應(yīng)過程中，DNA 聚合酶發(fā)揮聚合作用，改變質(zhì)子數(shù)量進(jìn)而改變pH 值，陰性反應(yīng)結(jié)果和陽性反應(yīng)結(jié)果顯色不同，肉眼可見 (圖7)。LAMP 方法的最大特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增，不需要循環(huán)儀、凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)極快，一般在1 h 內(nèi)完成；通過肉眼即可判定結(jié)果；靈敏度高、特異性強(qiáng)；操作簡便、快捷，適于病原菌突變基因型的快速鑒定及檢測[101-103]。

圖7 LAMP 引物組在68 ℃ 45 min 條件下可檢測出PcORP1 上G700V 突變的抗性突變體[103]Fig. 7 The LAMP primer set can detect the resistant mutants with G700V mutation in PcORP1 at 68 ℃for 45 min[103]

6.4 病原菌抗藥性監(jiān)測中應(yīng)注意的問題

6.4.1 敏感基線建立和敏感性測定 建立重要防治對象對常用藥劑的敏感基線，是監(jiān)測田間重要病原菌抗藥性的發(fā)生和發(fā)展動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)。某種殺菌劑-病原菌組合的抗性監(jiān)測，不但要選用適當(dāng)?shù)姆椒ê蜅l件進(jìn)行，而且抗藥性監(jiān)測所有方法必須與建立敏感基線所用的方法和條件相同。用于病原菌敏感性測定的藥劑應(yīng)盡可能使用高含量的殺菌劑原藥，避免使用市售的制劑，以防止助劑等成分影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

6.4.2 抗藥性監(jiān)測的樣本量要求 抗藥性群體的田間檢測/監(jiān)測，采集和測定靶標(biāo)病原菌的標(biāo)本數(shù)量，根據(jù)測試目的不同而異。如果病原群體中抗性產(chǎn)生情況未知，供試的菌株數(shù)量合理基數(shù)應(yīng)該達(dá)100 個(gè)以上。如估計(jì)自然群體中有1%的菌株產(chǎn)生抗藥性，測定這一比例的1%和5%的顯著水平，需采集458 個(gè)和298 個(gè)標(biāo)本；如估計(jì)群體中有10%的菌株具有抗性，只需要采集44 個(gè)和28個(gè)標(biāo)本，則可滿足這一比例的顯著水平。因此，若想在抗藥性發(fā)生早期通過監(jiān)測來預(yù)警抗藥性發(fā)生，則要測定大量標(biāo)本，從田間用藥水平高的地區(qū)隨機(jī)采集10～20 個(gè)樣本進(jìn)行分離和測定，進(jìn)一步檢測抗性菌株和敏感菌株的致病力，開展殺菌劑防效試驗(yàn)，以明確同等藥劑劑量下，殺菌劑對抗性菌株和敏感菌株導(dǎo)致的病害防效上的差異。

7 植物病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)管理

抗藥性風(fēng)險(xiǎn)管理 (resistance risk management)是指針對抗藥性風(fēng)險(xiǎn)采取延緩或抑制靶標(biāo)生物抗藥性發(fā)展，避免對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成不良后果的策略和措施。

7.1 病原菌抗藥性治理策略制定的目的和一般原則

制定殺菌劑抗性治理策略的目的，就是以科學(xué)的方法，最大限度地阻止或延緩病原菌對殺菌劑抗性的發(fā)生和抗藥病原群體的形成，延長藥劑使用周期和貨架壽命，確保田間病害化學(xué)防治的效果。因此，根據(jù)抗藥病原群體形成的主要影響因素，針對性地設(shè)計(jì)抗藥性治理策略，這是基本原則。

1) 綜合考慮所有與抗藥性發(fā)生相關(guān)的影響因子。病原菌抗藥性的產(chǎn)生和抗性群體形成是與病原菌特點(diǎn)、殺菌劑特點(diǎn)、作物抗病狀況、栽培環(huán)境、生長條件、農(nóng)事操作措施等多種內(nèi)在或人為因素綜合作用的結(jié)果。因此，抗藥性的治理應(yīng)從這些因素出發(fā)，建立藥劑、病原菌和寄主相互作用的參數(shù)，積極利用一切可人為控制的因素，阻止或延緩病原菌對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展。

2) 采取有害生物綜合治理。利用輪作、抗性品種、生物防治以及其他有利于減輕有害生物發(fā)生和危害的非化學(xué)防治措施，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。同時(shí)，重視殺菌劑的科學(xué)用藥，盡可能地降低化學(xué)藥劑對病原菌的選擇壓。

3) 產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)注抗性風(fēng)險(xiǎn)級別。在殺菌劑推廣應(yīng)用之前，進(jìn)行早期抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估，預(yù)測病原菌產(chǎn)生抗藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并在產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)注抗性風(fēng)險(xiǎn)級別。這有助于在田間出現(xiàn)實(shí)際抗藥性導(dǎo)致藥劑防效下降之前，指導(dǎo)生產(chǎn)中及早采用預(yù)防性的抗藥性治理策略。

4) 防治期間開展病原菌的抗藥性監(jiān)測。建立每一組殺菌劑和防治對象的敏感性基線和抗性監(jiān)測方法，這是抗藥性鑒別和監(jiān)測的基礎(chǔ)。根據(jù)監(jiān)測結(jié)果，明確病原菌對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展情況，在實(shí)踐中進(jìn)一步調(diào)整、補(bǔ)充和完善抗性治理策略。

7.2 抗藥性治理的短期策略

新藥劑一旦開發(fā)成功，從進(jìn)入市場前的潛在風(fēng)險(xiǎn)評估至生產(chǎn)實(shí)踐中全程應(yīng)用期間，對于中、高風(fēng)險(xiǎn)的藥劑，均應(yīng)提前采取抗性風(fēng)險(xiǎn)管理措施。同時(shí)，我國不同地區(qū)的馬鈴薯晚疫病、黃瓜霜霉病、蕃茄灰霉病、瓜類白粉病、梨黑星病和蘋果輪紋病等已對一些重要的內(nèi)吸殺菌劑，如苯并咪唑類、苯基酰胺類、二甲酰亞胺類、唑類、甲氧基丙烯酸酯類和琥珀酸脫氫酶抑制劑等產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。因此，病原菌的抗藥性治理策略也同時(shí)包括了預(yù)防性的管理策略和治療性的治理策略。

殺菌劑抗性治理的短期策略包括以下5 個(gè)方面：

1) 建立重要病原菌對常用藥劑的敏感性基線，建立有關(guān)技術(shù)資料數(shù)據(jù)庫。

2) 檢測/監(jiān)測田間重要病原菌抗藥性的發(fā)生和發(fā)展動(dòng)態(tài)，建立抗藥性病原群體流行測報(bào)系統(tǒng)，指導(dǎo)及時(shí)調(diào)整和完善抗性治理策略。

3) 了解新藥劑的作用機(jī)制和病原菌產(chǎn)生抗藥性機(jī)制，建立病原菌抗藥性的高通量分子檢測和預(yù)警技術(shù)。

4) 評估“新藥劑-新防治對象”組合產(chǎn)生抗藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)等級，及早采取合理的抗性風(fēng)險(xiǎn)管理措施。同時(shí)，應(yīng)防止試驗(yàn)中獲得的抗藥突變體被人為釋放到自然界中。

5) 科學(xué)合理用藥，降低藥劑選擇壓，延緩抗藥性發(fā)生或抗藥群體的形成，包括選擇有效的施藥劑量、控制施藥次數(shù)、選擇關(guān)鍵時(shí)期用藥，并與不同機(jī)制藥劑合理混用或輪用等。

7.3 抗藥性治理的長期策略

殺菌劑抗性治理的長期策略包括以下5 個(gè)方面：

1) 研發(fā)高活性的選擇性殺菌劑。在確保傳統(tǒng)的保護(hù)性殺菌劑有一定量的生產(chǎn)和應(yīng)用的同時(shí)，根據(jù)病原菌與藥劑非靶標(biāo)生物之間的生理生化差異，創(chuàng)制、開發(fā)和生產(chǎn)不同類型的安全、高效、?；詺⒕鷦A備更多的具有新型作用機(jī)制的高活性殺菌劑品種，有利于科學(xué)合理地安排殺菌劑的混用、輪用和交替使用。同時(shí)，隨著植物病理學(xué)和殺菌劑藥理學(xué)等領(lǐng)域科學(xué)研究的深入，還可能發(fā)現(xiàn)更多的對于病原菌生長發(fā)育和致病力具有重要作用的關(guān)鍵蛋白，可作為潛在的殺菌劑靶標(biāo)蛋白，進(jìn)一步開展以分子靶為導(dǎo)向的高活性靶向農(nóng)藥的創(chuàng)制。同時(shí)，需要更加關(guān)注植物免疫激活劑 (誘抗劑) 的研究和開發(fā)。這類藥劑雖然對病原菌沒有直接的殺菌或抑菌活性，但可以通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，提高植物的免疫能力來抵御病原菌的侵染，從而在田間表現(xiàn)出防病效果。

2) 開發(fā)具有負(fù)交互抗藥性的殺菌劑。使用具有負(fù)交互抗性的藥劑，延緩抗藥性的發(fā)展。選擇負(fù)交互抗性藥劑品種時(shí)，要有足夠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明藥劑之間具有負(fù)交互抗性。例如，對苯并咪唑類殺菌劑有負(fù)交互抗性的苯-N-氨基甲酸酯類的乙霉威目前已在全球生產(chǎn)和應(yīng)用，也成為治理抗藥性的一種有效途徑[104-105]。然而，并不是所有對多菌靈產(chǎn)生抗性的病原菌都對乙霉威敏感，在E198A、E198Q 和F200Y 共3 類抗性菌株中，僅發(fā)生E198A突變的抗性菌株對苯并咪唑類殺菌劑和乙霉威存在負(fù)交互抗性。另外，發(fā)現(xiàn)在乙霉威和多菌靈的雙重選擇壓力下，易產(chǎn)生對兩種藥劑的雙抗菌株。例如，在我國番茄灰霉病菌中已經(jīng)檢測到了既抗多菌靈又抗乙霉威的抗藥群體[106]。

3) 科學(xué)復(fù)配和輪換用藥。在全面了解殺菌劑的生物活性、作用方式、作用機(jī)制以及防治靶標(biāo)的抗性發(fā)生狀況及其抗藥性分子機(jī)制的基礎(chǔ)上，科學(xué)選用殺菌劑有效成分，研制具有延緩病原菌抗藥性的混劑配比和制劑產(chǎn)品。例如，具有多作用位點(diǎn)的保護(hù)性殺菌劑與單一作用位點(diǎn)的內(nèi)吸性殺菌劑復(fù)配，可增加殺菌劑對病原菌的作用位點(diǎn)，避免短時(shí)間內(nèi)病原菌對內(nèi)吸性殺菌劑的單一突變發(fā)生選擇性突變，而導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。另外，可以選用不同作用位點(diǎn)或抗性機(jī)制的內(nèi)吸性殺菌劑進(jìn)行復(fù)配。例如，戊唑醇和十三嗎啉均可抑制麥角甾醇生物合成并對白粉病有效，但其作用靶標(biāo)不同，戊唑醇影響14α-C 的去甲基，十三嗎啉阻止Δ8→Δ7異構(gòu)反應(yīng)，兩種有效成分復(fù)配后，既可提高防效，又有利于延緩抗藥性的發(fā)生[107]。

4) 綜合治理。提倡在病害防治中采用綜合防治措施，利用抗性品種、生物防治、生態(tài)調(diào)控等有利于減輕有害生物發(fā)生和危害的非化學(xué)防治措施，同時(shí)重視殺菌劑的科學(xué)用藥，盡可能地降低化學(xué)藥劑對病原菌的選擇壓力。

5) 回顧修正。及時(shí)總結(jié)評估抗藥性治理策略，不斷進(jìn)行完善，建立具有生產(chǎn)指導(dǎo)性的病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)管理方法和模型。

隨著高選擇性和高活性的新型殺菌劑不斷涌現(xiàn)，植物病原菌抗藥性問題也將長期存在。因此，需進(jìn)一步加強(qiáng)對新藥劑和新防治對象開展抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估，制定抗藥性管理策略，建立再評價(jià)機(jī)制。同時(shí)，提高各級農(nóng)業(yè)行政管理部門、農(nóng)藥企業(yè)、植保推廣部門及使用者等對病原菌抗藥性的認(rèn)識(shí)和密切合作，科學(xué)實(shí)施抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)管理。

謹(jǐn)以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

劉西莉，女，二級教授，博士生導(dǎo)師。1991 年畢業(yè)于北京農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系并留校工作，先后獲得中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系碩士、博士學(xué)位；2005—2006 年在丹麥哥本哈根大學(xué)植物科學(xué)系作學(xué)術(shù)訪問學(xué)者；2007—2017 年為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系教授；2017 年至今，任西北農(nóng)林科技大學(xué)國家人才發(fā)展計(jì)劃特聘教授。重點(diǎn)圍繞“植物病原菌與殺菌劑互作的理論與病害控制技術(shù)”進(jìn)行科學(xué)研究，主要研究方向：1)卵菌重要基因功能研究及藥物潛在分子靶標(biāo)發(fā)掘；2) 植物病原菌與殺菌劑互作的分子基礎(chǔ)；3)植物病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估及抗性治理；4)主要農(nóng)作物風(fēng)險(xiǎn)性種傳、土傳病害診斷和防控技術(shù)。曾先后榮獲國家“科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)” 3 項(xiàng)，發(fā)表科技論文 200 余篇，授權(quán)發(fā)明專利 37 項(xiàng)，牽頭制定了系列“殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)評估”行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。榮獲國家“萬人計(jì)劃”領(lǐng)軍人才、農(nóng)業(yè)部“農(nóng)業(yè)科研杰出人才以及創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”及科技部 “中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才等稱號?，F(xiàn)任《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)》副主編。